Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta viimeaikaisen kehityksen kohdennettuja hoitoja, potilailla, joilla haiman adenokarsinooma edelleen huono selviytyminen korostetaan kiireesti tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita. Aikaisemmat tutkimukset ovat sekaantuneet kemokiinireseptorin CXCR4 ja sen selektiivisen ligandin CXCL12 synnyssä ja etenemisessä haiman intraepiteliaalisten neoplasian ja invasiivisen haimasyöpä; siten, CXCR4 on lupaava kohde tukahduttaminen haiman syövän kasvua. Täällä yhdistimme

in silico

rakennemallinnus CXCR4 seuloa ehdokasta anti-CXCR4 yhdisteet

in vitro

solulinjassa määrityksissä ja tunnistettu NSC56612 National Cancer Instituten (NCI) Avoin Chemical Repository kokoelma estäjänä aktivoitu CXCR4. Seuraavaksi havaittiin, että NSC56612 on rakenteellisesti samanlainen kuin vakiintunut malarianestolääkitystä klorokiini ja hydroksiklorokiini. Arvioimme näiden yhdisteiden haimasyöpäsoluissa

in vitro

ja havaittu erityisiä antagonismi CXCR4-välitteisen signaloinnin ja solujen lisääntymistä. Viimeaikaiset

in vivo

terapeuttisia sovelluksia klorokiinin haimasyövän hiiri malleja ovat osoittaneet laskenut kasvaimen kasvua ja parantunut selviytymistä. Tuloksemme tarjoavat siten molekyylikohteessa ja perustan tuleville arviointiin klorokiini ja hydroksiklorokiini haimasyövän. Historiallisesti turvallinen ihmisillä, klorokiini ja hydroksiklorokiini näyttävät lupaavilta aineita turvallisesti ja tehokkaasti kohdistaa CXCR4 potilailla, joilla on haimasyöpä.

Citation: Kim J, Yip MLR, Shen X, Li H, Hsin L-YC, LABARGE S, et ai. (2012) tunnistaminen malarialääke yhdisteet kuten Novel antagonisteina kemokiinireseptori CXCR4 haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (2): e31004. doi: 10,1371 /journal.pone.0031004

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 30 joulukuu 2011; Julkaistu: 03 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta National Cancer Institute [P30 CA33572 JK, MLRY, ja NV]; National Institutes of Health (NIH) [NIH CA134637 JK]; ja American Cancer Society (ACS) [RSG-11-070-01-TBE JK]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu manuscript.The sisältö yksinomaan vastuulla kirjoittajien eivätkä edusta virallista kantaa National Cancer Institute, NIH tai ACS.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haimatiehyeeseen syöpä on tasaisen tappava tauti, joka on usein diagnosoitu etäpesäkkeiden tuolloin Alkuperäisten kliinisen esityksen. Tunnistamaton varhain taudin ja erittäin invasiivinen fenotyyppi ovat ensisijaisia ​​tekijöitä huonon ennusteen liittyy haimasyöpä ja korosta kiireellisyyden tunnistamiseksi molekyylitason tavoitteet sairauden etenemistä. Äskettäin vuorovaikutukset kemokiinit ja niiden vastaavat reseptorit on tarkasteltu synnyssä, eteneminen, ja etäpesäke haimasyövän [1], [2], [3]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että antagonisti- kemokiinireseptoriin CXCR4 voi kumota invasiivisia fenotyyppi haimasyövän [4], [5], [6]. Kasvusta huolimatta todisteita tärkeyttä CXCR4 haimasyövän ja muiden pahanlaatuisten kasvainten antagonistien CXCR4, jotka ovat turvallisia ja tehokkaita kliiniseen käyttöön ovat edelleen puutteellisia.

kemokiinin CXCL12 (tunnetaan myös strooman eristetyn hyytymistekijä-1α, SDF- 1α) aktivoi useita alavirtavaikuttajainhibiittorit reittejä sitoutuessaan reseptoriin CXCR4 [7]. CXCL12-CXCR4 vuorovaikutus säätelee kemotaksista, tarttuvuus, ja erittymisen kasvutekijöiden joukossa sen tunnettujen toimintojen [8]. Pian sen jälkeen CXCR4 tunnistettiin co-reseptori HIV-1 ja HIV-2 [9], [10], pieni bisyklaami molekyyli AMD3100 tunnistettiin erityiseksi CXCR4-antagonisti [5]. AMD3100 on nyt laajalti käytetty tutkia ja kuulustella CXCL12-CXCR4 vuorovaikutukset [7]. Vaikka AMD3100 pysyy kliinisessä käytössä kantasolujen mobilisaatio, sen pitkäaikaisessa käytössä on liittynyt merkittäviä kardiotoksisuuden [11]. Mielenkiintoista, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sen lisäksi roolinsa antagonisti CXCR4 signalointi, AMD3100 paradoksaalisesti sitoo ja aktivoi kemokiinireseptori CXCR7 [12], [13].

