Krooninen sairaus

tiivistelmä

munasarjasyöpäpotilaalle (OC) voidaan käsitellä kirurgian, kemoterapiaa ja /tai sädehoito, vaikka yksikään näistä strategioista ovat erittäin tehokkaita. Useita kasvipohjaisia ​​luonnontuotteet /ravintolisiä, kuten otteita

Emblica

officinalis

(Amla), ovat osoittaneet voimakas antineoplastinen ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa määritettiin, että Amla ote (AE) on antiproliferatiivisia vaikutuksia OC soluja sekä

in vitro

ja

in vivo

olosuhteissa. Olemme myös päättäneet antiproliferatiivista vaikutukset yksi komponenteista AE, quercetin, on OC soluja

in vitro

olosuhteissa. AE ei aiheuttanut apoptoottisen solukuoleman, mutta ei merkittävästi lisätä ilmentymisen autophagic proteiinien beclin1 ja LC3B-II mukaisesti

in vitro

olosuhteissa. Quercetin myös lisääntynyt ilmentyminen autophagic proteiinien beclin1 ja LC3B-II kohdassa

in vitro

olosuhteissa. AE myös vähensi merkitsevästi ilmaus useiden angiogeenisten geenien, mukaan lukien hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF-1α) in OVCAR3 soluissa. AE toiminut synergisesti sisplatiinin vähentää solujen lisääntymistä ja lisäävät ilmentymistä autophagic proteiinien beclin1 ja LC3B-II kohdassa

in vitro

olosuhteissa. AE oli myös antiproliferatiivisia vaikutuksia ja indusoi ilmentymistä autophagic proteiinien beclin1 ja LC3B-II hiiren ksenograftikasvaimissa. Lisäksi AE vähensi endoteelisolujen antigeeni – CD31 positiivisia verisuonia ja HIF-1α ilmentyminen hiiren ksenograftikasvaimissa. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että AE estää OC solujen kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

mahdollisesti estämällä angiogeneesiä ja aktivointi autophagy OC. Täten AE voi osoittautua hyödylliseksi vaihtoehtona tai lisänä terapeuttinen lähestymistapa auttaa taistelemaan OC.

Citation: De A, De A, Papasian C, Hentges S, Banerjee S, Haque I, et al. (2013)

Emblica

officinalis

Pura indusoi Autophagy ja estää ihmisen munasarjasyöpä Cell Proliferation, Angiogeneesi, kasvu Mouse ksenograftikasvaimissa. PLoS ONE 8 (8): e72748. doi: 10,1371 /journal.pone.0072748

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2013; Julkaistu: 15 elokuu 2013

Copyright: © 2013 De et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat UMKC sisäiset rahasto ja VA Merit Award Grant (SKB, SB). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai osallistumisen käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on toiseksi yleisin gynekologinen syöpä ja on johtava syy syöpä naisten yleisin kuolinsyy Yhdysvalloissa [1]. Vuosittain noin 22000 naisia ​​Yhdysvallat diagnosoidaan OC, ja 15000 kuolemat johtuivat OC pelkästään vuonna 2011 [1]. OC on vaikea diagnosoida sen varhaisessa vaiheessa (I /II), ja ei useinkaan ole kliinisesti epäilty, kunnes se leviää ja siirtyy myöhemmissä vaiheissa (III /IV). Niinpä OC on huono ennuste, on viiden vuoden pysyvyys kaikissa vaiheissa ~ 47% [2]. Tällä hetkellä OC voidaan käsitellä kirurgian, kemoterapiaa ja säteily, jossa optimaalinen tulokset osoittavat viiden vuoden pysyvyys em. Uusien syöpälääkkeiden tai lääkkeiden yhdistelmät OC eivät ole tarjonneet merkittävää syytä olla optimistinen. Koska perinteiset syöpälääkkeet voi olla erittäin myrkyllisiä, kasviperäinen bioaktiivisia yhdisteitä tutkitaan tehokkaammin kuin vaihtoehtoiset tai lisänä hoitoja erilaisten syöpien [3]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että kasviuutteiden olla anti-kasvain /syöpälääkkeen /antiproliferatiivisia vaikutuksia viljellyissä ihmisen kasvainsolulinjoihin [4-7] ja myös antiangiogeenista vaikutusta syövän solulinjoissa [8].

