Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka on reseptori tyrosiinikinaasin, joka edistää solujen lisääntymistä ja eloonjääminen, on poikkeuksellisen yli-ilmentynyt useissa on epiteelialkuperää olevia tuumoreita, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC). EGFR monoklonaalisia vasta-aineita on osoitettu lisäävän mediaanielinajassa ja on hyväksytty kolorektaalisyövän hoitoon. Histonideasetylaaseja (HDAC: t), usein yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä ja useita pahanlaatuisia kasvaimia, ovat toinen houkuttelevia kohteita syövän hoidossa. Useat inhibiittorit HDAC: ien (HDACi) kehitetään ja näytteille voimakas antitumor kykyjä. Tässä tutkimuksessa ihmisen peräsuolen syöpäsoluja käsitellään HDACi oli vähemmän EGFR, siten häiriintynyt EGF aiheuttama ERK ja Akt-fosforylaation. HDACi vähensi myös ilmaus SGLT1, aktiivisen glukoositransportterin todettu stabiloida EGFR, ja tukahdutti glukoosin ottoa syöpäsoluja. HDACi tukahdutti transkription EGFR ja luokan I HDAC oli osoittautunut olla mukana tässä tapauksessa. Kromatiinin immunosaostus analyysi osoitti, että HDACi aiheuttivat dissosiaatiota SP1, HDAC3 ja CBP EGFR promoottori. Meidän tiedot osoittivat, että HDACi voisi toimia yksinään estää sekä EGFR ja HDAC, ja ne voivat tuoda lisää etuja kehittämiseen CRC terapia.

Citation: Chou CW, Wu MS, Huang WC, Chen CC ( 2011) HDAC esto Vähentää ilmentyminen EGFR peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 6 (3): e18087. doi: 10,1371 /journal.pone.0018087

Editor: Chris Chan, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 23 elokuu 2010; Hyväksytty: 24 helmikuu 2011; Julkaistu 25 maaliskuuta 2011

Copyright: © 2011 Chou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimus avustusta National Science neuvoston Taiwanin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

EGFR (tunnetaan myös ErbB-1 /HER1), joka kuuluu ErbB perheen reseptorityrosiinikinaasit, käsittää ekstrasellulaarisen ligandia sitovan domeenin, yhden hydrofobisen transmembraanidomeenin ja sytoplasmisen tyrosiinikinaasin sisältävää domain [1]. Ligandin sitoutuminen indusoi homo- tai hetero- dimerisaatio reseptorin ja sen jälkeen aktivointi reittejä, mukaan lukien Ras /Raf /MEK /ERK ja PI3K /PDK1 /Akt [1]. Useimmat peräsuolen syöpä (CRC) on ominaista yliekspressio epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja ennustettu korkea riski etäpesäke ja toistumisen [2]. Kohdistaminen EGFR näyttää olevan lupaava lähestymistapa CRC hoitoon. Todellakin, setuksimabi, ihmisen-hiiren kimeerinen IgG1-vasta-aine sitoutuu ulkoisen toimialueen EGFR, on hyväksynyt FDA vuonna 2004 metastaattisen kolorektaalisyövän [3]. Sen jälkeen, täysin humanisoitua vasta-ainetta, panitumumabi, on myös hyväksytty hoitoon CRC [4]. Kuitenkin, varaamiseen todisteet osoittavat, että vaikutukset kohdistuvat EGFR kolorektaalisyövässä pitkälti rajoitettu, koska tilan KRAS-mutaatio [5]. KRAS mutantit ohittaa EGFR aktivoida Ras /Raf /MEK /ERK signaaleja, ja heikentää merkittävästi terapeuttista vaikutusta setuksimabin [6]. Tutkiminen KRAS tila on nyt käytön edellytyksenä setuksimabin [7]. Vaikka -60% CRC potilaista ilmaisi villin tyypin KRAS mutta vain puolet niistä hyötyy setuksimabi. Siksi KRAS tila ei ole ainoa määräävä tekijä tehoa EGFR tavoite hoidon [8]. Näin ollen, käsittelemällä laaja geneettinen tausta on ehdottoman välttämätön hyötyisivät useimmat potilaat irresponsive setuksimabista hoidoissa.