Koska nykyinen tietojen mukaan AMD3100 ei ehkä turvallinen tai tehokas anti-CXCR4-antagonisti terapeuttisiin sovelluksiin haimasyövän, erityisiä antagonisteja ovat vielä tätä tarkoitusta varten nimetty. Tässä tieteidenvälistä tutkimuksessa, yhdistimme

in silico

mallintaminen CXCR4 rakenteen korkean suoritustehon seulonnan ja

in vitro

määrityksissä haimasyövän solulinjoissa tunnistaa uusia antagonisteja CXCR4-välitteisen soluproliferaation haiman syöpäsoluja. Tutkimuksemme osoittaa, että turvallinen ja tehokas malarianestolääkitystä klorokiini ja hydroksiklorokiini ovat tehokkaita CXCR4-antagonisteja, jotka tukahduttaa haimasyöpä solujen lisääntymisen.

Tulokset

laskennallinen mallintaminen CXCR4

rakenteellinen kokonaisuus villityypin CXCR4-reseptoriin ennustettiin käyttämällä

ab initio

rakenne ennustaminen menetelmä (MembStruk4.3) [14], [15]. Vertasimme sitova mono- ja bisyklaami yhdisteitä meidän ennustaa rakenteiden mutageneesi tietojen vahvistamaan meidän laskennallisia ennusteita [16]. Ennustuksemme toimitettiin proteiinien rakenteeseen arvioinnin kilpailu (GPCRDOCK2010) ennen luonnehdinta kiderakenteen CXCR4 [17]. Yksityiskohtainen vertailu ennustetun rakenteen kiderakenne on tarkistanut tarkkuus Mallinamme ja on julkaistu muualla (kuvio 1) [18].

pienimolekyylinen nimetty ”1T” laitetaan ennustettu sidonta site. Neliöllisen keskiarvon poikkeama ennustetun ja kiderakenteet on 2,5 Å, mikä osoittaa tiivis yhdenmukaistaminen ennustamamme mallin kanssa perustettu kiderakenteen. Näin ollen, ennustettu sijainti sitoutumiskohdan pieni molekyyli ”1t” sovitettu kiderakenne. Pieni molekyyli ”1T” on kuvattu pieni palloja.

suoritetaan virtual ligandin seulontaan (VLS) National Cancer Instituten (NCI) Avoin Kemialliset Repository Collection 3 eri ennustettu konformaatioita CXCR4. Seuraavaksi ehdokas pieni molekyylit suodatettu niiden läheisyydestä tähteitä, joilla on tärkeä rooli antagonisti sitova, nimittäin: D92 (TM2), H121 (TM3), D171 (TM4), E262 (TM6) ja E288 (TM7) [ ,,,0],19], [20]. Noin 90%: n pienten molekyylien sulkea pois tässä vaiheessa.

Binding energiat pienten molekyylien laskettiin sitten ja ylin 10% pienten molekyylien, jolla on pienin sidosenergioiden olivat säilyneet. Kemialliset rakenteet top 10% osumia vaihteli monen aromaattinen rengas rakenteita rakenteiden pidemmän alkyyliketjuja. Tärkein peruste edelleen valinta oli vuorovaikutusta kandidaattimolekyylejä tähteiden kanssa, joiden tiedetään olevan tärkeitä sitova antagonisti [16]. Nämä molekyylit tutkittiin sitten proteiini-ligandi kontaktien ja 50 ehdokasta pienten molekyylien valittiin noin 350.000 molekyyleistä kokeelliseen testaukseen.

NSC56612 ja Related yhdisteet estävät CXCR4-välitteistä signalointia

Niistä 50 ehdokasta yhdisteiden VLS, pystyimme hankkimaan 32 NCI kokeelliseen testaukseen. Seulonta 32 yhdisteiden suoritettiin käyttäen Tango määritys, joka testaa inhibition CXCL12-välitteisen rekrytointi β-arrestin karboksipäähän CXCR4. Tämä määritys tunnistaa yksi osuma yhdistettä, joka vaimentaa β-arrestin rekrytointi ja kemialliset rakenteet tämän yhdisteen NSC56612 on esitetty kuviossa 2. Me suoritetaan edelleen kirjo suoraa ligandia sitovan, toissijainen messenger kalsiumvuomäärityksiä, ja alavirran kemotaksismäärityksiä välittämää CXCR4 /CXCL12 akseli tarkistaa, että nämä yhdisteet ovat suoraan kohdistaminen CXCR4. NSC56612 käytettiin templaattina identifioimaan yhdisteitä, joilla on samanlaiset kemialliset rakenteet. Tämä johti tunnistaminen kolme muita yhdisteitä, jotka ovat malarialääkkeet: klorokiini, hydroksiklorokiini, ja quinacrine (kuva 2).