amla (

emblica

officinalis

) on maustetut kasvi, joka on tunnustettu sen lääkkeiden arvo, ja sitä on käytetty antiikin ajoista lähtien Intian perinteinen järjestelmä lääketieteen ”Ayurveda” hoitoon useiden sairauksia kuten syöpää [9-11]. Hedelmä amla kasvi sisältää 11 tunnetaan lääketieteellisesti merkityksellisiä osia, kuten gallushappona, ellagiinihappo, 1-O-galloyl-beeta-D-glukoosi, 3,6-di-O-galloyl-D-glukoosi, chebulinic happo, kversetiini , chebulagic happo, corilagin, 1,6-di-O-gallolyl beeta-D glukoosia, 3-ethylgallic happoa, isostrictiniin ja askorbiinihappoa [9]. Oksat tämän kasvin sisältävät seitsemän bioaktiivisia yhdisteitä – geraniin, phyllanemblinins C ja E, prodelphinidin B1, (2) -epigallocatechin 3-O-laatti (S) -eriodictyol 7- [6-O- (E) -p-coumaroyl ] -bD-glukosidi [12]. Tästä joukosta kokoelma yhdisteitä, gallushappoa, ellagiinihappo, 1-O-galloyl-beeta-D-glukoosi, chebulinic happo, kversetiini, chebulagic happo, corilagin, askorbiinihappoa, ja geraniin ovat osoittaneet voimakas anti-syöpää aiheuttavia ominaisuuksia erikseen, ja ne voivat auttaa selittämään syövän ominaisuuksia kokonaisten amla uute (AE) [9,13]. AE on osoitettu estävän proliferaation erilaisia ​​syöpäsoluja

in vitro

, kuten OC-soluja, ja on myös osoitettu, anti-proliferatiiviset vaikutukset

in vivo

[9-11]. Äskettäin Triphala, rohdosvalmiste, joka sisältää AE, on myös osoittanut antiangiogeneettiset ominaisuuksia [8].

Koska mahdollinen arvo AE anti-syövän hoitoon, erityisesti OC, olemme tutkineet anti- proliferatiivisia ja antituumorigeenistä vaikutuksia AE munasarjojen solulinjoissa

in vitro

ja hiiren ksenograftimallissa. Olemme myös tutkineet vaikutusta AE kasvaimen angiogeneesiin viljellyissä soluissa ja hiiren ksenograftimallissa. Olemme havainneet, että AE ei aiheuttanut apoptoottisen solukuoleman, mutta ei merkittävästi lisätä ilmentymisen autophagic proteiinin kudosviljelmässä ja hiiren ksenograftimallissa. Olemme myös havainneet, että AE toiminut synergistisesti sisplatiinin vähentää solujen lisääntymistä ja lisäävät ilmentymistä beclin1 ja LC3B-II kohdassa

in vitro

olosuhteissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläimet pidettiin standardin suuntaviivojen American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Tutkimuksen hyväksyi Institutional

Animal Care ja käyttö komitea Kansas City VA Medical Center (Kansas City, MO).

Soluviljely ja reagenssit

OVCAR3, SW626 ja normaaleihin ihmisen istukan soluja (HS 799 pl) saatiin American Type Culture Collection. Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja trypsiini hankittiin Sigmalta, St. Louis, MO. OVCAR3 ja SW626-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone Laboratories, Logan, UT) ja antibiootteja 37 ° C

OC: ssa 5% CO

2 ympäristössä. Kaikki solut käytettiin tässä tutkimuksessa olivat 10 kohtia kuluessa tai talteenotto (~ 2 ja 1/2 kuukauden viljelyn). AE hoidon valmistettiin kaupallisesti saatavilla tabletteina (Himalaya, USA, Houston, TX, joka sisälsi 250 mg amla hedelmien ja 350 mg amla varren jauhe). Kantaliuos AE valmistettiin punnitsemalla Amla tabletit, hionta niitä, ja liuottamalla jauhe endotoksiinittomassa steriiliin veteen 10 mg /ml. Liuos suodatettiin 0,02 um selluloosa-asetaatti kalvo ja käyttää hoitamaan viljelmän eri pitoisuuksina.

hoito

10000 OVCAR3 tai SW626-soluja maljattiin yksittäisiin kuoppiin 24-kuoppalevyille 1 ml: ssa alustaa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, ja niitä inkuboitiin 37

OC 24 tuntia ennen kokeiden. Ensimmäisen päällystyksen jälkeen, väliaine korvattiin 1 ml: lla DMEM: ää, joka sisälsi seerumia (10%) ja AE (0-400 ug /ml; kolmena kappaleena) eri ajankohtina (6-96 h) 37

OC.

in vitro

ohjaus (0 ug /ml AE) sai ajoneuvo (vesi), jonka tilavuus on yhtä suuri kuin korkein pitoisuus AE käytetty. Meillä on myös käsitelty OVCAR3 soluja eri annoksilla kersetiiniä (5-100 ug /ml; neljänä) eri ajankohtina (6-96 h) 37

OC.

in vitro

ohjaus (0 ug /ml quercetin) saivat vehikkeliä (DMSO; 4 ui, joka vastaa tilavuutta 100 ug /ml quercetin).

