Krooninen sairaus

tiivistelmä

par-reseptori 4 (PAR4), jäsen G-proteiiniin kytkeytyvien reseptorien perheeseen, äskettäin raportoitu olevan heikompaa ilmentymistä mahasyövän ja ruokatorven levyepiteelikarsinooma syöpä, mutta lisääntynyt ilmentyminen etenemisen aikana eturauhasen syöpä. Apilatekijän 2 (TFF2), pieni peptidi ilmentyy jatkuvasti mahan limakalvon, näyttelee suojaava rooli palauttamista mahalaukun limakalvon. Altered TFF2 ilmentymistä liittyy myös kehitystä ruoansulatuskanavan syöpä. TFF2 on todettu voivan edistää solujen vaeltamiseen kautta PAR4, mutta roolit PAR4 ja TFF2 edistymisessä peräsuolen syöpä ovat vielä tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa, ilmentymisen taso PAR4 ja TFF2 kolorektaalisyövässä kudoksissa mitattiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä (n = 38), western-blottauksella (n = 38) ja kudossiruina (n = 66). MRNA ja proteiini ekspressiotasot PAR4 ja TFF2 olivat huomattavasti lisääntynyt kolorektaalisyövässä verrattuna Hyväksytty noncancerous kudoksissa, erityisesti positiivinen imusolmuke ja huonosti eriytetty syöpiä. Kolorektaalikarsinoomasolulinjaa LoVo osoittivat lisääntynyt vaste TFF2 arvioimana soluinvaasiota upon PAR4 ilme. Kuitenkin, kun väliintulon PAR4 ilmaisun, PAR4 positiivinen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa HT-29 oli vähemmän reagoivien TFF2 solujen invaasiota. Genomisen bisulfiitti sekvensointi osoitti hypometylaatio PAR4 promoottorin peräsuolen syövän kudoksissa ja hypermetylaation normaalin limakalvon ehdotti alhainen metylointi promoottorin korreloi lisääntyneen PAR4 ilmaisua. Yhdessä tulokset osoittivat, että sääteli ilmentymä PAR4 ja TFF2 usein tapahtuu peräsuolen syövän kudoksissa, ja että yliekspressio PAR4 voidaan johtui promoottori hypometylaatio. Vaikka TFF2 edistää hyökkäystä aktiivisuutta LoVo solujen yli-ilmentävät PAR4, ja tämä vaikutus oli merkittävästi vähentynyt, kun PAR4 oli knockdowned HT-29-soluja. Meidän tulokset ovat hyödyllisiä jatkotutkinnan toiminnot ja molekyylitason mekanismit proteinaasi-reseptorit (PAR) ja Trefoil tekijä tekijät (TFFs) etenemisen aikana peräsuolen syöpä.

Citation: Yu G, Jiang P, Xiang Y, Zhang Y, Zhu Z, Zhang C, et ai. (2015) Lisääntynyt ilmentyminen par-reseptori 4 ja apilatekijän 2 Human peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10,1371 /journal.pone.0122678

Academic Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2014; Hyväksytty: 24 helmikuu 2015; Julkaistu: 13 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Kiinan National Natural Science Foundation (81160302, 31270835), Kiinan Academy of Sciences (KJZD-EW-L03), Yunnan Science and Technology Osasto Basic Research Foundation (2011FZ109) ja valtion Key Laboratory of geenivarakeskus ja Evolution (GREKF11-13).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etenemistä peräsuolen syöpä on monivaiheinen prosessi mukana polygenetic muutoksiin prooncogenes ja /tai kasvaimen synnyssä, ja poikkeava epigeneettiset geenisäätelyn voi johtaa epänormaali kasvu pahanlaatuisten kasvainten [1,2]. PAR on seitsemän-transmembraaninen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR), joka käsittää neljä jäsentä nimetty PAR1, PAR2, PAR3, ja PAR4 [3]. Sillä on kyky hajoamisen soluväliaineen proteiinien, PAR toimia signaalin osallistuvien molekyylien kasvaimen solujen vaeltaminen, invaasio ja metastaasi [4]. PAR1, joka laajasti ilmaistuna syövissä, edistänyt kasvaimen synty ja invaasio rintasyövän solujen ja peräsuolen solujen [5,6]. PAR2, yli-ilmentynyt eturauhassyöpä, edistää eturauhassyövän solumigraation [7]. Päinvastoin, PAR2 osoitti myös kasvaimen suojaava rooli ihon karsinogeneesissä [8]. PAR3 löydettiin munuaisten ja maksan syöpä [9,10]. PAR4 ilmentyminen on vahvasti havaittu keuhkoissa, kilpirauhasen, haiman, ohutsuolen ja kiveksissä Northern blot [11]. Ilmaisulla ja mahdolliset roolit PAR4 kasvainten synnyssä ovat vielä tuntemattomia. PAR4 ilmentyminen oli poissa normaalissa paksusuolen limakalvolla, mutta esiintyi selvää värjäytymistä dysplastic ja colorectalous limakalvon. PAR4 mRNA havaittiin 10: ssä 14 (71%) ihmisen paksusuolen ja peräsuolen karsinooman solulinjoissa [12].

