Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Bio-arkistot ovat korvaamattomia resursseja toteuttaa translaation syöpätutkimukseen ja kliiniset ohjelmat. Ne ovat yksi tehokkaimmista työkalut biomolekulaaristen tutkimuksissa kliinisesti selityksin ikäluokat, mutta korkea laatu näytteitä tarvitaan luotettavaa molekyyli- readouts ja toiminnalliset tutkimukset. Tavoitteena meidän oli selvittää vaikutusta syövän kudosiskemiaa aikaa RNA ja DNA laatua, ja että sukupolven potilaasta peräisin ksenoqraftit (PDXs).

Methods

Sata kolmekymmentäviisi keuhkosyöpää näytteet valittiin keskuudessa Institutional

biopankissa

näytteitä. Associations eri lämmintä (kirurginen) ja kylmä (ex-vivo) iskemia aika vaihtelee ja RNA laatua tai PDXs ymppäytyminen hinnat arvioitiin. RNA laatu määritettiin RNA eheyden numero (RINS) arvot. Tuore elävään kudokseen fragmentit istutettiin ihonalaisesti NSG hiirillä ja sarjoittain istuttaa.

Tulokset

RNA: t, joissa on RIN 7 havaittiin 51% näytteestä (70/135), jossa arvot RIN merkitsevästi pienempi (OR 0,08, P = 0,01) näytteistä säilynyt yli 3 tuntia ennen kylmäsäilytys. Korkea laatu DNA-näytteet oli samanaikainen korkea RIN. Kuusikymmentäkolme primaarikasvainten (41 adenokarsinooma) istutettiin yleisen siirteen osuus 33%. Molemmat pitkittynyt lämmin ( 2 tuntia) ja ex-vivo iskemia aika ( 10 tuntia) liittyi pienempään siirteen toimiminen nopeudella (OR 0,09 P = 0,01 ja OR 0,04 P = 0,008, vastaavasti).

johtopäätös

RNA laatu ja PDXs siirteen korko vaikuttivat haitallisesti pitkäaikainen iskemian kertaa. Oikea kudosten kerääminen ja käsittely vähentää virhetaajuus. Kaiken NSCLC Biobanking edustaa innovatiivista komodaalisuudessa jota voidaan menestyksellisesti suoritetaan rutiini kliinisissä, kun tiukat vakiotoimintamenetelmien hyväksytään.

Citation: Guerrera F, Tabbò ​​F, Bessone L, Maletta F, Gaudiano M, Ercole E, et ai. (2016) The Influence of kudosiskemiaa Time RNA Integrity ja potilaasta peräisin ksenoqraftit (PDX) siirteen Luokitus on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) Biopankkiverkosto. PLoS ONE 11 (1): e0145100. doi: 10,1371 /journal.pone.0145100

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, ITALIA

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 28 marraskuu 2015; Julkaistu: 05 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Guerrera et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpäkuolemista [1]. Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin alatyyppi, ja kliininen-patologinen pysähdyspaikan pidetään kultakantaan määritellä potilaiden ennustetta. Kuitenkin oikea määritelmä kliinisen tuloksen jokaisessa konkreettisessa potilas on edelleen ongelmallista [2]. Vaikka viime vuosikymmenen aikana uusia hoitomenetelmiä, kuten molekyyli- hoitoja, on otettu käyttöön, laajan molekyyli–kliininen karakterisointi kunkin sovelletaan edelleen ainoastaan ​​murto-osa potilaista ja rajoittuu sairausvakuutuksen tarjoaja politiikkaa. Lopuksi vaikka parhaat asetukset, tulokset ovat edelleen hyvin synkkä.

On ylivoimainen sopimus, joka edistää kliinisen menestys, yksityiskohtainen kartta patogeneettiset mekanismien ajo keuhkosyövässä on ehdottoman välttämätöntä. Saadakseen potilaan erityinen ja kattava sormenjäljet ​​integrointi useita analyyttisiä säännöt (esim. Genominen, transcriptomic, proteomic) ja asianmukaiset näytteet (esim. Kudosnäytteitä, plasma) [3] vaaditaan. Viime kädessä tietoa, joka syntyy odotetaan nopeasti kääntää henkilökohtainen hoitomenetelmistä. Julkinen bio-säilytyspaikkoja molecularly tunnettu ja kliinisesti selityksin näytteitä uskotaan olevan erittäin arvokas työkalu suunnitteluun ja toteuttamiseen innovatiivisia ja onnistuneita hoitoja.