Solujen proliferaatio

Solujen proliferaatio arvioitiin käyttämällä [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi)] (MTT) määritykset kuten aiemmin on kuvattu [14], jossa muutokset [15]. OVCAR3 ja SW626-soluja kasvatettiin 24-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät DMEM ja 10% FBS: ää. Hoidon jälkeen, MTT: tä (0,1 mg /kuoppa) lisättiin soluihin ja sen jälkeen inkuboitiin 4 tunnin ajan 37

OC. Formatsaanikitei- muodostuneet kiteet liuotettiin inkuboimalla soluja 1 ml: lla isopropyylialkoholia, joka liuotetaan sininen formazon tuote, joka tapahtui inkuboinnin aikana MTT. Optinen tiheys mitattiin 560 nm spektrofotometrissä. Määrä funktionaalisesti aktiivisten solujen (eli optisen tiheyden arvot) laskettiin vertailut kontrollin ja käsiteltyjen välillä ryhmiä.

DNA: n fragmentoituminen

DNA valmistettiin käsitellyn ja käsittelemättömän kulttuureissa, kuten aiemmin on kuvattu [16 ]. Lyhyesti, käsittelyn jälkeen solut hajotettiin 100 pl: aan lyysipuskuria (100 mM Tris, pH 8,0, 20 mM EDTA, 0,5% SDS), käsiteltiin 50 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi 37

OC: ssa 30 minuuttia ja 100 ug /ml proteinaasi K: ssa 2 tuntia 50

OC. DNA uutettiin fenoli-kloroformilla ja kloroformilla ja saostettiin 3 tilavuudella etanolia. DNA (1 ug /kaista) ajettiin elektroforeesilla 1% agaroosigeeleillä. Molekyylipainostandardeja ajettiin samanaikaisesti. Geelit värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin käyttäen Chemidox (BioRad, Hercules, CA).

RNA uuttaminen

Kokonais-RNA uutettiin OVCAR3 soluista käyttäen Trizol uutolla. mRNA määrän ja laadun määritettiin mittaamalla sen absorbanssi Genesys 6 Skannaus UV /VIS pyyhkäisyspektrofotometrillä ja myös käyttämällä RNA Experion® siru (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Gene Array

Differential ilmaus angiogeneesin sääntelyn geenien analysoitiin Oligo GEArray valmistajan toimittamat (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, USA). Lyhyesti, 3 ug kokonais-RNA käänteiskopioitiin biotiini-16-dUTP-leimattuja cDNA-koettimia kanssa TrueLabeling-AMP-menetelmällä käyttäen 16 ui 2,5 x RNA-polymeraasia, 2 ui 10 mM biotinyloitua UTP, RNA Polymerase 2 ui. SuperArray kalvot (TTT-026) esi-hybridisoitiin 60

OC: ssa 2 tuntia. Hybridisaatio Biotiini-leimatun cDNA-koettimet kalvoihin suoritettiin 60

OC: ssa yön yli sekoittaen hitaasti. Hybridisoitu kalvot pestiin suolaliuoksella natriumsitraattipuskurissa (kerran 2 x SSC, 1% SCS ja kerran 0,1 x SSC, 0,5% SDS). Membraanit inkuboitiin alkalisella fosfataasilla konjugoitua streptavidiinia, kanssa ja sitten kemiluminesenssisubstraatilla CDP-Star. Kuvia kalvot hankittiin käyttäen Chemidoc XRS järjestelmä (BioRad) ja aineistot vietiin GEArray Analyzer, ohjelmisto kehittämä SA Bioscience ja analysoidaan. Suhteellinen ilmentymistaso kunkin geenin määritettiin vertaamalla signaalin voimakkuutta kunkin geenin array korjauksen jälkeen tausta ja normalisointi.

In vivo kasvaimen tutkimuksissa

Kahdeksan viikon ikäisiä nude-hiiriin (nu /nu-genotyyppi, Harlan Laboratories (Madison, WI) ylläpidettiin vedellä ja ruoka

mieltymyksen

vuonna taudinaiheuttaja ympäristössä, jossa on 12 tunnin valoisa ja 12 tunnin pimeä jakso eläimessä hoitolaitoksessa at Kansas City VA Medical Center. eläinten hoito ja kokeellisia toimenpiteitä tehtiin noudattaen hyväksyttyjä suuntaviivat Animal Care ja käyttö komitean Kansas City VA Medical Center. OVCAR3 soluja (5×10

4), jossa matrigeelin injektoitiin ihonalaisesti oikeaan taka kylkeen jokaisen hiiren (4-5 hiirtä per ryhmä). kasvaimen kasvua seurattiin sen jälkeen, kun 2

toinen päivä injektion ja jatkui jopa 24 päivää. kasvaimen pituus ja leveys mitattiin käyttäen paksuus ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa : kasvaimen tilavuus = pituus x leveys x 0,5 leveys.

