Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on yli-ilmentynyt 80% ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja on yhteydessä huonoon säilymiseen. Viime vuosina EGFR kohdistetut estäjiä on testattu klinikan NSCLC. Huolimatta syntyminen uusia hoitomuotoja ja niiden soveltamista syövän hoidossa, yleinen eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaiden pysyy 15%. Kehittää tehokkaampia hoitomuotoja keuhkosyöpä olemme yhdistäneet anti-EGFR-vasta-aine (klooni 225) kuin molekyyli terapeuttisen hybridi plasmonic magneettinen nanohiukkasten (NP) ja testattiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin.

Menetelmät /Principal havainnot

Solun elinkelpoisuus määritettiin trypaanisininen-määritystä. Cellular proteiinin ilmentyminen määritettiin Western-blottauksella. C225-NP havaittiin elektronimikroskoopilla ja konfokaalimikroskopialla, ja EGFR avulla immunosolukemiallinen. C225-NP osoitti voimakasta ja selektiivinen antituumorivaikutus on EGFR: ää ilmentävä NSCLC solujen estämällä EGFR-välitteiseen signaalin siirtoon ja aiheuttama autophagy ja apoptoosin kasvainsoluissa. Optinen kuvia osoittivat spesifisyyttä vuorovaikutukset C225-NP ja EGFR: ää ilmentävä NSCLC soluissa. O sitoutuminen C225-NP havaittiin EGFR-null NSCLC soluissa. C225-NP oli korkeampi tehokkuus induktioon soluntappokyky verrattuna saman määrän vapaan C225-vasta-aineen tuumorisoluissa eri EGFR. Lisäksi, toisin kuin C225-NP, vapaa C225-vasta-aine ei aiheuttanut autophagy soluissa. Kuitenkin terapeuttinen teho C225-NP vähitellen lähestyi tasoa vapaan vasta-aineiden määrää C225-vasta-konjugoitua per nanohiukkasten väheni. Lopuksi, kiinnittämällä C225 NP oli tärkeää tuottaa tehostetun kasvainsolujen tappaminen kuin lisäämällä sekoitus vapaa C225 ja NP ei osoittanut samassa määrin soluntappamisaktiivisuutta.

Johtopäätökset /merkitys

osoitimme ensimmäistä kertaa molekyylitason mekanismi C225-NP aiheuttama sytotoksisia vaikutuksia keuhkojen syöpäsolut, jotka eivät ole ominaisia ​​ilmaiseksi molekyylitason terapeuttisten lisäten hoidon tehoa vastaan ​​NSCLC.

Citation: Yokoyama T, Tam J, Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) EGFR-Kohdennettu Hybrid Plasmonic Magnetic Nanohiukkasten synergistisesti Pakotettava Autophagy ja apoptoosi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10,1371 /journal.pone.0025507

Editor: Sujit Basu, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2011; Hyväksytty: 05 syyskuu 2011; Julkaistu: 07 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Yokoyama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain National Cancer Institute myöntää R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE in Lung Cancer), CA16672, ja The Joans Legacy: United vastaan ​​Keuhkosyöpä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on yli-ilmentyy 80%: ssa NSCLC ja liittyy huono säilyminen [1]. Viime vuosina EGFR kohdistetut estäjiä on testattu klinikalla NSCLC [2] – [6]. Kuitenkin syntymässä molekyyli hoitomuotoja on tuottanut pientä nousua elossaololuku yli selviytymisen saavilla potilailla standardi non-kohdistettuja hoitoja. Tämän seurauksena yleinen eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaiden jää alle 16% [7]. Näin ollen on edelleen kannustin kehittää ja testata uusia hoitoja. Lähestymistapamme voittaa rajoittamista nykyisten hoitomuotojen on ollut yhdistää molekyyli terapeuttisia kanssa kehittyvien nanoteknologian ja testi vastaan ​​keuhkosyöpään.

On vakuuttavasti osoitettu, että nanoteknologia voi tarjota ainutlaatuisia ratkaisuja mullistaa diagnosointiin ja hoitoon monet tuhoisa sairauksien kuten syövän [1], [8] – [11]. Yksi erityinen alue suurta kiinnostusta on nanopartikkeleiden kehittämisessä molekyylien tiettyjä kuvantamisen, terapia ja yhdistetty kuvantaminen /hoito [12] – [13]. Kanavointi erityyppisiä nanohiukkasten (NPS) ja kohdennusmolekyylejä tarjoaa yhteisen alustan useille kuvantamisen sovelluksiin, joissa on suuri joustavuus [14] – [15]. Vaikka kuvantaminen ja photothermal hoitoa plasmonic ja hybridi plasmonic NP on melko laajasti tutkittu, molekyylimekanismeihin NP vuorovaikutus elävien solujen ei ole täysin ymmärretty. Äskettäin osoitettiin, että NP: itä vuorovaikutuksessa solujen koossa-riippuvaisella tavalla 40-50 nm NP osoittaa suurinta solun sisäänoton [16]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa molekyyli signalointi vaikutuksia seuraava NP sisäänoton ei tutkittu.