Trefoil tekijät (TFFs), laajasti ilmaistuna limakalvon ruoansulatuskanavassa, on pieni ja kompakti peptidit, jotka sisältävät yhden tai kaksi apiladomainia. Kolme läheisesti TFFs tunnetaan ihmisen, pS2 (TFF1), spasmolyyttinen polypeptidin (SP tai TFF2), ja suoliston apilatekijän (ITF tai TFF3) [13]. TFFs peptidit arvellaan edistävän limakalvon paranemista ja palauttaminen nojalla edistämällä solujen vaeltamiseen ja tukahduttaa apoptoosin [14]. TFFs osallistuvat myös kasvaimien syntyyn [15]. TFF2, joka sisältää kaksi apiladomainia, uskotaan olevan pääasiallinen cytoprotective apilatekijän vatsassa, ja ilmentymistason TFF2 vapautettiin vuonna mahahaava ja syöpäkudoksessa [16]. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa, TFF2 on osoitettu edistävän epiteelin solujen vaeltamiseen ja haavan parantumisen kautta PAR4 mukana fosforylaatiota ERK1 /2 [17], mutta yksityiskohtia toiminnot ja molekyylitason mekanismeja PAR4 ja TFF2 etenemisessä maha kasvain ei ole löydetty . Tutkimuksessa osoitimme ilmentymistasojen PAR4 ja TFF2 korotettiin peräsuolen syövän kudoksissa verrattuna sovitetun noncancerous limakalvon ja ylössäätöä ilmentymistä PAR4 peräsuolen syöpiä voidaan johtui promoottori hypometylaatio. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että TFF2 edistää peräsuolen syöpäsoluinvaasiota aktivoimalla PAR4.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksynyt Kunming Institute of Zoology, The Kiinan tiedeakatemia ja Kunming Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin potilailta ennen näytteiden saamista tälle tutkimukselle.

Tutkittavat

Kaikkiaan 38 potilasta, joilla peräsuolen syöpä, joka suostui osallistumaan Tutkimuksessamme allekirjoitti tietoisen suostumuksen muodostavat ja sai toimintansa ensimmäinen Affiliated sairaala Kunming Medical University. Peräsuolen näytteet saatiin peräsuolen kasvain kudosten ja viereisen ei-syöpä alueita, jotka olivat vähintään 6 senttimetrin päähän kasvain. Kerätyt kudokset edelleen todentaa histologia ja jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kolorektaalisyöpä kudos microarray edustaa 66 kolorektaalisyövissä kanssa niiden ei-neoplastisia resektio marginaalit rakennettu [18] olivat Shanghai päihittää Biochip Center (Shanghai, Kiina).

RNA ja polymeraasiketjureaktio (PCR) B

RNA ja ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja reaaliaikaisella PCR: llä, käytetyt alukkeet olivat seuraavat: alukkeet PAR4 (147 bp tuote) olivat 5′-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3′ (käänteinen ); for TFF2 (74 emäsparin tuote) olivat 5’- CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3′ (reverse); ja sisäisen valvonnan Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH, 107 emäsparin tuote), olivat 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’ (reverse). Sen jälkeen, kun RT-PCR: llä, amplikonien ja PAR4, TFF2 ja GAPDH ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeeleissä, värjättiin etidiumbromidilla ja sitä tarkasteltiin ultraviolettivalotus.