Vaikka EGFR on reseptorityrosiinikinaasia ja tuottaa signaaleja sen jälkeen, kun ligandin konjugaation, sen prosurvival vaikutus voi olla riippumaton kinaasiaktiivisuutta. Esimerkiksi hiiret puuttuu EGFR ovat alkion tappava, mutta ne suojelevat kinaasi-aktiivinen mutantit vain osoittaa tiettyä epiteeli [9], [10]. Lisäksi menetys EGFR-kinaasiaktiivisuuden hidastaa solujen proliferaiton mutta menetys sen ilmaisun pilaa glukoosin otto ja johtaa solukuolemaan [11] – [13]. Näin ollen, EGFR: n ilmentyminen olla parempi strategia CRC terapiassa.

histonideasetylaaseja (HDAC: t), joka poistaa asetyyli- ryhmät histoni vaientaa geenitranskription ovat erittäin ilmaistaan ​​erilaisten kasvainten [14], [15 ]. HDAC tullut yksi kehittyvien tavoitteiden syöpähoidon, ja HDAC-inhibiittorit (HDACi) lupaavia syövänvastaisia ​​toimintaa [15]. Joukossa eri HDACi, SAHA (Vorinostat) oli onnistuneesti hyväksytty hoitoon ihon T-solujen lymfooma (CTCL). HDAC perhe voidaan jakaa neljään luokkaan ja luokan I HDAC: ien, joka sisältää HDAC1, HDAC2, HDAC3 ja HDAC8, on raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​paksusuolensyöpä [16]. Pro-proliferatiivisia vaikutuksia HDAC on liitetty transkription repression cdk-inhibiittoria, p21, ja pudotus HDAC 1, 2 ja 3 vähensi kasvua useiden koolonkarsinoomasoluissa [17]. Siksi HDAC voi toimia mahdollisena kohteena CRC hoitoa, ja SAHA oli tullut kliinisissä kokeissa hoitoon CRC [18].

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että EGR signalointi KRAS mutantti solulinjoissa, HCT116 ja SW480, hajotettiin HDACi läpi transkription tukahduttaminen EGFR, mikä osoittaa, että HDACi toimi yksinään estää EGFR ja HDAC samanaikaisesti. Menetys EGFR osittain osaltaan sytotoksista vaikutusta HDAC-inhibiittoreita. Lisäksi ilmaus SGLT1, aktiivisen glukoosin kuljettajaa, joka stabiloidaan EGFR, myös laski HDACi ja johti vähentää glukoosin sisäänottoa paksusuolen syöpäsoluja. Mekanismi taustalla transkription tukahduttaminen EGFR mukaan HDACi oli mukana histonien hypoacetylation ja dissosiaatiota SP1, HDAC3 ja CBP EGFR promoottori. Meidän tiedot osoittivat, että HDACi voisi toimia yhtenä aineena samanaikaisesti estää sekä EGFR ja HDAC, ja se voi hyödyttää CRC potilaille, joilla on laajempi valikoima geneettisiä taustoja.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Kaikki potilaasta johdettujen näytteet kerättiin ja arkistoidaan protokollien hyväksymien Institutional Research Board of National Taiwan University Hospital ja tukee National Science Council, Taiwan. Täydellinen sanallinen selvitys tutkimuksen annettiin kaikille osallistujille. He suostuivat osallistumaan vapaaehtoisesti.

Materiaalit

TSA ostettiin Sigma ja SAHA saatiin Merck. Myc-merkityn HDAC1, 2 ja 3 saatiin Dr. WM Yang (Nchu, Taiwan). Spesifisiä vasta-aineita EGFR, p21, HDAC3, ja aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Anti-Ac-histoni H3, H4, ja SP1 vasta saatiin Upstate. Anti-SGLT1-vasta-aine hankittiin Abcam.

Soluviljely

HCT-116 (Van Dyke MW, MD Anderson) ja SW480 (TH Leu, NCKU) ihmisen koolonkarsinoomasoluja viljeltiin DMEM, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia; A431 (ihmisen epidermoidikarsinooma solut) ja MDA-MB-468 (ihmisen rinta- adenokarsinooma-solut) saatiin ATCC: stä, pidettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FCS: ää.