Tässä tutkimuksessa yhdistimme anti-EGFR-vasta-aine (klooni 225) kuin molekyyli terapeuttisen hybridi plasmonic magneettinen NP: itä ja tutkittu molekyylitasolla vuorovaikutukset EGFR kohdistetun NP (225-NP) kokoluokassa 40-50 nm ja ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. 225-NP koostuu paramagneettisen rautasydämen, jota ympäröi kulta kerroksen ja on funktionalisoitu monoklonaalinen anti-EGFR-vasta-aineita (klooni 225). Käytimme ihmisen keuhkosyövän soluja eri EGFR ja muutti pinnan koostumusta NP valaista mekanismeja näiden vuorovaikutusten. Meidän alkuperäinen tavoite oli käyttää C225-NP kuvantamisaineena suunnattu EGFR yli-ilmentävät keuhkosyövän soluja. Yllättäen huomasimme, että C225-NP selektiivisesti sytotoksinen EGFR yli-ilmentyvä keuhkosyövän soluja kuin mikä olisi odotettavissa konjugoimattoman vasta-aineen. Tuloksemme antaa uuden suunnan kohti yhä teho molekyyli- erityisten terapeuttisten kautta kolmiulotteinen järjestely nanomittakaavan käyttäen NP malleina.

Tulokset ja keskustelu

225-NP-hoitoa säätelee EFGR- signalointireitin ja tappaa keuhkojen kasvainsolujen tehokkaammin kuin normaalit solut

ensin tutkittiin EGFR (fosforyloidun ja yhteensä) ekspressio useissa ihmisen NSCLC solulinjoja, jotka ovat villin tyypin (H1229), mutatoitunut ja yliekspressoitu (HCC827, H1975 , H3255), monistetaan (H1819), tai null (H520) ja EGFR ja verrattiin EGFR normaaleissa keuhkoissa fibroblasteissa (MRC-9 ja WI38-) ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) Western-blottauksella. Sekä kokonais- että fosforyloitu EGFR (pEGFR) ekspressiota havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa lukuun ottamatta H520-soluja, jotka ovat nolla-EGFR. Kuitenkin pEGFR ekspressiotasot vaihteli solulinjaa korkea ekspressio havaitaan HCC827, H1819 ja H3255-soluja (kuvio 1a). H1299-solut oli keskitason ilmentymistason pEGFR. Sitä vastoin normaaleissa soluissa (NHBE, MRC-9, ja WI38-) ja H1975-solut ekspressoivat alhainen pEGFR. Hoidon C225-NP merkitsevästi (P ​​= 0,05) pienensi elinkelpoisuus EGFR positiivinen HCC827, H1299 ja H1819 syöpäsolujen verrattuna hoitoon kontrolli-lgG-NP (Fig. 1b). C225-NP-välitteisen estäviä vaikutuksia kuitenkin vaihteli syöpäsolun linjat testattu ja oli riippumaton EGFR mutaatiostatuksesta riippumatta. Ei inhiboivia vaikutuksia ei havaittu C225-NP-käsiteltyjen H520-soluissa verrattuna IgG-NP-käsitellyt solut. Niistä normaalit solut, MRC-9 mutta ei NHBE solut osoittivat joitakin estäviä vaikutuksia hoidetuilla C225-NP ja verrattuna IgG-NP käsittelyä (kuva 1b). Kuitenkin estäviä vaikutuksia havaittu C225-NP-käsitellyn MRC-9 (9%), solut olivat vähemmän kuin estäviä vaikutuksia havaittu C225-NP-kasvaimen soluja (14-18%).

(a ) ilmentäminen fosforyloidun ja koko EGFR normaaleissa ja NSCLC soluissa. (B) Cell tappaminen vastauksena EGFR-kohdennettuja C225-NP NSCLC ja normaalien solujen. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P-arvo 0,05 vs IgG-NP H1299, HCC827, ja H1819 soluja.