Kuusi päivää injektion jälkeen hiiret syötettiin suun kautta 10% sakkaroosia (kontrolli) tai 10% sakkaroosia AE (100 mg /kg kehon paino.) päivittäin. Annos 100 mg /kg valittiin perustuen esitutkimus, jossa tämä annos osoitti optimaalinen vaikutus tuumorikasvun estoon. Sen jälkeen, kun 18 päivää AE hoidon jälkeen hiiret tapettiin ja kasvaimet poistettiin ja kiinnitettiin 4% puskuroidussa formaldehydiä lisätutkimuksia varten.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin 4% formaliiniin-parafiiniin upotettuja kudosnäytteiden mukaan edellisessä menetelmiä [17,18]. Lyhyesti, kudosleikkeet kiinnitettiin 4% puskuroidussa formaldehydiä ja parafiini ksyleenillä, vedettömät alenevassa pitoisuuksia alkoholia, pestiin PBS: llä ja blokattiin esto seerumin (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) 20 minuutin ajan. Leikkeet inkuboitiin beclin1, LC3B-II (Cell Signaling, Boston, MA), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) tai Hif-1α (Novus Biologicals, Littleton CO) vasta-aine (1: 500 kaikki vasta-aineet) yön yli kosteassa kammiossa 4

OC. Immunoreaktiivisuuden havaittiin käyttäen toissijainen vasta konjugoitu streptavidiini (Immpress-Vector Laboratories) ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Leikkeet kuvattiin Leica digitaalinen valomikroskooppia. Kvantitoimiseksi mikrosuonten, kudosleikkeiden analysoitiin 50X suurennoksella ja CD31-positiivisia suonia laskettiin. Neljällä kustakin 3 Kustakin kasvaimen analysoitiin.

OVCAR3 solut kiinnitettiin 4% puskuroidussa formaldehydiä ja pestiin PBS: ssä. Blokattiin estää seerumia, solut inkuboitiin beclin1, LC3B-II tai Hif-1α (1: 200) vasta-aineen yli yön 4

OC. Solut pestiin ja immunoreaktiivisuus havaittiin, kuten on kuvattu edellä. Määrän immuno- solujen ja solujen kokonaismäärä laskettiin ja solujen prosenttiosuus, joilla immunoleimaus laskettiin.

Western blot

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, proteiini uutettiin joko OVCAR3, SW626-solujen tai kasvainten ja proteiinipitoisuus mitattiin BCA-proteiinimäärityksellä menetelmällä (Pierce, Rockford, IL). Jokainen näyte (50 ug) ajettiin SDS-natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelillä. Proteiini siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvo inkuboitiin estää seerumin (Thermoscientific, Pittsburgh, PA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen inkuboimalla yön yli 4

OC vasta-aineen kanssa Bax, Bcl2, kaspaasi 3, pilkottiin kaspaasi 3, kaspaasi 7, beclin1 tai LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) tai Hif-1α (1: 1000, Abcam). Kun oli pesty Tris-NaCl-Tween 20-puskurilla, kalvo inkuboitiin toissijaisen vasta-aineilla (1: 10000, Abcam) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (Thermoscientic).

Tilastollinen analyysi

Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kussakin kokeessa toistettiin kahdesti. Kaikki graafiset tiedot näkyvät keskiarvona + SEM Merkittävyys testattiin parittomia, kaksisuuntainen Studentin t-testit, joissa varianssi on erisuuruinen (Microsoft Excel, Redmond, WA).