RNA: n eristys, RT-PCR ja reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA eristettiin HCT116 solusta käyttämällä Trizol reagenssia (Life Technology). Käänteiskopiointireaktio suoritettiin käyttämällä 2 ug kokonais-RNA: ta, käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen oligo-dT-aluketta. cDNA tehtiin RT-PCR: llä ja monistettu 30 syklin ajan käyttäen kahta oligonukleotidialuketta peräisin julkaistu EGFR tai GAPDH-sekvenssi, mukaan lukien 5′-TGGAGCTACGGGGTGACCGT-3 ’ja 5′-GGTTCAGAGGCTGATTGTGAT-3′ (EGFR), 5’-AAGCCCATCACCATCTTC-Cag- 3 ’ja 5′-AGGGGCCATCCACA-GTCTTCT-3′ (GAPDH) ja 5’-TGAC-GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 ’ja 5′-CTAGAAGCATTTGCG-GGGACGATGGAGGG-3′ (Actin). PCR-tuotteet alistettiin 1,2% agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Reaaliaikainen PCR suoritettiin cDNA näytteitä käyttäen ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Alukkeet olivat seuraavat: EGFR (forward-aluke, 5’-TTCCTCCCAGTGCCTGAAT-3 ’reverse-aluke, 5′-GGTTCAGAGGCTGAT-TGTGAT-3′); Aktiinin (forward-aluke, 5’-CCAACCG-CGAGAAGATGA-3 ’; taaksepäin-aluketta, 5′-TCCATCACGATGCCAGTG-3’). Aineisto on normalisoitu Actin siivous geenin havaitseminen.

Solujen lisääntyminen

kasvun estäminen analyysiä, HCT116-soluja ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua per kuoppa 96- -kuoppaiset levyt. Ymppäyksen jälkeen kasvualusta korvattiin alustalla, joka sisälsi ilmoitetun pitoisuuden TSA. 3 päivän kuluttua, solujen kasvu mitattiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (Sigma, St. Louis, MO) kolorimetrinen menetelmä. Solukierron määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä propidiumjodidia tahra puskuria ja analysoitiin BD FACS Calibur taussytometrin kanssa CellQuest ohjelmisto.

mittaus Solunsisäinen glukoosi

Ennen sadonkorjuuta, kiinnittyvä viljelmiä valvonnan ja TSA-käsiteltyjen solujen DMEM, joka sisältää 1 tai 4,5 mg /ml glukoosia pestiin kahdesti kylmällä fosfaatti- puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten hajotetaan ioni-Freeh

2O 5 minuutin ajan jäillä. Glukoosipitoisuus mitattiin D-glukoosin mittaus kit (GAHK-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), mukaisesti valmistajan protokollan.

Transient transfektio ja lusiferaasin aktiivisuuden määritys

EGFR-promoottorin sisältävä plasmidi tulikärpäsen lusiferaasi transfektoitiin väliaikaisesti HCT116-solujen Arrestin transfektioreagenssia. Lyhyesti, 0,9 ug plasmidi-DNA, 0,1 ug Renillan lusiferaasin, ja 5 ui transfektioreagenssit sekoitettiin, ja transfektioprotokolla suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Kuusi tuntia transfektion jälkeen soluja viljeltiin normaalissa täydellisessä elatusaineessa vielä 16 tuntia. Sitten transfektoidut solut altistettiin lusiferaasianalyysissä. Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus normalisoitiin kuin Renilla lusiferaasi.

valmistus ja infektio shHDAC ilmentävien lentivirus

Lyhyesti, 6 ug pCMV-dR8.91, 3 ug pMD2.G, ja 9 ug pLKO-shLuciferase, pLKO-shHDAC1, pLKO-shHDAC2 tai pLKO-shHDAC3 kotransfektoitiin HEK293T-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Supernatantit, jotka sisältävät tarttuvaa shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 tai shHDAC3 lentivirus kerättiin päivänä 3 transfektion jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Sillä lentivirus infektio, 2 x 10

5 HCT116-solut infektoitiin shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 tai shHDAC3 lentivirukselle at infektiokertoimella (MOI) 1.

Potilaille ja näytteen valmistelu

Näytteet kasvainkudoksen ja viereisen normaalin kudoksen paksusuolen saatiin 14 potilasta, jotka ovat patologisesti diagnosoitu paksusuolen syöpä ja tehtiin kirurginen resektio National Taiwan University Hospital. Kudosnäytteet olivat päällä, sitten sonikoitiin lyysipuskuri (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 5% Triton X-100) ja proteaasi-inhibiittorit. Näytteet mikrosentrifugoitiin poistaa suurempien roskien ja alistettiin Western-analyysillä.