Kun bio-arkiston toimia liittyy potilaasta peräisin ksenoqraftit, niiden arvot nousevat huomattavasti. Todellakin, PDX mallit edustavat huipputasoa translaatiotutkimuksen [4], ja kun liittyvät Seuraavan sukupolven Yhdistelmät (NGS) analysoi tarjoavat verraton työkalu. Koska nopeus PDX ymppäytyä liittyy useita muuttujia, kuten luonne kasvainten, taudin vaiheeseen ja laadun kudoksen näytteenoton, nopea kudos hankinta ja oikea käsittely tuoretta yksilöitä on ehdottoman kriittinen.

Toward tätä varten siirto kirurginen yksilöitä leikkaussaliin (OR) kirurgiselle patologian teatteri vaatii terävä organisaatio, joka pystyy toteuttamaan tiukkoja Standard Operating Procedure (SOP) yhdennetyn monialainen verkosto [5]. Koska ajoissa siirto rajoittaa ex-vivo iskemia aika, huomattavia ponnisteluja olisi kiinnitettävä parantamiseksi kriittinen vaihe suositaan paras säilyttäminen patologisen näytteen. Tarkoituksenamme oli määritellä vaikutusta syövän kudosiskemiaa aikaa laadusta keuhkosyövän yksilöiden varastoituu bio-arkistoon ja miten tämä voi vaikuttaa molekyyli- suurikapasiteettisten analyysit ja uusien prekliinisissä in vivo malleissa.

Tässä kuvaamme protokolla kudoksen keräys että kuvitella välitön säilyttäminen kirurgisen näytteen käyttäen tyhjiö sulkemista menetelmän sisällä tai laitoksen, jonka jälkeen näyte kuljetuksen ajan 4 ° C: ssa kirurgiseen patologian.

Methods

. Potilaan Kohortti Kuvaus

takautuvasti analysoitiin keuhkosyöpä kerätyt näytteet 135 potilasta, joille tehtiin kirurginen resektio 2010-2012 alkuvaiheen parantava tarkoitusta. Hoidetuilla potilailla ennen leikkausta protokollien (

i

.

e

. Kemoterapia, sädehoito) otettiin huomioon. Sisällä biorepository vastaaviin normaaleihin keuhkokudoksessa, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t), seerumin ja syljen näytteet hankittiin.

B. Tietoinen suostumus

omistettu tietoon perustuva suostumus, varastojen ihmisen näytteitä, yleiseen käyttöön tutkimukseen ja molekyylitason analyysit kehitettiin. Erityistä huomiota on kiinnitettävä seuraaviin kysymyksiin:

Tutkimuksen tarkoituksena

vapaaehtoinen osallistuminen

kokoelma kliinisten ja demografiset tiedot

Tietosuoja ja luottamuksellisuus

hyödyt ja riskit osallistumisen

Re-kontakti seurantaa tietoa ja tutkimustuloksia palaa

suostumuksen peruuttaminen

Toissijainen tutkimushanke

Sample omistuksen ja tekijänoikeuksien

Bio-näytteet ja bio-nesteen varastointi

jokaisen potilaan kirjoilla Biobanking protokolla, kirjallinen suostumus kerättiin ennen leikkausta asetuksella asetetun osallistuvat kirurgille Torakaaliikirurgia osasto ja potilas kirjattiin biopankissa rekisterin. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Aziendan Ospedaliera Universitaria, Citta ’della Salute e della Scienza di Torino.

C. Collection Protocol

Sylki kerättiin ennen leikkausta Oragene • DNA (OG-500) pitkäaikaiseen varastointiin. Verinäytteet (10 cc) olivat perioperatiivisesti hankittu BD Vacutainer putkiin (2 heparinisoitua ja 2 ei-heparinoituihin putket) ja käsitellään. PBMC, plasma ja seerumi, kerättiin ja asianmukaisesta säilyttämisestä. Kudospankin joukkue hälytettiin päivää ennen leikkausta.

näytteet säilyivät ja siirrettiin patologian laboratorioon käyttäen tyhjiöpakkauskoneet ja jäähdytys (VPAC) menettely [6, 7]. Lyhyesti, OR, irrotetut kirurgisista näytteistä asetettiin välittömästi beeta-ray steriloitu muovipusseja ja tyhjiö-sinetöity käyttäen TissueSAFE konetta (Mod. VAC 10, jonka Milestone, Bergamo, Italia, www.milestonemedsrl.com), vakiona menettely meidän Institution [8]. Näytteet tämän jälkeen varastoitiin ja tuonut patologian laboratorioissa, jäähdytettyä (4 ° C) muovinen laatikko, ja edelleen säilytettiin 4 ° C: ssa ennen käsittelyä.