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

AE estää OVCAR3 ja SW626-solujen lisääntymistä

Voit selvittää AE voi vaikuttaa solujen lisääntymistä, testasimme sen vaikutusta kolmella eri solulinjoilla : 1) munasarjasyöpäsolujen (OVCAR3), 2) ensisijainen adenokarsinooma metastasized munasarjan (SW626), 3), normaali ihmisen istukan soluja (HS 799). Normaali istukan soluja käytetään määrittämään, onko AE on mitään vaikutusta ei-neoplastisia soluja. Lisäksi käytimme SW626-solujen onko AE kykenee estämään kasvaimia, jotka oli etäpesäkkeitä muilta sivustoja munasarja, ja onko vaikutuksia AE on OVCAR3 olisivat päällekkäisiä muiden syöpäsoluja. OVCAR3 soluja käsiteltiin vaihtelevilla AE (0-1000 ug /ml) 24 tunnin ajan ja suhteellinen solujen lukumäärä oli päätelty käyttäen MTT-määrityksissä. Alhaiset pitoisuudet (10-200 mikrog /ml) AE ei vaikuttanut solujen lisääntymistä; kuitenkin, solujen lisääntyminen estyi merkittävästi AE pitoisuuksina 300-1000 ug /ml (kuvio 1A). Käsittelimme normaalin istukan soluista (HS 799 pl) eri annoksilla (100-500 ug /ml) AE 48 tunnin onko AE oli yleensä sytotoksinen, ja määritetään, että AE ollut olennaisesti mitään vaikutusta solujen eloonjääminen missä tahansa pitoisuuksien testattu (kuvio 1 B). Käsittelimme sekä OVCAR3 ja SW626-soluja viljelmässä kasvavien pitoisuuksien kanssa AE eri aikoja ennen suorittamista MTT määrityksissä. Nopea menetys solujen proliferaatiota esiintyi kasvavilla pitoisuuksilla AE sekä OVCAR3 ja SW626-soluja (kuvio 1A, 1C, 1D). Molemmissa solulinjoissa soluproliferaation inhibointi indusoi AE oli riippuvainen sekä pitoisuudesta että inkubaatioaika (kuvio 1C, 1D). Pienin pitoisuus AE testattu (100 ug /ml) aiheutti merkitsevän eston (p = 0,001) OVCAR3 solujen 72 tunnin, ja suurimmalla annoksella (400 ug /ml) esti voimakkaasti (p = 0,007) kasvua OVCAR3 soluissa 12 tunnin (kuvio 1 C). Vuonna SW626-soluissa, AE 100 ug /ml aikaan merkitsevän eston 48 tunnin (p = 0,001), ja suurimmalla annoksella kasvu estyi (p = 0,001) 6 tuntia (kuvio 1 D).

. Annoksesta riippuva vaikutus AE proliferaatioon OVCAR3 soluja. B. Annos riippuvainen vaikutus AE solukuolemaan normaaleissa istukan soluissa (HS-799 pl). CD. Aika ja annos riippuvat vaikutukset AE jakautumiseen OVCAR3 (C) ja SW626 (D) soluja. E. Annos riippuvaista vaikutusta quercetin proliferaatioon OVCAR3 soluja. OVCAR3 ja SW626-soluja viljeltiin ja kasvatettiin 2 päivää DMEM, kun läsnä on 10% seerumia, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Tämän jakson jälkeen viljelmät syötettiin joka sisälsi 10% seerumia ja eri annoksilla AE 24 tuntia paitsi aikariippuvainen tutkimus. Tiedot ovat keskiarvo + SEM 6 riippumattomia havaintoja. *, P 0,05, poikkeavat merkittävästi vehikkelillä käsitellyssä kontrolliryhmässä.

Quercetin estää soluproliferaatiota OVCAR3 soluissa

Määriteltyään AE ja ajasta riippuen vähensi solujen lisääntymistä in OVCAR3 soluissa, me testasimme, onko hoito OC-solujen eri annoksilla (0-100 ug /ml), kversetiinin – yksi komponenteista AE– voitaisiin vähentää soluproliferaatiota OVCAR3 soluissa. Pienin pitoisuus, kversetiini testattu (5 ug /ml) aiheutti merkittävän inhibition (p = 0,01) ja OVCAR3 solujen 48 tunnin ajan, ja suurimmalla annoksella (100 ug /ml) esti (p = 0,005) kasvua OVCAR3 soluissa 24 tunnin (kuvio 1 E).

AE muuttaa morfologian OVCAR3 ja SW626-solut

inhibitio leviämisen voi muuttaa koko ja morfologia yksittäisten solujen [20]. Siksi olemme huolellisesti morfologian OVCAR3 ja SW626-solujen hoidon jälkeen 0-300 ug /ml AE. Morfologia OVCAR3 soluja käsiteltiin 100 ja 200 ug /ml AE oli mahdoton erottaa käsittelemättömiin soluihin sen jälkeen, kun 24 tunnin (kuvio 2 A-C), kun taas käsittely 300 ug /ml 24 tunnin aiheutti solujen pääosan tulee pyöreä ( Kuvio 2D). AE myös indusoi annosriippuvaisen muutoksia morfologia SW626-solujen 24 tunnin (kuvio 2E-H). Lähempi tarkastelu paljasti, että hoito 300 ug /ml AE 24 tuntia indusoidun sytoplasman vakuoleihin sekä OVCAR3 ja SW626-solut (kuviot 2J, 2 N, 2L, 2P). Nämä morfologisia muutoksia viittaavat siihen, että solukuolema voidaan esiintyviä koska solukuolemaan liittyy joskus vacuole muodostumisen [21]. Lisäkokeita suoritettiin käyttäen 300 ug /ml: n konsentraation AE.