Kromatiini immuunisaostustesti

Soluja käsiteltiin 5 uM SAHA 6 h ja silloitettu 1,42% formaldehydi 15 min. Solut kaksi 10 cm: n maljoilla kaavittiin 1 ml: aan kylmää PBS: ää, sentrifugoitiin ja lyysattiin 1 ml: ssa IP-puskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 ja 1% Triton X-100), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 uM leupeptiiniä ja 1 uM aprotiniinia). Ydin- Pelletti suspendoitiin uudelleen IP-puskuriin ja sonikoitiin leikkaus chromatin. Sonikoitua lysaatit immunoprecipited vasta-aineilla SP1, AcH3, AcH4, H3K4Me2, CBP ja HDAC3, vastaavasti ja immuunikompleksien otettiin talteen proteiini A-Sepharose (Roche). Immunosaostetut DNA ja tulo-DNA uutettiin inkuboimalla 100 ui 10% Chelex (Bio-Rad), jotka kiehuvat kääntää cross-link, ja sentrifugoimalla poistamiseksi Chelex lietteeseen. Reaaliaikainen PCR suoritettiin puhdistetulla DNA: lla käyttäen seuraavia alukkeita: A: 5′-GTGAAAAACCCCACCGTTC-3 ’ja 5′-TCTGAAGGGGAGCAACCTTA-3′; B: 5’-AAGCTTCCGCGAGTTTCC-3 ’ja 5′-GAGGCTAAGTGTCCCACTGC-3′; C: 5’-ACCCTGGCACAGATTTGG-3 ’ja 5′-TGAGGAGTTAATTTCCGAGAGG-3′; D: 5’-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3 ’ja 5′-TTCCTCCAGAGCCCGACT-3′; E: 5’-CTGAGGAAGGAACCCAAAAA-3 ’ja 5′-GGGAGGTCCTCTCAGAA AGC-3’.

Tilastollinen analyysi

kolminkertaiset kokeet suoritettiin, ja tulokset esitetään keskiarvona ± SE. Kaksi- pyrstö t-testiä käytettiin laskemiseen välillä tilastollista merkitystä ryhmä

Tulokset

HDAC-inhibiittorit häiritä EGR signaloinnin kautta hiljentäminen EGF-reseptori (EGFR) lauseke

tutkia antituumorivaikutus on HDACi kolorektaalisyövässä, KRAS villityypin (WIDR ja HT29) ja KRAS mutanttisoluja (HCT116 ja SW480) käsiteltiin SAHA tai setuksimabin 48 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin. SAHA vähensi säilymisen näiden solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A), mikä viittaa siihen, riippumattomuus KRAS tilan antituumorivaikutuksen HDACi. Sen sijaan, setuksimabi oli vähän vaikutusta solujen elinkykyä (Fig. 1A). Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien tutkimuksessa, peräsuolen syöpäsolujen Setuksimabihoitoa saaneilla kuoli tehokkaammin aineista riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC), joka puuttuu

in vitro

järjestelmään [19]. Koska EGFR on merkittävä rooli CRC, kyky sen ligandin laukaista loppupään signaalin KRAS mutanttisoluista tutkittiin. EGF laukeaa sekä Akt ja ERK: n fosforylaatiota HCT116-soluissa ja indusoi ERK-aktivaation SW480-soluissa (kuvio. 1 B), mikä osoittaa, että KRAS mutaatio ei täysin ottaa haltuunsa ligandi-välitteinen ERK: n aktivaation ja myös impling merkitys EGFR KRAS mutanttien solujen . Lisäksi esikäsittely HDAC-inhibiittorit, TSA ja SAHA, häiritsi EGF-stimuloidun ERK ja Akt: n fosforylaation HCT116-soluissa ja ERK: n fosforylaatiota SW480-soluissa (kuvio. 1 C). Koska HDAC-inhibiittorit tukossa sekä Akt ja ERK fosforylaatiot, aivan proksimaalinen osa EGF signalointia voitaisiin kohdistaa HDACi. Siten ilmaisu EGF-reseptorin Ensin tarkasteltiin. Hoidon jälkeen TSA: n ilmentyminen EGFR vähennettiin HCT116, SW480, ja HT29. Tunnistaa, onko tämä on yleinen ilmiö, solut ovat peräisin eri elimiin käytettiin. Hoidon jälkeen TSA, alennettu EGFR nähtiin myös ihmisen ihon (A431) ja rinta (MDA-MB468) syöpäsolujen (Fig.1D).