Rutiini histo-patologinen menettelyjä integroitiin Biobanking protokollan (S1 Kuva). Kukin näyte suuntautunut, mitattiin, ja kuvattu, on tietoinen siitä, että keräys ei vaikuttaisi patologinen diagnoosi. Sitten kasvain massat leikattiin irti ja näytteet. Samaan aikaan, normaali keuhkokudoksessa otettiin distaalisesta sivullisten alueen (S2 kuvassa). Tissue fragmentit tallennettu eri mediassa: OCT (Sukura Finetek, Torrance, CA) jäädytetyn kudoksen leikkaus, RNA

myöhemmin

® Stabilization Solution (Life Technologies) ja RNA ja pikajäädytettiin ja sitten säilytetään -80 ° jääkaapissa. Lopuksi, pienet kudosfragmenttien (2x2x2 mm) pantiin jäädyttämistä väliaineessa (59% RPMI, 30% FBS: ää, 10% DMSO: ta, 1% PEN-STREP) ja varastoitiin sitten nestemäisessä typessä. Edustavia diagnostisia näytteitä tehtiin rutiinien histopatologisten jatkojalostuksessa. Aiheeseen liittyvät potilaan informaatiota (varastointi ja kylmäsäilytyksen ajat ja kliiniset, väestönkehitystä ja histopatologiset tulokset) säilytettiin sisällä biopankissa rekisterin.

D. DNA /RNA Extraction ja laadun arviointi

Genominen DNA uutettiin standardin fenoli-kloroformi uuttomenetelmällä [9].

Tissue homogenisoitiin Trizol ja RNA uutettiin kuin valmistajan ohjeiden mukaan. Poistamaan kaikki genomisen DNA-kontaminaation, kun niitä on läsnä, RNA-näytteet alistettiin Deoksiribonukleaasi hoitoon ja uudelleen uutettiin käyttäen fenoli-kloroformilla menetelmällä [10].

kokonais-DNA: n ja RNA kvantitoitiin kanssa NanoDrop 2000c (Thermoscientific) väline ja absorbanssi suhteet 260 nm: ssä /280 nm: ssä ja 260 nm /230 nm kirjattiin. Total RNA: t (1 ui) analysoitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) käyttäen RNA Nano LabChips (Caliper Technologies Corporation, Hopkinton, MA). RNA eheyden numero (RIN) arvot määritettiin empiirinen mittauksia RNA eheys.

E. cDNA synteesi ja qRT-PCR

Kokonais-RNA käänteistranskriboitiin ennen reaaliaikaisen PCR-monistuksen. 1 ng kokonais-RNA: ta käsiteltiin DNAseI rekombinantti, RNaasi-vapaa (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja käänteiskopioitiin käyttäen Superscript Ensimmäisen Strand Synthesis System for RT-PCR-kittiä (Invitrogen Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-qPCR suoritettiin Thermal iCycler (Bio-Rad) käyttäen iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR pyöräily-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 5 minuutin ajan, mitä seurasi 40 sykliä 94 ° C: ssa 10 sekuntia ja 60 ° C: ssa tai 62 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Vahvista vahvistus spesifisyys, PCR-tuotteet alistettiin analyysiin sulamiskäyrä-, lineaarisuus, ja kulmakerroin standardikäyrää käyttäen CFX ohjelmisto (Bio-Rad). Kaikki PCR-määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

mRNA: n ilmentymisen tasot arvioitiin 3 eri siivous geenit: GAPDH, ACTIN ja HUPO. Alukesarjat suunniteltiin käyttäen Primer3 (S1 taulukko).

F. Multiplex PCR

DNA eheys arvioitiin multiplex PCR joukon 5 paria oligoprimers suunniteltiin monistamaan eri DNA-kohteisiin (100, 200, 300, 400 ja 600 emäsparia) (S2 taulukko) [11]. Alukkeet lisättiin 1: 1: 1: 2-suhde, jolloin saatiin PCR-tuotteita yhtä intensiivisesti jälkeen agaroosigeelillä erottamisen. DNA-monistaminen suoritettiin seuraavasti: esiaktivointi 7 min 95 ° C: ssa (1 sykli), jota seurasi 40 sykliä: denaturointi 45 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeiden 50 s ajan 60 ° C: ssa, pidennys 1,30 min 72 ° C: ssa Loppupidennyssykli 15 min 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla (2% agaroosi TBE-puskurissa 1%).

G. Potilaan Johdettu Ksenograftien (PDX) B

NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG) hiiret ystävällisesti toimitti L. Shultz The Jackson Laboratory ja kasvatetaan sisällä Molecular Biotechnology Center (MBC) Animal Resource tiukoin erityiset ja opportunistinen taudinaiheuttajista vapaa (SOPF) olosuhteissa.

eläinten protokolla tässä tutkimuksessa tarkasteli ja hyväksynyt eläinten komitea yliopiston Torino.