(A) NCI yhdiste NSC56612, (B) klorokiinin, (C) hydroksiklorokiini, ja (D) quinacrine.

Kuva 3A esittää riippuvuutta pitoisuudesta käyrä suoran inhibition fluoresoivasti leimattuja CXCL12 sitoutumisen NSC56612, klorokiini, hydroksiklorokiini, ja quinacrine. Kilpailevan sitoutumisen kokeet osoittivat, että nämä yhdisteet suoraan inhiboida CXCL12 CXCR4 alhainen mikro-molaarinen affiniteetti. Määritys, jossa β-arrestin-2 rekrytointia välittämä CXCL12 arvioidaan myös estivät nämä kolme yhdistettä, joilla on alhainen mikro-molaarinen tehoa (kuvio 3B). Kuvio 3B esittää myös estovaikutukselle AMD3100, joka on CXCR4-antagonisti.

(A) pitoisuus riippuvainen esto fluoresoivasti leimattua CXCL12 (60 nM) sitoutuminen snap-tagged CXCR4 reseptorin HEK293-soluissa NSC56612, klorokiini ja hydroksiklorokiini. Puoli maksimaalinen tehokas pitoisuudet (EY

50), minkä arvoisina enintään CXCL12-CXCR4 sitoutuminen estyy 50%: ssa AMD3100, NSC56612, klorokiini ja hydroksiklorokiini ovat 60,0 nM, 5,5 uM, 6,1 uM, ja 9,8 uM vastaavasti. Nämä käyrät ovat edustavia tietoja 3 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. (B) annosriippuvaisesti esto CXCL12 aiheuttaman β-arrestin-2-välitteisen beetalaktamaasia aktiivisuus suunnitellut Tango määrityksessä esikäsittelemällä AMD 3100, NSC56612, klorokiini ja hydroksiklorokiini. Päästöjä dataa 460/530 määriteltiin vastesuhde. Nämä käyrät ovat edustavia tietoja 3 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. (C) annosriippuvaisesti esto CXCL12 aiheuttaman solunsisäisen kalsiumvuomäärityksiä AMD 3100, NSC56612, klorokiini, hydroksiklorokiini. CXCR4-välitteinen kalsiumin mitattiin 1 uM AMD3100 ja kaksi eri pitoisuuksina (100 uM ja 200 uM) kolmen yhdisteiden Molt-4-soluja. AMD 3100, NSC56612, klorokiini ja hydroksiklorokiini osoitti 50- 60% eston CXCL12 aiheuttama kalsiumin. Nämä käyrät ovat edustavia tietoja 3 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. (D) esto CXCL12 aiheuttaman Jurkat soluvaelluksen mukaan AMD3100 (100 nM), NSC56612 (100 uM), klorokiinin (100 uM), ja hydroksiklorokiini (100 uM). Kaikki neljä yhdistettä osoittivat 40%: sta 50% vähennys CXCL12 aiheuttama solumigraation. Kuvassa näkyy tietoja 4 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Virhe pylväät edustavat ± yksi SD. Studentin t-testi: * 0,05 ja ** 0,01.

Kalsiumvirtauksen, toissijainen messenger CXCL12-aktivaatio CXCR4, mittaa aktivointi CXCR4. CXCL12-välitteinen kalsiumin virtaus mitattiin kahdella eri pitoisuuksia neljä yhdistettä, nimittäin 100 uM ja 200 uM. Kuten kuviosta 3C nähdään, NSC56612, klorokiini ja hydroksiklorokiini osoitti 50%: sta 60%: n inhibitio CXCL12-indusoidun kalsiumin virtausta, kun taas quinacrine osoitti vähemmän kuin 10%: n inhibitio (tuloksia ei ole esitetty). Mittasimme estämisen taso, näiden yhdisteiden kemotaksis, alavirran vaikutus CXCR4 ilmentäviä soluja. Kuvio 3D esittää vaikutusta yhdisteiden kemotaksismäärityksiä jossa inhibitio CXCL12-indusoidun solumigraation mitataan. Arvioimaan pitoisuus yhdisteiden tarpeen kemotaksista inhibition, suoritimme annoksesta riippuvan inhibition kemotaksista johtoon yhdistettä NSC56612 kuten on esitetty kuviossa 4. Kaikki neljä yhdistettä osoittivat 40%: sta 50% vähennys CXCL12-indusoidun solujen vaeltamiseen. Quinacrine osoitti merkittävää tehoa kohti estämällä kemotaksista (tuloksia ei ole esitetty), kun taas sillä oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta kalsiumin vuon määrityksessä. Koska quinacrine ei tukahduttaa CXCL12 välittämän kalsiumvuomäärityksiä, se jätettiin pois tarkempaan analyysiin haimasyövän solulinjoissa. Tulokset näistä määrityksistä osoittaa, että klorokiini ja hydroksiklorokiini estää suoraan CXCR4 signalointia.