Tämän jälkeen arvioimme proteiinin ilmentymistä fosforyloidun EGFR ja EGFR-liittyvä signalointi molekyylejä kasvaimen ja normaaleissa soluissa jälkeen hoidon IgG- tai C225-NP. Alennettu ilmentyminen fosforyloitua-EGFR, -AKT, -p38MAPK, ja p44 /42MAPK jälkeen C225-NP hoidon havaittiin HCC827 ja H1299-soluissa verrattuna soluihin, joita käsiteltiin kontrolli-lgG-NP (kuvio 2). Vuonna H520-soluissa ekspressiota kaikkien näiden proteiinien pysyi muuttumattomana, kun sitä käsiteltiin 225-NP ja verrattiin soluissa, joita käsiteltiin IgG-NP (kuvio 2). Immunohistokemiallinen analyysi osoitti pEGFR ilmentyminen väheni merkittävästi (35%;

P

0,05) HCC827 soluja 30 ja 60 minuutin käsittelyn jälkeen C225-NP verrattuna pEGFR ilmentymisen IgG-NP-käsiteltyjen solujen (8 -12%, kuvio S1). Normaali (MRC-9 ja NHBE) soluja, ei ollut merkittävä väheneminen pEGFR tai liittyneet proteiinit analysoitiin IgG-NP- ja C225-NP-hoitoa (kuvio 2).

inhiboivat vaikutukset C225- NP fosforyloidun EGFR ja loppupään signalointimolekyylejä ihmisen keuhkosyövän ja normaalit solut. C225-NP vähensi ilmentymistä fosforyloidun (p) muodot EGFR, AKT, p38 MAPK, ja P44 /42 MAPK EGFR-positiivisia kasvainsoluja, mutta ei normaaleissa soluissa. Ei ollut mitään vaikutusta EGFR-null H520 syöpäsoluja.

225-NP-hoito tuottaa suurempia antituumorivaikutus kuin C225 ja NP hoito yksinään

Seuraavaksi määritettiin panosta yksittäisiä komponentteja muodostavat C225-NP on havaittu kasvua estäviä vaikutuksia tuumorisoluissa. HCC827 kasvainsoluja käsiteltiin AuFe yksin, ja vapaa C225-vasta-aine yksinään vähensi solujen elinkelpoisuuden 12-14% käsittelemättömiin kontrollisoluihin, kun taas seos hoidon free C225-vasta-aine plus AuFe vähensi solujen lukumäärät 22% (kuvio 3a). Kiehtovan, C225-NP vähentänyt solujen määrän (48%; P 0,05), joka oli huomattavasti korkeampi kuin estävä vaikutus tuotetaan yksittäisiä aineosia (225-vasta-aine, AuFe) osoittaa konjugointi C225 vasta NP parantaa syövän vastaista aktiivisuutta C225- NP. Edelleen vahvistaa havaintomme vertasimme estäviä vaikutuksia C225-vasta-aineen kanssa Clone 29.1-vasta-aineen. Sekä Clone 225 ja Clone 29,1 vasta-aineet sitoutuvat EGFR. Kuitenkin, Clone 29,1 toisin Clone 225 sitoutuu hiilihydraattitähde ulkoisen osan EGFR ja ei estä EGF-välitteistä EGFR-signalointi [17]. Hoito HCC827 solujen C225-NP tuotetaan suurin inhiboiva vaikutus (~42%; P 0,05; kuvio 3b), joka oli merkittävästi suurempi verrattuna estävä vaikutus tuotetaan Clone 29,1-NP (-14%) ja muut valvonnan hoitoja (-7% -15%). Nämä tulokset osoittavat konjugointi Clone 225 vasta AuFe NP annetaan ainutlaatuinen ominaisuus, joka parantaa antituumorivaikutuksia EGFR- positiivisia syöpäsoluja. Samanlainen kuin meidän havaintoja, konjugaation anti-ErbB2-vasta-aine pallomainen kulta NP havaittu olevan tappaminen rintasyövän solujen verrattuna anti-ErbB2-vasta-aineen ja NP yksin [18]. Tässä tutkimuksessa sytotoksisuutta tutkittiin funktiona NP koon. Kuitenkin tutkimuksessa ei käsitellä molekyylimekanismiksi tehostetun kasvainsolujen tappaminen. On tärkeää pintatiheys vasta kiinnitetty nanohiukkasia myös ei analysoitu.