A-D. Annoksesta riippuva vaikutus AE morfologiaan ja solujen tiheys OVCAR3: A = Ohjaus, B = 100 ug /ml AE, C = 200 ug /ml AE, D = 300 ug /ml AE. E-H. Annoksesta riippuva vaikutus AE morfologiaan ja solutiheyteen SW626 soluja. E = Control F = 100 ug /ml AE, G = 200 ug /ml AE, H = 300 ug /ml AE. I-J, M-N. AE lisääntynyt soluliman vakuoleja in OVCAR3. I ja M = Ohjaus, J ja N = 300 ug /ml AE. K-L ja O-P. AE lisääntynyt soluliman vakuoleja in SW626. K ja O = ohjaus, L ja P = 300 ug /ml AE. OVCAR3 ja SW626-soluja viljeltiin ja kasvatettiin 2 päivää DMEM, kun läsnä on 10% seerumia, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Tämän jälkeen viljelmiä ruokittiin väliaineella 10% seerumia ja eri annoksilla AE 24 tuntia. Osa onteloita on merkitty nuolilla (N, P). Bar = 50 um.

AE ei aiheuta apoptoottista solukuolemaa OVCAR3 ja SW626-solut

Koska morfologisia muutoksia edellä on kuvattu, viittaa siihen, että hoito OC solulinjojen 300 ug /ml AE solukuolema, halusimme onko AE indusoi apoptoosia näistä solulinjoista. Käytimme kaksi erilaista lähestymistapaa tutkia tätä mahdollisuutta: 1) tutkiminen DNA internukleosomaalisen pirstoutuminen, tunnusmerkki apoptoottisen solukuoleman, ja; 2) Western blotting tiettyjen proteiinien (esim. Bax, Bcl

2, kaspaasi 3, pilkotaan kaspaasi 3 ja kaspaasi 7) mukana apoptoottisen reitin. Sen määrittämiseksi, onko AE aiheuttama DNA internukleosomaalisen pirstoutuminen, DNA valmistettiin ohjaus ja AE-käsitellyissä viljelmissä fraktioitiin 1% agaroosigeeleillä 24 ja 96 tuntia lisäämisen jälkeen AE (300 ug /ml). Vaikka DNA hajoamista havaittiin näissä valmisteissa, ei ollut ilmeistä, DNA: n fragmentoituminen jopa 96 tuntia hoidon jälkeen (kuvio 3A-B), mikä viittaa siihen, että solukuolema ei tapahtunut apoptoosin. Tutkimaan edelleen mahdollista roolia apoptoottisen reittejä kuolemaan AE käsiteltyjä soluja, Western blotit Bax, Bcl

2, kaspaasi 3, pilkotaan kaspaasi 3 ja kaspaasi 7 tehtiin. Vuonna OVCAR3 soluissa, AE hoito vähensi ilmaus Bax, Bcl

2 ja halkaistut kaspaasi 3 (kuvio 3C, 3E ja 3I), eikä muuttunut ilmaus kaspaasi 3 tai kaspaasi 7 proteiineja (kuvio 3G ja 3K). Vuonna SW626-soluja, AE hoito ei muuta ilmaus bax, bcl

2, caspase3 tai caspase7 (kuviot 3D, 3F, 3H ja 3L) ja vähentää ilmentymistä katkaistun kaspaasi 3 (kuvio 3J). Yhdessä tulokset tukevat päätelmää, että apopotic reittejä ei ole otettu käyttöön AE käsitelty OC solulinjoissa.

A-B. Edustavia valokuvia DNA pirstoutuminen OVCAR3 soluissa (A) ja SW626-soluja (B). OVCAR3 ja SW626-soluja käsiteltiin 300 ug /ml AE, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Käsittelyn jälkeen DNA uutettiin ja elektroforeesi 1% agaroosigeelillä. Koko on emäsparia molekyylipainomerkkiaineiden (lane) on merkitty rinnalla geelissä. Numero oikealla puolella ilmaisee pituus nukleotidia useita bändejä. C24 = Ohjaus 24 tuntia, C96 = Ohjaus 96 tuntia, T24 = AE 24 tunnin hoito, T96 = AE 96 tunnin hoito, + C = positiivinen kontrolli, S = DNA koko standardia. C-L. Expressions apoptoottisten proteiinien jälkeen AE hoidon (300 ug /ml) OVCAR3 ja SW626-soluissa. Edustaja valokuvia Western blot Bax (C, D), Bcl