Lyhyesti PDXs perustettu käyttämällä tuoretta tai pakastettua patologinen kudosfragmenttien, vasta kun riittävä materiaali oli käytettävissä rutiinidiagnoosimenetelmää ja molekyylitason analyysit. Kasvain-siirteen näytteet leikattiin useisiin 2x2x2 mm kpl (moneen osaan /näyte) täyteen kasvatusliuokseen. Kuudesta kahdeksaan viikon ikäiset NSG nukutettiin ensin (Rompun® 0.05μl /g e Zoletil 1.6μg /g i.m.), ja niiden selkäpuoli steriloitiin (70% etanolia). Ihon viilto (0,3 cm) myöhemmin tehty pitkin selän keskiviivasta retronuchal alue ja pieni tasku luotiin leikatut pois. Useita kasvain-siirre kudosfragmenttien (2-4) siirrettiin kuhunkin ihonalainen taskuun käyttäen tasapäiseksi pihdit. Leikatut reunat suljettiin yhdellä metalliklipsi. Hiiriä tarkastetaan säännöllisesti, kunnes ne tulivat vahtia. Kehoon istutetut Eläimiä pidettiin samaa sukupuolta ryhmiä. Implantin kasvu arvioitiin tunnustelu ja tarvittaessa tuumorimassoja kerättiin ( 1,5 cm

3). Saajaeläimissä tarkastettiin säännöllisesti ja tapettiin varhainen merkki kärsimystä. Tällä korjuu, hiiret lopetettiin CO 2-kammiossa ja tumorgrafts kerättiin histologista arviointia varten, molekyylitutkimukset, uudelleen varttaminen, tai pakastettu nopeasti nestetyppeen.

H. Tutkimus Tulokset ja tilastollinen analyysi

Categorical tiedot esitetään numero (prosentteina,%), jatkuva tiedot esitetään niiden mediaani (kvartiiliväli, IQR).

RIN laskettiin kaikissa yksilöiden sijaislajeina kudoksen säilyttämisen. RIN of ≥7 asetettiin sulku suorittamaan RNA mikrosirujen ilmaisun paneelit ja RNAseq analyysejä.

PDX siirteen pidettiin onnistuneena, kun kasvain massoja syntyi, kun ainakin kaksi kanavaa ja niiden patologisia piirteitä varmistettiin histologisesti ja immunohistokemia. Pearson chi-neliö testi ja Fisherin testiä tarvittaessa käytettiin arvioimaan eroja Siirto tehty ja ei-Siirto tehty ryhmään: kasvain ulottuvuus, histologia, kasvain luokittelua, patologinen TNM vaiheessa resektio tila, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) , läsnäolo mikrovaskulaaristen invaasion ja kirurgiset kesto määritettiin.

vaikutus kudosiskemiaa kertaa RIN laatuun ja PDX siirteen menestys olivat ensisijainen päätepisteiden tutkimuksen.

lämmin iskemia

aika oli tarkoitettu koko kirurgisen kesto ja

ex-vivo (kylmä) iskemia aika

määriteltiin aikataulu välillä hankinnan yksilöiden kirurgisen teatterin ja kun ne syväjäädytysmenetelmillä.

Koska toisen päätepisteen, arvioimme RNA ekspressiotasot ja genomisen DNA: n eheyden satunnaisesti valittu osajoukko yksilöitä (

näyte

komento STATA): valitsimme 3 näytteiden heikkolaatuinen RIN ja 3 laadukkaasti RIN keskenään iskemia aika luokissa. Gene-ilmentyminen tuloksia arvioitiin absoluuttisina ilmentymisen suhteen kvantifiointi jaksoa (Cq keskiarvo). Erot ryhmien välillä tutkittiin Wilcoxonin-Mann-Whitney testi. Vuosi hankinnan analysoitiin myös.

varten tutkimuksemme, me ryhmitelty tapauksissa neljään luokkaan mukaan ex-vivo iskemia kertaa: ≤1 tuntia, 1-2 tuntia, 3-5 tuntia, 6 -9 tuntia ja ≥10 tuntia.

välinen yhteys RNA laadun (RIN of ≥7) tai PDX ymppäytyminen hinnat ja yksilöityneet ryhmät arvioitiin käyttämällä logistista regressiomallia. Välttääksesi mahdollisen sekoittavia vaikutteita, oikaistu monimuuttuja logistinen regressiomalli lukien seuraavat kirurgisen ja patologiset muuttujat suoritettiin: histologisia alatyyppejä (adenokarsinooma viitteenä), kasvain luokittelu (G1 viitteenä), patologinen TNM (vaihe I viitteenä) ja kirurgian kestoa (tuntia, kuten jatkuva).