(a) HCC827 soluja käsiteltiin C225-NP osoitti merkittävää kasvaimen tappava vaikutus verrattuna hoitoon AuFe, 225-vasta-aineen ja AuFe plus C225-vasta-aine. * P-arvo on 0,05. (B) vertailu estovaikutus tuottama 29,1-NP kanssa C225-NP HCC827 soluissa. C225-NP hoito tuotti enemmän tappava vaikutus kuin teki 29,1-NP hoitoa verrattuna muihin hoitoryhmissä. * P-arvo on 0,05.

225-NP-hoito indusoi autophagy ja apoptoosia EGFR-positiivisten kasvainsolujen muttei EGFR-negatiivisten kasvainsolujen

Tässä määrittämiseksi molekyylimekanismi C225-NP-välitteistä kasvaimen kasvun inhibition suoritimme virtaussytometria-analyyseja C225-NP-käsitelty HCC827 ja -H520 soluja. Kuten kuviossa 4a on esitetty, osa-G1 väestöstä, joka ilmaisee prosenttiosuuden apoptoottisten solujen, kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla hoidon jälkeen C225-NP (9% -20%) on HCC827 soluihin verrattuna kontrolli-lgG-NP Käsiteltyjä soluja (4% -8%). C225-NP käsittelyä merkittävästi lisäsi solujen Saharan G1 väestöstä kuin teki hoidon Clone 225-vasta yksin ekvimolaarinen pitoisuus (kuva S2). Kuten odotettua, ei ollut kasvua solujen määrä sub-G1 väestön C225-NP-käsiteltyjen H520-soluissa verrattuna muihin hoitoihin (kuvio 4a). Näin ollen, C225-NP tehokkaasti indusoi apoptoosia EGFR: ää ilmentävä HCC827 soluissa, mutta ei EGFR null H520-soluissa.

(a) prosentuaalinen osuus NSCLC-solujen käsiteltiin erilaisilla annoksilla (0,6, 1,2 ja 2,4 x 10

10 hiukkasia) IgG-NP tai C225-NP 72 tuntia, joka oli osa-G

1 vaihe solusyklin. Tämä prosenttiosuus määritettiin DNA flow-Sytometrinen analyysi. Käsittelemättömiä soluja ja soluja käsiteltiin C225-vasta-aineella yksinään toimi kontrollina. Annoksesta riippuva nousu määrä HCC827 solujen subG1 vaiheessa havaittiin molemmissa IgG-NP ja C225-NP hoitoja. Kuitenkin kasvu solujen määrä subG1 oli merkitsevästi korkeampi C225-NP käsittelyä kuin IgG-NP (

* P 0,05). Ei ollut merkittävä lisääntyminen subG1 vaihe H520-soluissa välillä IgG-NP- ja C225-NP-hoitoja. (B) havaitseminen GFP-LC3 pisteitä osoittaa autophagy on NSCLC-solut, joita ei käsitelty tai käsitelty C225-vasta-aineen, IgG-NP tai C225-NP (3 x 10

9 hiukkaset) 72 tunnin päälle kammion dioja.

Mittakaava = 50 pm

(c) kvantifiointi solujen määrä GFP-LC3 pisteitä käsittelemättömien ja käsiteltyjen NSCLC soluja. Lukumäärä solujen GFP-LC3 pisteitä oli suurempi C225-NP-käsiteltyjen HCC827 solujen verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmissä. Vuonna H520-soluissa ei ollut kasvua GFP-LC3 pistettä, kun käsiteltiin C225-NP ja verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P-arvo 0,05 vs käsittelemätön kontrolli, C225-vasta-aineen, ja IgG-NP HCC827 soluissa.

Viime aikoina on osoitettu, että kvanttipisteet aiheuttaa koko riippuvainen autophagy ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen [19]. Siksi tutki autophagy tapahtunut NSCLC soluissa hoidon jälkeen C225-NP. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) leimatun ekspressiovektorin LC3 on hyödyllinen väline havaitsemiseen autophagy [20]. On fluoresenssimikroskopialla GFP-LC3-transfektoiduissa HCC827 solut osoittivat diffuusin jakelu GFP-LC3 on käsittelemättömät solut, ja soluja käsiteltiin Clone 225-vasta-aineen yksin ja IgG-NP, kun taas solut, joita käsiteltiin C225-NP osoitti GFP-LC3 pistemäinen pisteitä ilmaisee autophagic ontelot (kuvio 4b). Prosenttiosuus solujen GFP-LC3 pistemäinen pisteitä kasvoi käsittelyn jälkeen C225-NP ja HCC827 soluja (kuvio 4c; P 0,05). Induktio autophagy määritettiin GFP-LC-3 pistettä oli myös merkittävästi lisääntynyt C225-NP-käsiteltyjen H1299 soluissa verrattuna muihin hoitoryhmiin (kuva S3). Sen sijaan, määrä GFP-LC3 pistemäinen pisteitä ei ollut erilainen C225-NP käsitellään H520-solujen ja kontrolliryhmiin (kuvio 4b, c).