2 (E, F), kaspaasi 3 (G, H), pilkottiin kaspaasi 3 (I, J), kaspaasi 7 (K, L) on OVCAR3 (C, E, G, I, K) ja SW626 (D, F, H, J, L-solut) jälkeen AE hoidon näkyvät yläosassa. β-aktiini havaittiin kontrollina jokaiselle blot. Histogrammin vastaavat jokaista valokuva edustaa suhdetta densitometrisen analyysin kunkin kaistan vastaaviin β-aktiini band. Viljelmä käsiteltiin 0 tai 300 ug /ml AE 24 tunnin ajan. Hoidon jälkeen, proteiinin OVCAR3 ja SW626-solut uutettiin ja 30 ug proteiineja, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE. Proteiini siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja immunoblotattiin apoptoosia vastaan, jotka liittyvät vasta-aineet – Bax: n, Bcl

2, Caspase 3, pilkottiin kaspaasi 3 tai kaspaasi 7. arvot ovat keskiarvoja + S.E.M. 4 erillisen kokeen. *, P 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.

AE indusoi autophagy vuonna OVCAR3 ja SW626-solujen

Uusi

in vivo

ja

in vitro

näyttöä siitä, että useat syöpälääkkeiden niiden vaikutukset, ainakin osittain, kautta niiden vaikutukset autophagy [22,23]. Tutkimukset Edellä ehdotettiin, että apopotic reittejä ei aktivoitu AE hoito, joten päätimme selvittää autophagy aktivoitiin AE käsitelty OC soluja. Tarkemmin sanottuna käsiteltiin OVCAR3 ja SW626-solujen AE määrittämiseksi vaikutuksia ekspressioon autophagic proteins- beclin1 ja LC3B-II käyttäen immunosytokemian ja immunoblottauksella tekniikoita. Immunoreaktiivisuus sekä beclin1 ja LC3B-II oli läsnä käsittelemättömissä OVCAR3 ja SW626-soluissa (kuvio 4 A, B, E, F). Intensiteetti immunovärjäyksen ja lukumäärä immunopositiivista solujen kuitenkin nostettiin AE käsittely [Kuva 4 A-H]. Western blot-analyysi oli yhtäpitävä tulosten immunovärjäyksen, jotka osoittavat, että AE käsittely lisäsi ekspressiota beclin1 ja LC3B-II sekä OVCAR3 ja SW626-soluja (kuvio 4 I-P). Nämä tiedot viittaavat siihen, että autophagy aktivoituu AE käsitellyissä soluissa. Tutkimme myös ilmentymisen autophagic proteiinien beclin1 ja LC3B-II jälkeen kversetiini hoidon (5 ug /ml 48 tunnin ajan) on OVCAR3 soluihin käyttäen immunoblottauksella. Expression of beclin1 ja LC3B-II oli merkitsevästi suurempi kversetiini käsitellyissä soluissa kuin kontrolli (kuvio 4 Q-T).

immunovärjäys beclin1 ja LC3B-II OVCAR3 ja SW626 kontrollisolujen ja jälkeen käsiteltiin 300 ug: /ml AE (A, B, E ja F). Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden beclin1 (C ja D) ja LC3B-II (G ja H) immunopositiivista solujen prosenttiosuutena kaikista soluista. OVCAR3 ja SW626-soluja viljeltiin ja kasvatettiin 2 päivää DMEM: n läsnä ollessa 10% seerumia, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Tämän jälkeen viljelmiä ruokittiin väliaineella, joka sisälsi 10% seerumia ja AE 24 tuntia. Solut valokuvattiin 400 x suurennoksella. Expression of beclin1 yhteensä proteiinin OVCAR3 (I) ja SW626 (J) soluihin ja ekspressiota LC3B-II yhteensä proteiinin OVCAR3 (M) ja SW626 (N) soluissa, sen jälkeen hoidetaan AE (300 ug /ml) 24 tuntia. Edustavia valokuva Western blot varten beclin1 ja LC3B-II näkyvät yläosassa. β-aktiini havaittiin kontrollina kussakin blot. Mean + S.E.M. arvot densitometristä suhde beclin1 (K ja L) ja LC3B-II (O, P), jossa β-aktiini on esitetty alaosassa kunkin vastaavan geeliä. Q-T: Kversetiini hoito (5 ug /ml 48 tunnin ajan) indusoi ilmentymisen beclin1 (Q, R) ja LC3B-II (S, T) OVCAR3 soluissa. Hoidon jälkeen, proteiinin OVCAR3 ja SW626-solut uutettiin ja 50 ug proteiineja, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE. Proteiini siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja immunoblotattiin vastaan ​​beclin1 ja LC3B-II-vasta-aineita. Sen jälkeen immunodetektioon, beclin1 ja LC3B-II positiiviset nauhat mitattiin densitometrisesti ja normalisoitu β-aktiini-arvot. Arvot ovat keskiarvoja + S.E.M. 6 itsenäisen kokeen. *, P 0,05, verrattuna kontrolliryhmään. Bar = 50 pm.