Ristitulosuhde (OR) ja vastaavat 95%: n luottamusväli (95% CI) on säädetty kunkin mallin. Kaikki tilastolliset analyysit arvioitiin käyttäen STATA (versio 12.1).

Tulokset

. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet

yhteensä 135 keuhkosyöpää näytteet tutkittiin. Taulukossa 1 on yhteenveto niiden kliinisen, kirurgisen ja patologinen ominaisuudet. Mediaani-ikä leikkauksen oli 69 vuotta (IQR 64-75), potilaat olivat useammin miehiä (92, 68%) ja tupakoitsijat (106, 81%). Mediaani kirurginen kesto (IQR 1-3) ja mediaani ex-vivo iskemia aika (IQR 1-6) olivat molemmat 2 tuntia. Mediaani tuumorin koko oli 3 cm (IQR 2-5) ja kasvaimen patologisia TNM vaiheet olivat seuraavat: vaiheessa IA 32 (23%), IB 13 (10%), IIA 21 (15%), IIB 13 (10%), IIIA 37 (27%) IIIB 1 (1%), IV 18 (13%). Adenokarsinooma oli yleisin histologinen alatyyppi (89, 66%), jota seurasi okasolusyöpä (31, 23%), suuret cell carcinoma (7, 5%), karsinoidi (4, 3%), sarcomatoid (2, 2%) , adenosquamous (1, 1%) ja pieni-solu (1, 1%). Mukaan Travis adenokarsinooma luokitus [12], havaitsimme 44 (55%) rauhasrakkuloiden adenokarsinooma, 21 (26%) kiinteää ainetta, 10 papillaarinen, 3 mucinous, 2 lepidic ja 9 NOS. Yhdeksänkymmentäviisi (70%) potilaista toimitettiin lobectomy, 14 (10%) ja bilobectomy, 13 (10%) ja pneumonectomy ja 13 osa-Lobar resektio; positiiviset resektio marginaalit havaittiin 13 tapauksessa (10%, 10 R1 ja 3 R2).

B. RIN Laatu

RIN ≥7 havaittiin 51% näytteestä (70/135): prosenttiosuus näytteistä on korkea RNA laatu mukaan eri ex vivo iskemia aika on esitetty kuviossa 1A. Edustavia elektroferogrammit osoittavat RNA eheyden toimenpiteet 12 edustavan näytteen (kuvio 2, alapaneeli) saatu kallisteta makean pakastetut keuhkosyöpää näytteitä.

A- Suhteellinen näytteiden sopiva geenien ilmentymistä pakat (RNA eheys numero [RIN ] of ≥7) eri ex vivo hankinta kertaa (aika kirurginen poisto ja kylmäsäilytys) varten ≤1 tuntia, 1-2 tuntia, 3-4 tuntia, 5-9 tuntia ja ≥10 tuntia. B- suhde ex-vivo hankinta kertaa ( 1 ja 1-2 tuntia, mistä leikkaaminen kryosäilytys) ja soveltuvuus geenien ilmentymisen pakat (RNA eheys numero [RIN] of ≥7) ja ajanjaksojen 2010, 2011, ja 2012 .

edustaja elektroferogrammit (Agilent 2100 Bioanalyzer) osoittavat RNA eheys mitattuna RNA eheyden numero (RIN) 12 edustavat näytteet (alhaalla).

Käyttämällä monimuuttuja oikaistun malli osoitimme, että näytteet jälkeen varastoitu eri aikavälein näyttää laskua RIN arvosta pian 2 tuntia ex-vivo iskemia aika (kylmäiskemia): 3-4 tuntia (OR 0,08, P = 0,044), 5-9 tuntia (OR 0,15, P = 0,011) ja ≥10 tuntia (OR 0,25, P = 0,022) (taulukko 2). Päinvastoin, kirurginen aika (lämmin iskemia) eivät vaikuttaneet RNA laatuun.

monimuuttuja regressioanalyysimme 135 NSCLC näytteistä.

Ei eroa osuus näytteiden laadukkaita RNA osoitettiin mukaan vuoden varastoinnin, histologian ja kasvaimen: kuvio 1B näyttää prosentteina kasvain yksilöiden kanssa RIN of ≥7 ja ex-vivo hankinta aika, mukaan biopankkitoiminnan hankinnoissa. Kääntäen, korkea pTNM vaihe liittyy alhainen RIN arvojen ( 7, P 0,05).