(A) HCT116, SW480, WiDr ja HT29 pidettiin DMEM 1 mg /ml glukoosia ja käsiteltiin 0,1, 1, 10 ug /ml setuksimabia tai 1, 3, 5 uM SAHA solujen eloonjäämistä mitattiin MTT-määrityksellä 48 tunnin kuluttua hoidon (B) HCT116 ja SW480-soluja seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja stimuloitiin sitten 1 uM EGF, 1, 5, 15, 30 ja 60 minuuttia. (C) HCT116 ja SW480-soluja esi-inkuboitiin 0,5, 1 uM TSA tai 5 uM SAHA: ssa 24 tuntia ja sitten stimuloitiin EGF 5 minuuttia. (D) HCT116, SW480, A431 ja MDA-MB468-soluja käsiteltiin 1 uM TSA 24 tai 36 tuntia Kokosolulysaatti valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä fosfo-Akt, fosfori-ERK, Akt ja Erk .

HDAC estäjät vähentävät ilmaus SGLT1 ja vähentää solunsisäisiä glukoosi

lisäksi EGF signalointia, EGFR on raportoitu olevan mukana glukoosin kuljetusta yhdistämällä ja vakauttaa aktiivinen glukoositransportterin, SGLT1 [13], [20]. Koska ilmentyminen EGFR väheni HDACi CRC-soluissa, tasot SGLT1 ilmaisun ja solunsisäisen glukoosin vasteena HDACi tutkittiin myös. Kuten odotettua, TSA vähensi SGLT1 lauseke (2A) ja solunsisäinen glukoosipitoisuus (Fig. 2B). Glukoosi täydennystä säilyttää solunsisäisen glukoosin (Fig. 2C) ja pelastettiin solut TSA-solukuolema (Fig. 2D). Nämä tiedot osoittivat, että menetys EGFR ja sen kumppani, SGLT1, saattaa olla mukana sytotoksista vaikutusta HDAC-inhibiittorit.

(A) HCT116-soluja käsiteltiin 1 uM TSA 24, 36 tai 48 tuntia. Kokosolulysaatti valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä SGLT1, EGFR ja Actin. (B) Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa on 1 mg /ml ja sitä käsiteltiin 1 uM TSA: ssa 24 tuntia. Glukoosipitoisuus mitattiin kuten on kuvattu materiaali ja menetelmä (kolmena kappaleena näytteitä käytettiin kussakin ryhmässä. Tähti osoittaa merkittävä ero p 0,05. Error palkit osoittavat keskiarvo ± SE). (C) Soluja viljeltiin DMEM 1 mg /ml tai 4,5 mg /ml glukoosia ja käsiteltiin 1, 3 tai 5 uM TSA: ssa 24 tuntia. Glukoosipitoisuus mitattiin. (D) Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa on 1 mg /ml glukoosia ja käsiteltiin 1 tai 3 uM TSA. Kun oli kulunut 24 tai 48 tunnin käsittelyn jälkeen glukoosin säädettiin 4,5 mg /ml. Solun eloonjääminen mitattiin MTT-analyysi 72 tunnin kuluttua hoidon TSA. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SE kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

Loss EGFR on liitetty HDAC-inhibiittori-välitteisen sytotoksisuuden

HDAC-inhibiittorit ovat osoitettu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta, jonka pysäyttävät solusyklin ja liipaisu apoptoosin [15]. Johdonmukaisesti, SAHA lisääntynyt Saharan G1 väestöstä 7,72%: sta 17,23% ja G2 /M väestöstä 16,6%: sta 24,4% (3A). Valaista rooli EGFR antituumorivaikutuksen HDACi, solut transfektoitiin myc-EGFR ja käsiteltiin sitten SAHA 24 tuntia. Yli-ilmentymisen myc-merkitty EGFR väheni osa-G1 väestön ja G2 /M väestö (3A). SAHA aiheuttama p21 ilmentymistä oli myös lieventyneet kohdunulkoinen ilmaus EGFR (3B). Nämä tiedot osoittivat, että SAHA vähennetty EGFR osaltaan SAHA: n indusoiman apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen.