Solut maljattiin viljelymaljoille, joissa on 8-uM huokosten kalvoja luoda ylemmän ja alemman soluviljelmässä kammioihin. Solut ylemmässä kammiossa ja CXCL12 (30 nM) yksin tai lisäämällä NSC56612, klorokiini tai hydroksiklorokiini sijoitettiin alaosaan. Solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat kalvon läpi 5 tuntia laskettiin. Näytetyt tiedot 4 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Suhteelliset muutokset solujen vaeltamiseen on kuvattu ohjaus- ehto on 100% muuttoliike. Virhe pylväät edustavat ± yksi SD.

klorokiini ja hydroksiklorokiini esto CXCL12-välitteisen ERK-fosforylaation

Edellisessä tutkimuksessa havaitsimme, että CXCL12 indusoi kasvua ERK-fosforylaation [21]. Vaikka altistuminen CXCL12 myös aktivoinut PI-3K /AKT-reitin, missä määrin AKT fosforylaatio muutettiin oli paljon pienempi kuin ERK-fosforylaation. Siksi olemme keskittäneet tutkimus tällä tutkimuksen ERK aktivointia. Ensinnäkin varmistanut, että CXCL12 indusoi kasvua fosfo-ERK haimasyövän solulinjoissa (kuvio 5A). Sitten osoitimme, että klorokiini ja hydroksiklorokiini käyttää annoksesta riippuvainen estävä vaikutus CXCL12-välitteinen ERK: n fosforylaatiota PANC-1 ja AsPC-1-soluissa (kuvio 5B). Lopuksi näyttää määrällinen analyysi esto fosfo-ERK kuvassa 5C.

(A) immuunivärjäytyminen fosfo-ERK suoritettiin PANC-1, Hs-766T, AsPC-1, ja MIAPaCa- 2 solulysaateista. Soluja esikäsiteltiin klorokiinia tai hydroksiklorokiini (0,1 uM) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen solut altistettiin CXCL12 (200 ng /ml) 20 minuuttia. Vasta-aineen kokonaismäärään ERK1 /2 käytettiin latauskontrollina. CXCL12 välittämää nousua fosfo-ERK oli tehokkaasti kumotaan joko klorokiinin tai hydroksiklorokiini. (B) esikäsittely PANC-1 ja AsPC-1-solujen klorokiini ja hydroksiklorokiini (0,1-10 uM) 5 minuuttia, mitä seurasi altistus CXCL12 (200 ng /ml) osoittaa annoksesta riippuvainen vaikutus huumeiden hoidon CXCL12-välitteisen ERK fosforylaatio. (C) Western-blotit skannattu ja mittaamaan AlphaImager Tm3400 (Alpha Innotech). Kertamuutoksia fosfo-ERK verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin, koska suhteellinen ekspressio, joka normalisoitiin proteiinin juovien voimakkuudet koko ERK. Tulokset osoittavat keskiarvoa kolmesta kokeita, joissa

p

-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

klorokiini ja hydroksiklorokiini Trigger apoptoosi ja estää CXCL12-välitteisen leviämisen ja antiapoptoosi

klorokiini ja hydroksiklorokiini sytotoksisuutta haimasyövän solulinjoissa arvioitiin ja IC50 määritettiin (kuvio 6). Käyttäen näitä arvoja, arvioimme CXCR4 signalointi on solujen lisääntymisen määrityksessä. Olemme aiemmin havaittu CXCR4 välittämää nousua solujen lisääntymisen haiman syöpäsoluissa [21]. Siksi klorokiini ja hydroksiklorokiini arvioitiin antagonismi CXCR4 välittämä solujen lisääntymistä; ja olemme todenneet, että aineet tehokkaasti antagonisoivat CXCR4-välitteisen soluproliferaation PANC-1, Hs-766T, ja MiaPaca-2-soluja (kuvio 7). Koska lisääntynyt jakautuminen ei havaittu AsPC-1-solujen altistuksen jälkeen CXCL12, näitä soluja ei ole arvioitu klorokiini ja hydroksiklorokiini tässä määrityksessä. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​julkaistuissa raporteissa, jotka osoittavat, että kaikki haimasyövän solulinjoissa vastata CXCL12 lisääntynyt leviämisen [2]; mekanismia vastuussa tästä ei ole vielä selvitetty. Sekä klorokiini ja hydroksiklorokiini osoitti vähentäminen fosfo-ERK läsnäollessa CXCL12, jossa koko ERK pitoisuus ei vaikuttanut. Nämä tulokset osoittavat, että klorokiini ja hydroksiklorokiini estävät spesifisesti CXCR4-välitteistä signalointia tukahduttaa soluproliferaatiota haiman syöpäsoluissa.