C. mRNA Expression Level

kaksikymmentäkahdeksan tapausta valittiin sattumanvaraisesti arvioimaan mRNA laatua arvioimalla ekspressiotasot taloudenhoito geenejä. Kuten kuviossa 3A, Cq saadut arvot ovat välillä 18 ja 37. Cq yli 25 kierrosta on havaittu näytteissä, joissa RIN 4, kun taas näytteitä RIN arvoja 4-10, nämä geenit voivat tehokkaasti havaittu vähemmän jaksoa (20.-25 sykliä). Näytteitä pienemmillä ilmaisuja oli ensisijaisesti havaittiin ryhmässä ≥ 3 tuntia ex-vivo iskemia aika.

A- Cq ekspressiotasot taloudenhoito geenien satunnaisesti valitun 28 edustavaa näytettä koko ajan luokat. B- geelielektroforesointi 28 genomista DNA monistetaan multiplex PCR vahvistava eri määriä emästä paires (100 emäsparin, 200 emäsparin, 300 emäsparin, 400 emäsparin, 600 emäsparia).

D. High-Molecular-Weight (HMW) Perimän DNA Integrity

Sama 28 näytettä käytettiin RNA-määritys arvioitiin myös niiden genomisen DNA: n eheyden (kuvio 3B). Läsnäolo bändejä kunkin koon käytettiin korvike laadun DNA, ottaen vahvistus läpi 600 bp: n laadukkaimmat DNA arvo. Näytteitä alemman RIN kullakin aikavälillä ryhmillä oli myös huono DNA laatua. Havaitut DNA laatu näyttää olevan samanlaisia ​​kaikissa valikoimia ex-vivo iskemia aika.

E. PDX engraftmentti

kuusikymmentäkolme primaarikasvainten (41 adenokarsinooma, 18 okasolusyöpä, 3 suurta karsinooma ja 1 sarcomatoid syöpä) istutettiin, joiden kokonaismäärän siirteen osuus 33% (21/63).

Kasvaimet kanssa suuremmat mitat ( 3 cm 23/25 vs 16/38, P 0,001) ja suurempi patologinen vaiheessa (III-IV; 15/25 vs 13/38, P = 0,048) olivat useammin istutettu. Okasolusyöpä (12/25 vs 6/38, P = 0,017) ja kasvaimen resektio marginaalit osallistuminen (R1-R2; 4/25 vs. 1/38, P = 0,064) myös useammin Siirto tehty. Joukossa adenokarsinooma, kiinteä histologia liittyi onnistunut siirteen (6/11 vs. 7/27, P = 0,09). Toisaalta korkea kasvain luokittelu (G3; 12/25 vs. 15/38), positiivinen TIL (16/17 vs. 30/34) ja läsnäolo mikrovaskulaarinen invaasion (4/23 vs. 13/38) oli samanlaisia ​​taajuus Siirto tehty ja ei-Siirto tehty ryhmiä.

Monimuuttujamenetelmät oikaistun malli osoitti korrelaation sekä pitkäaikainen ex-vivo iskemian (kylmäiskemia yli 10 tuntia), laajennettu kirurgiset aika (lämmin iskemia yli 2 tuntia), jossa on alempi siirteen rate (P = 0,047 ja P = 0,008 vastaavasti, taulukko 3).

monimuuttuja regressioanalyysimme 63 NSCLC tapauksissa.

päinvastoin, levyepiteelikarsinooma (OR 8,55; P = M 0,01) ja korkea kasvaimen vaiheesta liittyivät engraftmentissa menestys (OR 8,06; p = 0,053).

Tutkimme lisäksi jäädytetty kasvainnäytteestä PDX siirteen nopeudella. Niistä 21 PDX linjat syntyy, valitsimme 8 kasvaimia ja me istutettiin vastaava ensisijainen jäädytetyt näytteet korjattu leikkauksen ajan. Neljä kahdeksan näytettä (50%) tehokkaasti kasvoi synnyttäen PDX linjan verrattavissa makean johdettua.

Keskustelu

Tavoitteena meidän oli arvioida yleistä kudoksen laatua keuhkosyöpä yksilöt varastoituu bio-arkistoon. Meidän tavoitteena oli myös rajata vaikutuksen iskemia aikaa keuhkosyöpää näytteitä ja kuinka ischemia voisi vaikuttaa molekyyli- suurikapasiteettisten analysoi ja toteutumista prekliinisissä in vivo malleissa.

tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että (1) RIN arvo vaikuttavat merkittävästi ex-vivo iskemia aika, kasvain luokittelua ja pTNM vaiheessa; (2) potilaasta peräisin ksenoqraftit engraftmentissa-rate menestys liittyy myös alhainen ex-vivo iskemia-aika, matala kirurgisen kesto (lämmin iskemia aika) ja squamous-cell histologia; (3) mRNA taloudenhoito geenien ekspressiotasot ja korkean molekyylipainon (HMW) genomista DNA eheys liittyvät kanssa RIN pisteet ja voidaan käyttää toistettavissa biomarkkereita kudoksen säilyttämisen.