tarkastellaan seuraavaksi soluja käsiteltiin C225-NP: n läsnäolon ja ajoitus poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkoutumisen ja LC3 ilmaisun, jotka ovat molekyyli- merkkiaineet, jotka ilmaisevat solujen apoptoosin ja autophagy vastaavasti. PARP pilkkominen oli ilmeistä 24 tunnin käsittelyn jälkeen IgG-NP- ja C225-NP HCC827, mutta ei H520-solut; mutta PARP pilkkominen oli suurempi C225-NP kuin kontrolli-NP HCC827 soluissa (kuva 5a). LC3 proteiini esiintyy kahdessa solujen muotoja, LC3-I ja LC3-II. LC3-I muutetaan LC3-II konjugoimalla fosfatidyylietanoliamiini, ja määrä LC3-II korreloi määrän kanssa autophagosomes [21]. Vuonna HCC827 solut, käsittelemällä C225-NP huomattavasti lisääntynyt määrä LC3-II ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 5a). Lisäksi viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että kertyminen LC3-II on tarkemmin esitetty autophagic vuon, kun läsnä on lysosomaalisen estäjien [22]. Läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorit E-64-d ja pepstatiini A: ta, endogeeninen LC3-II lisäsi hoidon jälkeen IgG-NP ja C225-NP HCC827 soluissa (kuvio 5b). Kuitenkin kasvu LC3-II oli suurempi käsitellyissä soluissa C225-NP kuin IgG-NP. Kasvu LC3-II, kun läsnä oli proteaasi-inhibiittorien on havaittu myös C225-NP-käsiteltyjen H1299-soluja (tietoja ei esitetty). Sen sijaan, määrä LC3-II ei noussut H520-soluihin 72 tuntia hoidon C225-NP verrattuna hoitoon IgG-NP (kuvio 5a). Nämä tulokset osoittivat, että C225-NP aiheuttanut sekä apoptoosin ja autophagy samalla EGFR-ilmaistuna NSCLC-soluja. Yllättäen autophagy havaittiin myös IgG-NP-käsitellyt solut vaikkakin vähemmän kuin on havaittu C225-NP-käsiteltyjä soluja ja oli vähemmän vaikutusta kasvainsolujen tappaminen. Oletamme, että autophagy kynnyksen C225-NP-käsitellyissä soluissa on vahvempi, koska läsnä on anti-EGFR-vasta-aineita ja toimii syöttämällä aktivaattori johtaa aktivoinnin kaspaasi kaskadin ja apoptoottisen solukuoleman. Sen sijaan autophagy IgG-NP-käsiteltyjä soluja todennäköisesti toimii selviytymisen signaalin ja suojaa solukuolemaa. Muita eroja voi olla olemassa, ja me tutkivat parhaillaan mekanismin laboratoriossa.

(a) Cellular proteiinit hajotettiin ilmoitettuina ajankohtina hoidon jälkeen IgG-NP hiukkasia tai C225-NP (0,6 x 10

10 hiukkaset) ja alistettiin Western-blottaus. Vuonna HCC827 mutta ei H520-soluissa, lisääntynyt PARP pilkkominen ja LC3-II havaittiin 48 tuntia ja 72 tuntia käsittelyn jälkeen C225-NP ja verrattuna IgG-NP käsittelyä ja käsittelemätön kontrolli. Intensiteetit määrän LC3-II nauhat olivat puoliksi kvantitoitiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (b) HCC827 soluja käsiteltiin IgG-NP tai C225-NP 68 tuntia, soluja viljeltiin edelleen kanssa tai ilman proteaasi-inhibiittorien [10 ug /ml E-64-d ja 10 ug /ml pepstatiini A: ta (BIOMOL International LP, Plymouth Meeting, PA)] 4 tuntia. Cellular proteiinit hajotettiin ja immunoblotattiin anti-LC3 vasta-aine. LC3-II-proteiinin tasot olivat lisääntyneet proteaasin estäjien läsnä ollessa kaikissa ryhmissä, esiintyminen autophagy. Intensiteetit määrän LC3-II nauhat olivat puoliksi kvantitoitiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health).