AsPC-1, Hs-766T, MiaPaca-2, ja PANC-1-soluja käsiteltiin annoksella valikoima klorokiinia tai hydroksiklorokiini (0,01-10 uM) 72 tunnin määrittää puoleen maksimaalisesta estävä pitoisuus (IC50-arvot) näiden yhdisteiden. AsPC-1 ja Hs-766T-soluissa oli samanlainen IC 50-arvot klorokiini ja hydroksiklorokiini, kun taas MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa oli korkeammat IC50-arvot hydroksiklorokiini kuin klorokiini.

(A) PANC-1 (B) Hs-766T, ja (C) MiaPaca-2-soluja esikäsiteltiin klorokiinia tai hydroksiklorokiini (0,1 uM) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen solut altistettiin CXCL12 (200 ng /ml) 72 tunnin ajan. (D) Esikäsittely klorokiini ja hydroksiklorokiini myös laukaista apoptoosin ja laski CXCL12-välitteistä apoptoosia PANC-1-soluissa. Tiedot osoittavat keskiarvoa kolmesta kokeesta.

P

-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Koska mekanismi muutoksia solujen lisääntymistä ei ollut selvää, me arvioitiin myös apoptoosin altistuminen klorokiini ja hydroksiklorokiini. Ensinnäkin, tulokset viittaavat siihen, että CXCL12 edistää anti-apoptoosin haiman syöpäsoluissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu raportteja CXCL12 /CXCR4 akselilla [22], [23]. Toiseksi, meidän tulokset osoittavat, että klorokiini ja hydroksiklorokiini kumoaa CXCL12 välittämää anti-apoptoosin (kuvio 7D), jossa esikäsittelyä klorokiinin tai hydroksiklorokiini lisääntynyt apoptoosin PANC-1-soluissa.

Keskustelu

Käyttäen poikkitieteellisen lähestymistavan aloittaen laskennallinen mallintaminen on CXCR4 reseptorin rakenne

in vitro

analyysi CXCR4 signalointi, tutkimuksemme on päättänyt, että klorokiini ja hydroksiklorokiini teko uusina CXCR4-inhibiittorit haiman syöpäsoluja. Olemme osoittaneet, että nämä kliinisesti turvallinen ja tehokas anti-malarialääkkeet spesifisesti inhiboivat CXCL12 CXCR4 ja estää CXCL12-CXCR4 alavirtavaikuttajainhibiittorit reittejä, jotka välittävät kalsiumvuomäärityksiä, rekrytointi ß-arrestin-2 ja migraatiota. Haimasyövän solulinjoissa havaitsimme klorokiini ja hydroksiklorokiini lohko CXCL12-välitteistä signalointia kautta ERK-reitin loppupäässä vaikutuksia sekä apoptoosin ja solujen lisääntymistä. Koska CXCR4 näyttää olevan tärkeä rooli patogeneesissä ja etenemistä haimasyövän [1], [2], [3], työmme on tärkeitä kliinisiä tunnistamisessa uusi terapeuttinen käyttö näille perustettu malarialääkkeet.

Alkuperäiset tutkimuksemme tarvitaan tarkka luonnehdinta rakenteen CXCR4. Käyttämällä laskennallisia menetelmiä on aiemmin kehittänyt meille, ennustettu kolmiulotteinen rakenne CXCR4 ja sitoutumiskohtien tiedetään pienimolekyylisiä antagonisteja, kuten cyclam yhdisteet [16], [24], [25]. Rakenteiden ennustukset tehtiin ennen julkaisemista kiderakenteen CXCR4 [17]. Myöhemmät vertailu ennustetun rakenteiden kristallin osoittivat erinomaisen sopimuksella neliöllinen poikkeama koordinaatit ligandin 2,2 Å. Nämä tulokset olivat rohkaisevia edelleen tutkimuksemme etsivät pienimolekyylisiä CXCR4-antagonisteja haiman syöpäsoluja. Kun ennustettu konformaatioita CXCR4 käytimme perustettu yhdisteiden kirjastoja tunnistamiseksi antagonistiehdokkaan osumia. Rajoittamalla osumia alkuun 32 ehdokasta, suoritimme suuren seulontamäärityksiä, mikä edelleen kaventuneet meidän ehdokaslistan 3 yhdisteitä. Nämä ensimmäiset tutkimukset johtivat meidät NCI yhdiste NSC56612. Exploration of kemiallisen rakenteen NSC56612 samankaltaisia ​​yhdisteiden yleisten ja kaupallisista tietokannoista paljasti, että NSC56612 yhteinen rakenteellinen homologia klorokiini, hydroksiklorokiini, ja quinacrine; mutta vain klorokiini ja hydroksiklorokiini läpäissyt kaikki meidän seulontamääritysten. Hajanaisuuden tehoa quinacrine voisi olla toissijainen heterogeenisyys alavirran efektorien (