(A) HCT116-solut transfektoitiin Myc-EGFR sekä sen vektorin ohjaus ja transfektoituja soluja käsiteltiin 5 uM SAHA: ssa 24 tuntia. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla, ja osa solukierron analysoitiin virtaussytometrillä. (B) HCT116-solut transfektoitiin Myc-EGFR sekä sen vektorin ohjaus ja transfektoituja soluja käsiteltiin 5 uM SAHA: ssa 24 tuntia. Kokosolulysaatti valmistettiin ja alistettiin western blot käyttäen Ab spesifisiä EGFR, Myc, p21 ja tubuliinia.

HDAC ovat osallisina transkription EGFR

Koska määrä EGFR proteiini vähentää hoidon jälkeen HDACi, EGFR-geenin transkription tutkittiin. MRNA taso EGFR laski dramaattisesti hoidon jälkeen TSA ja SAHA (4A), mikä viittaa HDACi kopiointia downregulate EGFR. Tämä vaikutus vahvistettiin lisäksi EGFR toimittaja määrityksissä. Tuloksemme osoittivat, että TSA ja SAHA vähensi EGFR promoottorin aktiivisuutta (4B yläpaneeli). On raportoitu, että HDACi laski EGFR mRNA vakautta ER-negatiivinen ihmisen rintasyövän soluissa [21]. Näin ollen, vakautta EGFR mRNA tutkittiin.

de novo

transkriptio lopetettiin aktinomysiini D ja EGFR mRNA mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Kaltevuus EGFR mRNA: n hajoamisen eivät osoittaneet merkittävää eroa pohjapinta ja TSA hoito (Fig. 4B alempi paneeli), mikä viittaa siihen, että HDACi ei vaikuttanut hajoamista EGFR mRNA peräsuolen syöpäsoluja. Edelleen selvittämiseksi osallistumista HDAC: iden transkription EGFR, myc-merkitty HDAC1, HDAC2 tai HDAC3 oli ektooppisesti ilmaistu HCT116-soluissa, ja EGFR mRNA mitattiin RT-PCR. Kasvua EGFR-mRNA: n havaittiin kaikissa näissä HDAC-ilmentäviä soluja (Fig. 4C yläpaneeli). Kääntäen, knockdovvn HDAC1, HDAC2 tai HDAC3 mukaan shRNA vähensi ilmentymistä EGFR-proteiinin (4C alempi paneeli). Nämä tulokset osoittivat, että luokan I HDAC ovat ratkaisevia EGFR. Positiivinen korrelaatio EGFR ja HDAC3 ilmentyminen havaittiin myös neljätoista paria ihmisen paksusuolen kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa (Fig. 4D).

(A) HCT116-soluja käsiteltiin 1 uM TSA tai 5 uM Saha 1 ja 8 tuntia. Kokonais-RNA (2 ug) käytettiin RT-PCR: llä ja Real-time PCR, kuten on kuvattu. (B, ylempi paneeli) Soluja käsiteltiin 1 uM TSA tai 5 uM SAHA 6 tunnin ajan, sitten transfektoidaan EGFR-Luc. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin kuten kohdassa ”Materiaalit ja Method”. (B, alempi paneeli) Soluja käsiteltiin 1 uM TSA: ssa 4 tuntia, ennen kuin RNA-synteesin pysäytettiin aktinomysiini D (5 ug /ml) 0, 2, 4 tai 6 tuntia. RNA: ta valmistettiin ilmoitettuina ajankohtina lisäyksen jälkeen aktinomysiini D ja tasot EGFR mRNA mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. (C, ylempi paneeli) Solut transfektoitiin ohimenevästi Myc-merkityn HDAC1, 2 tai 3, vastaavasti, ja kokonais-RNA (2 ug) käytettiin RT-PCR tunnistaa EGFR mRNA-tasolla. (C, alempi paneeli) transfektoitiin shLuc, shHDAC1, shHDAC2 tai shHDAC3 by lentivirukselle kuten kohdassa ”Materiaalit ja Method”. Solulysaatit kerättiin 5. päivänä transfektion jälkeen ja sen jälkeen niille western blot-analyysi vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä EGFR, HDAC1, HDAC2 ja HDAC3. (D) lysaatit pariksi ihmisen normaalia ja pahanlaatuisten koolonin kudokset alistettiin western blottaus käyttämällä anti-EGFR, anti-HDAC3 ja anti-Actin vasta-aineita. Korrelaatio EGFR ja HDAC3 ekspressiotasot arvioitiin korrelaatiokertoimet.