analysoimiseksi yhdistyksen välillä C225-NP ja autophagy, päätimme lokalisoinnin C225 -NP ja autophagic vacuoles, käyttäen transmissioelektronimikroskopia (TEM). HCC827 solut käsiteltiin Clone 225-vasta-aineen tai IgG-NP osoitti hyvin vähän autophagic ominaisuuksia, kun taas monet autophagic onteloita havaittiin hoidon jälkeen C225-NP (kuvio 6;

P

0,05). Mielenkiintoista, kun taas suurin osa C225-NP havaittiin sisälle autophagic ja tyhjä vacuoles, jotkut NP havaittiin myös sisällä ytimeksi. Samanlaisia ​​TEM-analyysi, konfokaalimikroskopialla paljasti myös joitakin NP sisällä tumien C225-NP-käsiteltyjä soluja (kuvio 7). Vaikka voisimme osoittaa läsnäolo NP tumassa solujen emme kvantitoimiseksi määrä NP: itä sisällä on solun tumassa. Tämä johtuu siitä, että joitakin rajoituksia, joita esiintyy TEM ja konfokaalimikroskopialla tekniikoita. Esimerkiksi kvantitointiin prosenttiosuus ydinvoiman lokalisointi vaatisi analyysit useiden solujen kautta totaalisoluproteiinia tilavuus, joka on epäkäytännöllistä käyttää niin korkean resoluution tekniikkaa TEM. Kolmiulotteinen paikantaminen NP kanssa konfokaalimikroskopia mutkistaa se, että sen jälkeen kun solun sisäänoton NPS kertyvät perinuclear tilaan. Siksi optinen tarkkuus ei riitä erillisiä NP: itä, jotka sijaitsevat lähietäisyydellä tumakalvoa sytoplasmisella ja ydinvoima sivuilla. Lisäksi konfokaalimikroskopia hyvin kirkkaita kohteita kuten NP voi johtaa vahvan epätarkka signaali, joka voi johtaa virheelliseen tulkintaan kolmiulotteisen jakautumisen nanohiukkasia. Rajoitukset kolmiulotteinen lokalisoinnin NP konfokaali optisella mikroskoopilla on äskettäin osoitettu [23], jossa konfokaalimikroskopia selvästi yliarvioi sytosolin oton Kvanttipisteiden.

elektrofotomikrokäyrien osoittaa äärirakenteessa solun, mukaan lukien nucleus (N), ja HCC827 käsiteltyjen solujen C225-vasta-aineella (0,065 ug /ml), IgG-NP, tai C225-NP (0,6 x 10

10 hiukkaset) 72 tuntia. (I) Käsittelemättömät solut (ii) C225-vasta-aine-käsitellyt solut (iii) IgG-NP-käsitellyt solut (iv) C225-NP-käsitellyt solut (v) suurennettuna alueen pakattuna (iv). Nuoli osoittaa NP, ja nuolenkärki osoittaa autophagosomes joka sisältää jäljellä materiaali ja NP sytoplasmassa (vi) C225-NP havaittu tuman sisällä. Nuoli osoittaa NP tumassa.

Mittakaava = 1 um.

(Vii) Autophagosomes kvantitoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. * P-arvo 0,05 kontrolliryhmään, C225-vasta-aineen ja IgG-NP 48 ja 72 tuntia.

(Ylärivi) konfokaali kuvat osoittavat DAPI värjätään ytimet (sininen) ja C225-NP (punainen ). Nuolet ”keskellä” sarakkeesta kohta C225-NP lokalisoitu ydin. Nuolet sarakkeisiin merkitty ”top” ja ”bottom” viittaavat samaan alue xy tasossa tumaan mutta paikoista ylä- ja alapuolella keskellä ydin, vastaavasti. Sekä ”top” ja ”bottom” kuvia, nuolet eivät enää osoita punaisia ​​täpliä, jotka osoittavat, että punaiset läiskät ”keskellä” kuva ovatkin tumassa. (Alarivi) Cartoon osoittaa z asento kunkin kuvan tumassa, jossa punainen vaakasuora viiva suhteellinen syvyys asema tuman että poikkipinta kuvat (ylärivi) otettiin.

Mittakaava = 10 pm

.

Tulevaisuudessa tutkimuksissa aiomme määrällisesti prosenttiosuus NP läsnä tumassa jonka kolmiulotteinen röntgenkuvaus tomografiakuvantamistekniikoita Kokonaisten solujen riittävän näytteenotto koko ja resoluutio [24] ja määrittää ydinvoiman osuus NP solussa signalointi tapahtumiin.