esim.

, Fosfolipaasi C tai G-proteiinit) eri solujen toimintoja, jotka voivat johtaa vaihtelevan vastauksena solujen välillä. Muut tutkimukset ovat aiemmin osoittaneet, ero tehon erillisten G-proteiiniin kytketty reseptori ligandeja eri määrityksiä [26], [27]. Tunnistaa oletetun sitoutumiskohdat näiden yhdisteiden me telakoituna klorokiini ja hydroksiklorokiini sen kiderakenne CXCR4 (kuvio 8), ja tunnistaa, että tertiääriset amiiniryhmät näissä yhdisteissä tehdä vetysidoksia D97 on TM2 ja E32 aminopäässä reseptorin ; ja aromaattiset tähteet Y45, W94, H113 ja Y255 osoittavat suotuisa van der Waalsin vuorovaikutus aromaattisen rengassysteemin näissä yhdisteissä.

Green helices, TM1, 2, 3, 5, 6, ja 7 on esitetty. Sitoutumisessa sekä klorokiini ja hydroksiklorokiini vuorovaikutuksessa suotuisasti ilmoitettu jäämiä (E32, N37, Y45, W94, D97, H113, I185, D187, Y255, E288) esitetään tikkuja. Nämä tähteet ovat 5 Å sitoutuneen yhdisteen. Kuitenkin aminohappotähteet CXCR4 sitoutumiskohdassa on suunnattu hieman eri riippuen siitä klorokiini tai hydroksiklorokiini sitoa. Suhteellinen orientaatiot CXCR4 aminohappotähteet, jotka ovat vuorovaikutuksessa klorokiini ja hydroksiklorokiini esitetään vihreä ja syaani tikkuja, vastaavasti.

Koska invasiivisia liittyvä fenotyyppi CXCR4 on osoitus CXCL12-ajettu signalointireittien testasimme klorokiini ja hydroksiklorokiini

in vitro

. Päätimme arvioida MAPK signalointireitin, sillä olemme aikaisemmin osoittaneet sen roolia välittämässä kasvun ja lisääntymisen haiman intraepiteliaalisten neoplasiaa ja haiman syöpäsoluja [21]. Meidän nykyiset tutkimukset huomasimme tehokas esto CXCL12-ajettu ERK-fosforylaation ja eston CXCL12-välitteisen proliferaation

in vitro

.

On olemassa kliinistä näyttöä syövän vaikutuksia klorokiini ja hydroksiklorokiini . Kliinisessä tutkimuksessa varten glioblastoma multiforme, klorokiini annettiin yhdessä tavanomaisen kemoterapian liitännäishoitona potilailla, joille tehtiin kirurginen resektio varten glioblastoma multiforme. Potilaat, jotka saivat klorokiini kokemus parantunut eloonjääminen verrattuna potilaisiin, jotka saivat kemoterapiaa yksinään [28]. Vaikka he eivät tunnistaa CXCR4 mahdollisena kohteena, Rubin

et al.

, Oli aiemmin osoittaneet, että CXCR4 antagonismi esti glioblastoma multiforme kasvua, mikä viittaa siihen, että CXCR4 oli sopiva kohde glioblastoma hoito [29]. Lisäksi kliinisessä tutkimuksessa metastasoituneen kolorektaalisyövän on sisällyttänyt hydroksiklorokiini yhdessä standardin solunsalpaajahoidosta [30]. Ryhmämme ja toiset ovat tutkineet CXCR4 ilmentymistä peräsuolen syövän ja havaittu mahdollinen rooli CXCR4 peräsuolen syövän etenemisessä [4], [31], [32]. Tutkimuksemme osoittaa, että klorokiini ja hydroksiklorokiini ovat antagonisteja CXCR4 ja tarjoaa näin molekyylitason perustan käyttämällä klorokiini metastasoituneen kolorektaalisyövän. Koska tämä kliinisessä tutkimuksessa on meneillään, tulokset ovat vielä kypsyä. Klorokiiniä on myös äskettäin testattu

in vivo

hiirimallissa haimasyövän malli osoittavat kasvaimia tuhoavaa vaikutusta parantunut eloonjääminen [33]. Nämä tutkijat käytetty klorokiini ilman ymmärrystä sen vaikutuksista CXCR4.