Toteuttamalla vakiotoimintamenetelmien (SOP) pystyimme kylmäsäilöä 135 ensisijainen keuhkosyöpä yksilöitä, jonka tavoitteena on tuottaa suuren laadukkaita biorepository, ja vaarantamatta histopatologinen diagnoosi. Jokainen vaihe tässä prosessissa on kriittinen: tämä valottavat rooli joka pelataan järjestäytynyt joukkue ja oikea triage arviointi näytteen patologian huoneessa. VPAC järjestelmä, jo osoittautunut säilyttämiseksi yksilöiden koskemattomuus, hyväksyttiin kultakantaan menettelyn saamiseksi elinkyvyttömiä kudoksia [6-8]. Vaikka rintasyövän kudokset RNA, DNA ja proteiinit voidaan optimaalisesti säilyä 24 [7, 13], me täällä osoitti, että keuhkojen kudokset ovat paljon järkevämpää tällä kertaa. Tämä saattaa viitata, että ex vivo iskemia voi vaikuttaa solujen elävyyden ja molekyylitason tuloksia riippuen alkuperästä kudoksia.

On yleisen hyväksynnän tärkeydestä käyttää ehjän RNA geeniekspressioanalyysissä ja RIN on 7 pidetään hyväksyttävänä, koska raja-arvon näytteissä soveltuvuus [14,15]. Meidän arkistossa, 51% näytteistä osoitettiin RIN 7, jossa on suotuisa kehitys vuosien varrella. Tämä tulos on siinä välissä, joita on raportoitu eturauhassyövän (60-81% [16]), paksusuolen syöpä (80% [17]), ja ne on kuvattu haimasyövän (40% [14]). Mahdollisia selityksiä Erot voivat johtua heterogeenisyys solun sisällön, erilaisia ​​hajoamista eri kudoksissa, operaattoreiden välinen vaihtelu, jne. Vaikka useat tekijät voivat vaikuttaa lisätyn RNA: n hajoamista, olettaen, että ex-vivo iskemia-aika on tiukasti kytketty jossa aste RNA: n hajoamisen vaikuttaa järkevältä. Täällä, lasku RNA laatu havaittiin 3 tunnin kuluttua kirurgisen resektion. Tämä tulos on yhdenmukainen aiemman raportin kurssin hajoamista keuhkokudoksessa: havaitsivat laski nukleiinihappo vakautta 5 tunnin kuluttua leikkauksesta [18]. Samoin rajoitettu ex-vivo iskemia aika näytti korreloivan optimaalisen RNA eheyden paksusuolensyöpä (6-16 tuntia) [17], rintasyöpä (3 tuntia) [19], eturauhassyöpä (2 tuntia) [16, 20] ja in haimasyöpä kudoksessa. Pitkä kirurgiset aika ei vaikuttanut RNA eheys, kuten voisi odottaa, jos kudosiskemiaa oli ainoa selitys RIN laskua. Lisäksi mRNA ekspressiotasot ja HMW genomista DNA eheys näytti osittain liittyvän RIN pisteet, mutta osoitti vähäinen laatua supistettuna korreloi ex-vivo iskemia aika. Tämä voi pelastaa suuri osa 49% näytteistä, joissa on pienempi RIN ( 7%), koska niitä voidaan käyttää klassisen molekyyli tekniikoita. Tutkimuksessamme korkea pTNM vaiheet olivat myös yhteydessä alennettu RIN pisteet. Eräs mahdollinen selitys voisi olla, kirurgisen käsittelyn ja myöhemmin RNaasi vapautumisen oletetuissa muodossa Bertilsson ja Harveer koskevat eturauhassyövän [20].

Patient johdettuja xenopatients pidetään nykyään erittäin luotettava esikliinisiä hiiren mallia. Perustaminen tätä työkalua edellyttää kehittyneitä tutkimuslaitoksia ja otetaan käyttöön teknisiä ja logistisia haasteita, ja on äskettäin arvioitu keskeinen tietolähde biologisen materiaalin ja terapeuttisesti merkityksellisinä informations [21, 22]. Käyttö tuoreiden ja pakastettujen primaarikasvaimen näytteet peräisin