SP1 on välttämätöntä EGFR transkription ja HDAC estäjä häiritsee sitoutumista SP1 EGFR promoottori

On useita SP1 sitoutumiskohdista EGFR promoottorit ja aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että HDACi vaikuttaa sitoutumiseen SP1 ADAMTS1or p21-promoottorit [22], [23]. Siksi SP1 voivat osallistua HDAC: välittämän EGFR. Todellakin, esto SP1 mitramysiiniä A (MTM) ja siRNA vähensi EGFR (Kuvio 5A). Lisäksi MTM rajusti EGFR promoottorin aktiivisuutta (Fig.5B), osoittaa kriittinen rooli SP1 EGFR-geenin transkription. Sitominen SP1 EGFR promoottori edelleen tutkitaan kromatiinin immunosaostuksella (chip). Viisi alukeparia (A, B, C, D ja E) suunniteltiin tasaisesti katettava alueita (-1200-1000 bps) ympärille transkription aloituskohdasta (6A). Meidän tiedot osoittivat, että sitoutuminen SP1 alueille C ja D oli merkittävästi vähentynyt hoidon jälkeen SAHA (6B). Lisäksi asetylaatio histoni H3 ja H4 on EGFR-promoottori heikentyä, erityisesti niillä alueilla lähellä transkription aloituskohdasta (6B). Tilan histoni metylaation kuten H3K4Me2, H3K9Me3 ja H3K27Me3 tutkittiin myös. SAHA ei muuttanut asuinpaikkaa näiden metylaation merkkiaineiden EGFR promoottori huolimatta rikastettua H3K4Me2 havaittiin (6B ja tuloksia ei esitetty). Koska asetylointi histoni H3 ja H4 putosi dramaattisesti jälkeen HDAC esto, täyttöaste histoni liasetyylitransferaasi (HAT) tai HDAC on EGFR promoottori tutkittiin. Tuloksemme osoittivat, että rekrytointi CBP alueeseen D oli merkittävästi vähentynyt SAHA (6B). Mielenkiintoista on, että sitoutuminen HDAC3 alueen D on heikennetty, liian (6B). Nämä tiedot osoittivat dissosiaatiota SP1, CBP ja HDAC3 päässä EGFR-promoottorin samanaikaisesti (kuvio 7), mikä tarkoittaa, että nämä proteiinit voivat vaikuttaa toisiinsa ja vaikuttaa niiden sitoutumista EGFR-promoottori.

(A) soluja käsiteltiin 1 uM mitramysiini A (MTM) 18 tai 36 tuntia, sitten kokosolulysaattia valmistettiin. Solut transfektoitiin 0, 400 tai 800 pmoolia SP1 siRNA, sitten koko solulysaatit valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä EGFR ja SP1. (B) Soluja transfektoitiin EGFR-Luc ja käsiteltiin sitten 0,1, 1 tai 5 uM mitramysiini A (MTM) 16 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin kuten kohdassa ”Materiaalit ja Method”. Tulokset normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus ja ilmaistiin keskiarvona ± SE. Kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

(A) Kuva EGFR-promoottorin ja ChIP-aluketta. (B) Soluja käsiteltiin SAHA: ssa 8 tuntia, sitten kiinteä, sonikoitiin ja alistettiin Kromatiini immunosaostus käyttäen Ab spesifisiä SP1 ja asetyloitu histoni H3. Histoni H4 asetylaatio H3K4 dimetylaatio, CBP ja HDAC3 on EGFR promoottori mitattiin ChIP määrityksiä kuten kohdassa ”Materiaalit ja Method”.

pohjapinta tilassa, HDAC3, CBP ja SP1 molemmat rekrytoitiin promoottorialue ja vastaavat transkription EGFR (A).