Vaikka klorokiini ja hydroksiklorokiini on äskettäin käytetty syöpälääkkeen sovelluksia, ne on alun perin formuloitu malarialääkkeet. Nämä lääkkeet formuloitiin koska Atabrine, ensimmäinen synteettinen malarialääkkeet yhdiste, oli ei-toivottuja sivuvaikutuksia värjäys ihon ja silmien [34]. Sekä klorokiini ja hydroksiklorokiini ovat heikkoja emäksiä, jotka kohdistuvat verisoluja, jotka ovat tartunnan malaria [35]. Nämä lääkkeet toimivat ensisijaisesti diffundoitumasta loisen ontelon, jossa hemoglobiini hajoaa [36]. Happamassa vakuoli, ne tulevat protonoidut ja loukkuun [36]. Sisällä ontelon, ne estävät jakautuminen hemin, sivutuote loistaudit hajoamista hemoglobiini [36]. Kertyminen hemin tulee myrkyllisiä ja johtaa solujen hajoamiseen ja loisen kuolemaan [36]. Riippumatta näistä malarialääkkeet viitteitä, mekanismi kasvainten vastaiset vaikutukset klorokiini ja hydroksiklorokiini on tutkittu [37]. Klorokiini näyttää estävän autophagy ja indusoivat p53-riippuvaista apoptoosia [38]; ja se voi myös voimistaa kemoterapiaa tai sädehoitoa [39].

Yhteenvetona käyttäen poikkitieteellinen lähestymistapa tunnistimme novel CXCR4-antagonisteja ja ovat osoittaneet, että klorokiini ja hydroksiklorokiini estävät CXCL12-CXCR4 signalointi. Koska tehokas antagonistit CXCR4 puuttuvat ja että uudet hoitomuodot ovat vielä parantaa selviytymistä yli 1 vuoden metastasoituneen haimasyövän [25], [40], [41], tuloksemme ovat tärkeitä kliinisiä seurauksia. Tutkimuksemme tulokset antavat tieteellisen perustan käyttämällä klorokiini tai hydroksiklorokiini haimasyövän oikeudenkäyntiin; ja koska turvallisuusprofiilit ovat vakiintuneita nämä lääkkeet, kliininen tutkimus voidaan nopeasti toteuttaa potilaiden haimasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

ennustaminen CXCR4 Structure

MembStruk4.3,

ab initio

rakenne ennustus menetelmää käytettiin tuottamaan kokonaisuus villityyppisen ihmisen CXCR4 rakenteita [14], [15]. Trans-kalvo (TM) alueet CXCR4 ennustettiin käyttäen Tm2ndS menetelmää usean sekvenssin rinnastus ihmisen, rotan ja hiiren CXC ja CC-perheen kemokiinireseptoreiden (taulukko 1) [14]. Olemme optimoineet suhteellisen pyörimisen ja kääntäminen seitsemän TM helices ja kierteisen taitoksia alkaen koottuna nippu kanoninen helices rakennettu TM ennusteita. Canonical oikeakätinen α-helices rakennettiin kunkin kierteen ja niiden kierteiset akseleita suuntautunut avaruudessa mukaan 7,5 pienitarkkuuksisen elektronitiheyskartan sammakon rodopsiinin [42].

Tämä 7,5 Å elektronitiheyskartan kunhan paikat ja suhteelliset orientaatiot kierteisen akselit palveli optimoida heeliksnipun. Suhteellinen translaation painotuksista 7 helices optimoitiin kohdistamalla hydrofobinen maksimi määritettiin jokaiselle helix tasoon. Kiertoliike suuntautuminen optimoitiin yhdistämällä hydrofobisen hetkiä ja molekyylidynamiikkalaskenta tekniikoita. Tiedot kiderakenne CXCR4 [17], joka oli vasta äskettäin tunnettu, ei käytetty näitä ennusteita.

johdettu kokonaisuus vähän energiaa TM tynnyri konformaatioita CXCR4 ja sen konstitutiivisesti aktiivinen mutantit [43] . Reseptori konformaatioita valittiin saada maksimimäärä välisten kierteisen vetysidoksia ja korkein kokonaisenergia proteiinin konformaation lipidikaksoiskerros. Kolme potentiaali matalan energian konformaatioita valittiin CXCR4 jotka olivat eri orientaatiot TM3, TM5, ja TM7. TM5 oli 3 eri konformaatioita: 2 oli eri suuntauksia jäännöksen Y219

5,58, jotka vastaavat 2 eri suuntaviivoja Y223

5.58 in rodopsiinin ja opsin kiderakenteet [44], [45]. TM7 oli 2 eri kierteiset suuntaviivat, joissa asema E288

7.39 oli erilainen.