Biopankkiverkosto

resurssi osoittaneet tämän lähestymistavan toteutettavuuteen, varsinkin kun eri ponnisteluja koota hyvin integroitu verkko. Ryhmämme hyödyntää suoraan istutusta hiirillä, ihon alle, tuoreita tai pakastettuja kudosfragmenttien peräisin kirurgisesti resekoitu potilaista. Siirrostumi- osuus 33%, jopa olennaisesti verrattavissa jo nyt todistettu (25% -35%) muiden ryhmien ihonalaisen ympäristössä [23-25], johti hieman pienempi kuin odotettavissa, ottaen merkittävä taipumuksesta NSG mallin luuytimen. Kuitenkin havaitsimme melko korkea prosenttiosuus (29%) Siirto tehty adenokarsinoomien, joka yleensä johtaa vähemmän altis istutusta verrattuna okasolutuumoreita. Iskemia aika vaikutus siirteen korko osoitti, että pitkäaikainen kirurginen (lämmin) iskemia aika on negatiivisesti yhteydessä onnistumiseen siirteen [25] eikä koko (lämmin ja kylmä) aikaa. Muut ominaisuudet vaikuttavat engraftmentissa rate: kasvain ulottuvuus ( 3 cm), patologinen vaiheen (III-IV) ja levyepiteelikarsinooma vaikuttavat siirteen toimiminen nopeudella, mikä viittaa siihen, että myös sisäisten biologisten ominaisuuksien kasvain rooleja määriteltäessä PDX onnistunut sukupolvi. Sama pätee PDX sukupolven pakastetusta kasvain yksilöitä. Kyky uudelleen tuottaa 50% PDX linjan kylmäsäilytetyt materiaaleista viittaa siihen, että eri elementit voivat vaikuttaa kudoksen biologia; kuitenkin korostaa mahdollisuutta palata jälkikäteen kudoksessa biopankissa ja pick erityisiä molekyylitason määritelty kasvaimia, jotta saadaan aikaan sopiva PDX viiva hyödyllinen

ad hoc

prekliinisissä näytöstä.

Toistaiseksi ei tutkimuksia on tehty vertaamalla eri kudosten säilöntämenetelmät. Kuitenkin ottaen huomioon sen kyky säilyttää solun morfologiassa, epitoopin eheys ja nukleiinihapot vakautta, käytimme VPAC järjestelmä kudosten varastointiin, spekuloivat positiivinen vaikutus myös PDX siirteen hintaan.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sukupolvi on keuhkosyöpä biorepository on toteuttamiskelpoinen lähestymistapa ja edellyttää monimutkaisia ​​verkko ponnisteluja järjestettävä eri biolääketieteen osaamista. Siten hyvin suunniteltu protokollat ​​ovat välttämättömiä asianmukaisen ja tehokkaan

biopankkien

. Patologia, onkologit, rintakehä kirurgit, sairaanhoitajat, biologien, teknikot, epidemiologeja ja lääketieteen tilastotieteilijöitä on tehtävä yhteistyötä yhteisen operatiivisen työnkulun varmistaa ei vain laadukkaita yksilöitä, mutta myös asianmukaista käsittelyä protokolla, asianmukaisesta säilytyksestä, tiedonkeruun, epidemiologiset analyysit tehokkaasti koordinoituja hankkeita .

Lähestymistapamme tarjoaa biorepository on arvokas näytteenoton laajan tutkimuksen NSCLC. Erityisesti korkea laatu RNA ja DNA: ta voidaan käyttää seuraavan sukupolven sekvensointi tekniikoita, kuten RNAseq, Whole Exome Yhdistelmät ja Whole Genome Sequencing, mutta myös nukleiinihappoja laatuvaatimuksiltaan voidaan pelastaa vakio geenien ilmentymisen tekniikoita (eli määrällinen käänteiskopioijaentsyymin polymeraasiketjureaktioilla). Lopuksi saatavuus tuoreiden ja pakastettujen kasvain näytteet edustavat arvokkaita resursseja luodakseen potilaasta peräisin ksenoqraftit (PDX) linjat [26].

Johtopäätös

Molekyyli kerrostuneisuus NSCLC vuonna viime aikakauden ”tarkkuus medicine” on korostanut ylläpitämisen sarjassa laadukkaita yksilöitä integroida kliinisen patologinen tietoa. Näitä varastoja voidaan tutkia by Next-Generation Sequencing ja ovat pakollisia stabiilien prekliinisen malleja.

Kirjoittajat raportoivat toistettavissa ja luotettava lähestymistapa tuottaa kudospankkia varten NSCLC, ja tarjoamme näyttöä kriittinen arvo yksilöitä laatua myöhempää tutkimuksiin. Todellakin, RNA laatu ja PDX siirteen korko vaikuttivat haitallisesti pitkäaikainen iskemia aika, ja siten, oikea, seurataan ja hyvin järjestettyjä kudoksen keräys voidaan vähentää virhetaajuus.

Kaiken NSCLC Biobanking edustaa innovatiivista toimintatavat, voivat onnistuneesti toteutetaan rutiini hoitopaikassa kaikissa toimielimissä mutta vaatii validoitu vakiotoimintamenettelyt.