C225-NP on spesifinen EGFR-ilmentäviä tuumorisoluja ja esihoitoa C225-vasta kumoaa C225-NP-välitteistä kasvainsolun tappamisen

Käytimme tumman kentän heijastuskyky mikroskopia luonnehtia spesifisyyttä C225-NP vuorovaikutukset ja toteutettavuutta optisen havaitseminen keuhkosyövän soluja. Tumman kentän heijastavuus kuvat osoittivat korkea pitoisuus ja sisäistäminen C225-NP HCC827 soluissa 24 tunnin hoidon (kuva 8). Sen sijaan pieni-to-no sisäänotto havaittiin HCC827 soluissa, joita käsiteltiin IgG-NP. Vuonna H520-soluissa, ei ole eroa NP: n sitoutumisen ja välillä havaittiin soluissa, joita käsiteltiin C225-NP ja IgG-NP (kuvio 8).

HCC827 ja H520-solut ympätään kammiossa levyt käsiteltiin IgG-NP tai C225- NP (0,2 x 10

10 hiukkasta). Käsittelemättömät solut toimivat kontrollina. 24 tunnin käsittelyn jälkeen solut pestiin, kiinnitettiin ja kuvat on otettu pimeässä-kentän mikroskopia. Mittakaava on 50 mikronia. Selektiivinen sitominen ja ottoa C225-NP mutta ei IgG-NP havaittiin HCC827 soluissa. Vuonna H520-soluissa ei ollut sitoutumisen ja C225-NP verrattuna IgG-NP.

spesifisyyden määrittämiseksi C225-NP: n sitoutumisen ja esto kokeita. HCC827 soluja esikäsitellään ylimäärällä vapaan Clone 225-vasta-ainetta ennen hoitoa IgG-NP tai C225-NP. Tumma kenttä heijastuskyvyn kuvat osoittivat, että sitova ja internalisaation C225-NP on erityisesti estetty, kun läsnä oli vapaata Clone 225-vasta-ainetta verrattuna soluihin, joita ei ole esikäsitelty vasta-aineen kanssa (kuvio 9a). Olemme edelleen määrätietoisesti onko esto EGF-reseptorin vaikuttaa C225-NP aiheuttama sytotoksisuuden. Vaimennus sytotoksisuuden välittämien C225-NP havaittiin vapaana oleva klooni 225-ainetta, joka oli mukana huomattava vähentäminen C225-NP-välitteisen apoptoosin ja autophagy (kuva 9b, 9c). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös, kun H1299-soluja käsiteltiin C225-NP: n läsnä ollessa Clone 225-vasta-aineen (kuvio S4 a-c). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että C225-NP vuorovaikutuksessa selektiivisesti EGFR: ää ilmentävä NSCLC-solut, ja tuottaa molekyyli erityisiä parempi terapeuttinen vaikutus EGFR: ää ilmentävä NSCLC soluissa.

(a) Oikeassa sarakkeessa näyttää kuvia HCC827 solujen esikäsitelty C225-vasta-aineen (2 ug /ml) 15 minuuttia ennen inkubointia joko IgG-NP (keskimmäinen rivi) tai C225-NP (alarivissä). Solut näytetään vasemmassa sarakkeessa ei ole käsitelty vapaa C225-vasta-aineita. Objektilasit pestiin, kiinnitettiin ja kuvataan useilla tumma-kentän mikroskopia. Sitoutumisen ja C225-NP esti täydellisesti, kun läsnä on C225-vasta-aineen. IgG-NP-käsitellyt solut C225-aineella ei ollut vaikutusta. Mittakaava on 50 mikronia. (B) esto vaikutus sytotoksisuutta C225-NP esikäsittelyssä ilmaisella C225-vasta-aineen. Käsittelyn jälkeen /ilman C225-vasta-ainetta (0,065 ug /ml) 6 tunnin ajan, soluja käsiteltiin joko ei-konjugoidun NP (kulta-rauta: AuFe), IgG-NP tai C225-NP lisää 66 tuntia. Määrä elinkelpoisia soluja, laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P-arvo 0,05 vs AuFe yksin, C225-vasta yksin, IgG-NP tai C225-vasta-aineen ja C225-NP. (C) esto vaikutukset C225-NP-aiheuttaman apoptoosin ja autophagy esikäsittelyssä kanssa C225-vasta-aineen. Solun proteiinien lyysattiin käsittelyn jälkeen C225-NP (0,6 x 10