Telakka of AMD3100 ja Virtual Ligandi Screening

ennustettu sitoutumiskohta mono- ja bisyklaami johdannaiset AMD3100 on CXCR4 validoitiin käyttäen vakiintuneita kohdennettua mutageneesiä tietoja [19], [20]. Tämä ennustettu sitoutumiskohta sitten käyttää suorittamaan virtuaalista ligandin seulontaan (VLS) tunnistaa uusia antagonisti osumia CXCR4. The National Cancer Instituten (NCI) Avoin Chemical Repository Collection [46], joka koostuu noin 300000 yhdisteiden, tiedustellessa käyttäen Maestro LigPrep moduuli (Schrödingerin; San Diego, CA). Useita konformaatioita ehdokas ligandien sitten telakoitiin ennustettu sitoutumiskohta CXCR4 käyttäen Glide SP (Schrödingerin) skaalaus van der Waalsin säteiden 0,5 ja osaveloitus sulku 0,15. Yhdistetty coulombisia ja van der Waalsin energia cutoffs Sitten nostettiin 100 kcal /mol. Varatut molekyylit poistetaan ja neutraaleja molekyylejä, jotka katsottiin parempia ehdokkaita valittiin jatkotutkimuksiin. Siirtyy liitetty ligandi konformaatioita neutraalien molekyylien Sitten suodatettu haudattu pinta, jossa ligandit, jotka olivat 80% haudattu ja perustuu niiden etäisyydet happamien tähteiden D171, D262 ja E288 valittiin. Nämä 3 tähteet on osoitettu olevan tärkeitä sitovia CXCR4-antagonisteja [19], [20].

Käyttämällä Prime moduuli Maestro, sivuketjut 5 säteellä ligandin saivat uuden. Sen jälkeen sivuketjun siirtämisellä, sitova energioita (BE) kunkin telakoituna lihakkuuden laskettiin käyttäen BE = PE (ligandi kiinteään proteiini) – PE (ligandin hydrataatiotila), jossa PE (ligandi kiinteään proteiini) on potentiaalienergia ligandin laskettuna proteiinin atomien kiinteä ja PE (ligandia solvaatioenergia) on potentiaalienergia ligandin lasketaan Surface Yleistynyt Born jatkumo hydrataatiotila menetelmä [47]. Top 200 konformaatioita kutakin sitten silmämääräisesti maksimoida suotuisa reseptorivuorovaikutuksissa. Otimme alkuun 50 yhdisteitä kustakin CXCR4 reseptorin konformaation myöhempää testausta.

fluoresenssia Merkityt kilpailukykyisen ligandisitoutumismääritys

Kilpailukykyinen ainesitoutumistutkimukset arvioimiseksi ehdokas CXCR4-antagonisteja tehtiin käyttämällä kemokiinin CXCR4 reseptoriligandiin sitoutumismääritys mukainen pakkaus, valmistajan ohjeiden (Tag-lite, Cisbio, Bedford, MA) [48], [49]. Lyhyesti, HEK-293-soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia kanssa fluoresenssileimattua CXCL12 ligandin kanssa tai ilman CXCR4-antagonisteja. Inkuboinnin jälkeen solut aktivoitiin 620 nm ja äänitetty dual-päästöt (620 nm ja 665 nm) käyttäen PHERAstar (BMG LABTECH Inc .; Cary, NC). Suhteellinen suhde CXCL12-CXCR4 sitoutuminen saatiin jakamalla akseptorin signaali (665 nm), jonka luovuttaja-signaali (620 nm), ja kertomalla tämä arvo 10000.

CXCR4 rekrytointi β-arrestin

aktivointi CXCL12-CXCR4 akselin tuloksia rekrytointi β-arrestin-2 karboksiterminaaliin CXCR4 [50]. Voit tarkistaa eston β-arrestin-2 rekrytointi ehdokas CXCR4-antagonisteja, käytimme kaupallinen CXCR4 määritys (Tango; Invitrogen, Carlsbad, CA) [51], [52]. Lyhyesti, muokatut solut (3 x 10

4) ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. DMSO tai antagonisteina lisättiin soluihin 30 minuuttia. Sitten CXCL12 (60 nM) lisättiin ja soluja inkuboitiin 5 tuntia.