AE estää angiogeneesin liittyvien geenien OVCAR3 soluissa

Kun otetaan huomioon, että kasvava kasvain massa on luotava verisuoni tarjontaa, ja viimeaikaiset raportit että angiogeneesi voitiin estää rohdosvalmisteet, jotka sisältyvät AE [8], halusimme selvittää AE voi estää angiogeneesiä

in vitro

. Erityisesti tutkittiin vaikutusta AE hoidon ilmentymistä angiogeenisten geenien AE-käsiteltyjen (300 ug /ml) ja käsittelemättömien OVCAR3 soluihin käyttäen ihmisen angiogeenisen OligoGE Array, joka tunnistaa 112 geenejä erityisesti angiogeneesiin liittyvien (SA Bioscience Corporation). Kokeet suoritettiin kolmessa riippumattomia tutkimuksia, ja tulokset on esitetty kuviossa 5 A-D. Monet geenit (vihreä

*) ekspressoitiin alennetussa tasoilla AE-käsiteltyjä soluja verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvio 5B). Clustergram kuvaa saatuja tuloksia kontrolli- ja AE-käsitellyissä viljelmissä on esitetty kuviossa 5C. Ilmentymisen COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL1B, PDGFB, TNFRSF12A ja HIF-1α oli laskenut alle 40% valvonnan tasolla (kuvio 5D), joissa Hif-1α inhiboivat suuressa määrin.

. Edustaja valokuvia mikro array kontrollista ja AE-käsitelty kulttuuri. Viljelmää käsiteltiin 0 tai 300 ug /ml AE 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen RNA eristettiin käyttäen Trizol louhintamenetelmää. Superarray kalvot hybridisoitiin biotiinilla leimatun cDNA, inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua streptavidiinia, geenin ilmentymistä havaittiin kanssa kemiluminesenssisubstraatilla CDP-Star. B. Edustavia scatterplot AE saaneista vs kontrolli soluviljelmissä. Monet geenit (vihreä

*) ovat alle ilmaistaan ​​AE-hoidetussa ryhmässä. C. Vasen paneeli: Heat kartta (clustergram) valvonta- ja AE-käsitellyissä viljelmissä. Yhdeksän geenit, jotka pienenevät enemmän kuin 70%, on merkitty nuolenpäät oikealla puolella lämpöä kartan. Middle paneeli: Laajentuneen lämpö kartan alennettu ilmentyminen Hif-1α AE-hoidetussa ryhmässä. Oikea paneeli: suuruus geenin ilmentymisen. D. graafinen esitys suhteellisen geeniekspression avulla globaali tausta ja GAPDH referenssinä geeni ja muunnetaan kertamuutosta arvot (AE vastaan ​​kontrolli).

AE estää ilmentymistä HIF-1α in vitro

edellä kokeissa olemme osoittaneet, että AE hoito tukahdutti ilmentymistä lukuisia geenejä, jotka liittyvät angiogeneesiin. Sen määrittämiseksi, onko vähentynyt geenin ilmentyminen vastasi vähentynyt proteiini tasolle, me nimenomaan tutkittiin, mikä vaikutus AE hoidon tuotantoa Hif-1α proteiinin OVCAR3 soluissa käyttäen immunosytokemian ja Länsi-blotit. Sekä immunosolukemiallinen ja Western blot tulokset osoittivat vähensi merkitsevästi ilmaus Hif-1α in OVCAR3 soluviljelmissä (kuva 6 A-B), mikä edelleen tukee käsitettä, että AE hoito estää angiogeneesiä.

. Mikrovalokuva, joka esittää alennettu ilmentyminen Hif-1α immunostatining in OVCAR3 soluissa jälkeen AE hoidon. Histogrammi näyttää prosentteina Hif-1α immunopositiivista soluja verrattuna koko soluihin. OVCAR3 soluja viljeltiin ja kasvatettiin ja käsiteltiin 0 tai 300 ug /ml AE 24 tuntia. Solut immunovärjättiin Hif-1α-vasta ja valokuvannut 400X suurennuksella. Bar = 50 pm. Arvot ovat keskiarvoja + S.E.M. 4 erillisen kokeen. *, P 0,05, verrattuna kontrolliryhmään. B. edustava valokuva Western blot varten Hif-1α näkyy yläosassa. β-aktiini havaittiin kontrollina jokaiselle blot. Mean + S.E.M. arvot densitometristä suhde Hif-1α ja β-aktiini on esitetty alaosassa geelin. Sen jälkeen immunodetektioon volyymi Hif-1α positiivinen bändejä mitattiin densitometrisesti ja normalisoitu β-aktiini-arvot. Arvot ovat keskiarvoja + S.E.M. 4 erillisen kokeen. *, P 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.