10 hiukkaset) 66 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa vapaa C225-vasta-aineen (0,065 ug /ml). Proteiinit erotettiin 7,5% tai 15% SDS-PAGE, ja immunoblotattiin anti-PARP ja anti-LC3 vasta-aineita. Anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinin kuormaus- ja siirto. Intensiteetit määrän LC3-II nauhat kvantitoitiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health). C225-NP-välitteisen apoptoosin aktivaatiosta ja autophagy kuten pilkkomalla capase-3, PARP ja LC3-II vastaavasti oli merkittävästi kumottiin vapaana oleva C225-vasta-aineen. Kaikki dark-field kuvat hankittiin käyttäen Leica, DM6000 mikroskooppi varustettu 20 × tumman kentän tavoite ja Xe-lamppu valkoinen valo valaistus.

tiheys 225-vasta kiinni NP on tärkeä 225-NP -välitteisen tuumorisoluja tappava

tutkimiseksi riippuvuus terapeuttista tehoa NP tiheydestä Clone 225 vasta-aineiden NP pinnalla yhteisrahoittaisimme konjugoidun Clone 225 ja ei-spesifisen IgG-vasta-suhteilla 01:00, 01:01, 01:03, 01:10, 01:40 ja 00:01. Keskimääräinen kokonaismäärä vasta kohden NP pidettiin samana, siis, tiheys Clone 225 vasta vähitellen pieneni, kun suhteellinen määrä ei-spesifisen IgG kasvoi. Esimerkiksi suhde 01:00 vastasi alkuperäisen C225-NP konjugaatteja, jotka oli korkein tiheys klooni 225-vasta-aineiden, kun suhde 00:01 vastasi NP: itä vain ei-spesifisiä IgG-vasta-aineita. Suhteellinen tiheys vasta pinnalla NP varmistettiin käyttämällä fluoresenssimäärityksellä (katso materiaalit ja menetelmät).

Hoito C225-NP (1:00 suhde) merkittävästi (

P

1 :1, 1:03, 1:10, 1:40, 0:01) ja C225 ja IgG co konjugoituna NP pintaan. Solut (HCC827, H1299 ja H520) käsiteltiin NP (0,6 x 10

10 hiukkaset) 72 tuntia. Määrä elinkelpoisia soluja, laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P-arvo 0,05 C225-NP (01:00) vs NP: n kanssa 1:01-01:40 ja 00:01 NP HCC827 ja H1299 soluja. H520-solut osoittivat mitään estävää vaikutusta, kun käsitellään NP: n eri suhteilla. (B) määrä GFP-LC3 pisteitä aiheuttama C225-NP (01:00) -käsittelyä päälle HCC827 ja H1299 solut vähenivät muutoksiin C225:IgG vasta-suhde. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * P-arvo 0,05 C225-NP (01:00) vs 1:01-40 yli 01 ja 00:01 NP HCC827 ja H1299 soluja. (C) C225-NP (01:00) -välitteisen vähentäminen fosforyloidun EGFR ja p44 /42MAPK ilmentymistä kumottiin HCC827 ja H1299 soluja käsiteltiin NP: n ja 01:01 ja 01:40 suhde.

Nämä tulokset osoittavat, että NP: itä tuotetaan suurin terapeuttinen vaikutus, kun ne on päällystetty vain C225-vasta-aineen. Vaihtaminen määrä C225-vasta-aineen epäspesifistä kontrollivasta-ainetta pinnalla NP johti vähentynyt syövän vastaista aktiivisuutta. Lisäksi tämä tutkimus osoittaa myös spesifisyyden 225-NP-välitteistä kasvainsolun tappamisen.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että EGFR-kohdistettuja C225-NP selektiivisesti tarttunut EGFR: ää ilmentävä NSCLC-solujen ja tuotetaan parannettu antitumor aktiivisuus indusoimalla sekä apoptoosin ja autophagy. Parannettu kasvaimen soluntappamisaktiivisuutta tuotettu C225-NP johtuu ainutlaatuisia ominaisuuksia myönnetty konjugoinnin Clone 225-vasta-aineen kanssa AuFe NP. Tietääksemme olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että konjugointi plasmonic nanomateriaaleja biologiset lääkkeet, kuten Clone 225 tulokset synergistisiä antituumoriominaisuuksia mukana induktio autophagy ja apoptoosin. Tämä tutkimus avaa uuden paradigman kehittämisessä terapeuttisten aineiden, jotka on suunnattu kohti kyky hallita nanomittakaavan järjestely useiden Abs partikkelin pinnalla, mikä lisää kohdentamista ja terapia.

Viimeaikaiset prekliiniset tutkimukset osoittivat, että yhdistetään EGFR kohdistetut Kolmen riippumattoman kokeen. Kolmen riippumattoman kokeen.