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin jatkuva fluoresenssin Detector (Opticon Monitor, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). PCR-reaktiot PAR4, TFF2 ja GAPDH suoritettiin käyttämällä SYBR Green reaaliaikainen PCR-kittiä (TaKaRa, Dalian, Kiina) ja kunto: alkudenaturaatio 95 ° C 1 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C: ssa 15 s, ja 72 ° C: ssa 20 s. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena. Ei templaattikontrollien (no cDNA PCR) ajettiin havaitsemiseksi epäspesifinen tai genomivahvistuksen ja pohjamaali dimerisaatio. Fluoresenssi käyrä analyysi suoritettiin käyttäen Opticon Monitor ohjelmistoa. Suhteellinen määrällinen arviointi PAR4 ja TFF2 ekspressiotasoja suoritettiin E-menetelmällä ja ilmaistiin suhteena transkriptio PAR4 (TFF2) GAPDH tuumorikudokseen. Identiteettien RT-PCR ja reaaliaikainen PCR-tuotteet varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Tissue immunohistokemia

Tissue immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla autoklaavissa 121 ° C: ssa 5 min. Liuottimella leikkeitä esi-inkuboida estää seerumia, ja sitten niitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli anti-ihmisen PAR4 vasta-ainetta (C-20, 1: 1200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ja anti-ihmisen TFF2-vasta-ainetta (P -19, 1: 800; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), tässä järjestyksessä. Spesifinen sitoutuminen havaittiin streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-määritys kit (Maxim, Fujian, Kiina). Jaosto oli vastavärjättiin Harris hematoksyliinillä. Suora mikroskooppinen skooppivalokuvat siepattiin käyttäen Leica DFC320 kamera ohjaa Leica IM50 ohjelmisto (Leica, Saksa). Kohdat inkuboitiin vuohen normaalia IgG toimi negatiivisena kontrollina. Vasta-aineiden spesifisyys ja PAR4 ja TFF2 vahvistettiin esi-inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa niiden antigeenien (Santa Cruz) kanssa 20-kertaisen molaarisen ylimäärän antigeenin vasta-aineita. Pre-inkubointi PAR4 ja TFF2 antigeenin johti puuttuessa immunoleimaus.

immunohistokemiallinen värjäys arvioitiin semi-kvantitatiivisesti mittaamalla sekä Värjäytymisen intensiteetti (0, 1, 2 tai 3) ja laajuus värjäytymistä (0, 0%, 1, 0-10%, 2, 10-50%, 3, 50-100%). Peli varten voimakkuus ja laajuus värjäys kerrottiin antaa painotetun pistemäärän kussakin tapauksessa (suurin mahdollinen, 9). Jotta tilastollinen analyysi, painotettu pistemäärät jakaa kahteen ryhmään, joissa tulokset 0-3 pidettiin negatiivinen ja 4-9 positiivinen [20].

Western blot

Tissue homogenisoitiin Radioimmunoprecipitaion Assay Buffer (Sigma), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit (Sigma). Proteiinipitoisuus määritettiin proteiinin määrityskittiä (Bio-Rad). Näytteet (joka sisältää 30 ug proteiinia), ladattiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) geelillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle. Kalvot tämän jälkeen tukittiin 3% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja inkuboitiin asianmukaisten PAR4 ja TFF2 ensimmäisen ja toisen vasta-aineita, vastaavasti. Proteiinit visualisoitiin Super Signal reagenssit (Pierce, Rockford, IL, USA).

bisulfiittimodifiointi sekvensointi

Genominen DNA peräsuolen syöpiä ja ei-neoplastisia kudoksia eristettiin Universal Genominen DNA Extraction Kit (Takara) ja bisulfiitti-muunnettava CpGenome Fast DNA Modification Kit (Chemicon). PAR4 promoottorisekvenssejä monistettiin bisulfiitti-muunnetaan DNA: sta PCR, puhdistettiin agaroosigeeleistä ja subkloonattiin pMD19-T Vector (TaKaRa). Kunkin näytteen 19 yksittäistä kloonia sekvensoitiin tunnistaa metyloidut sytosiinit. PCR-sekvenssit (eteen ja taakse) varten PAR4 olivat 5′-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 ’ja 5′-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3’.

Soluviljely

Ihmisen peräsuolen syövän solulinjat LoVo ja HT 29 oli American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Lövön solut yli-ilmentävät PAR4 (LoVo-PAR4) ja solut transfektoitu mock plasmidilla (LoVo-mock) valittiin 800ug /ml G418 mukaan meidän aiemmin tutkimuksia [17]. LoVo-soluja viljeltiin Hamin F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä, ja kasvatettiin kosteutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C. Hoidon 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC; Sigma, 95 St. Louis, MO, USA), solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 60 mm lautasen . 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 10 uM 5-atsa-dC. DMSO käsiteltiin rinnakkain kontrollina. Yhteensä solut kerättiin 72 tunnin jälkeen ja lisäksi 5-atsa-dC ja suoritettiin RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi.

knockdovvn PAR4 HT-29-solujen

Lentivirus ilmentävät shRNA tuotettiin kotransfektoimalla PAR4 shRNA plasmideja pCMV-dR8.2 dvpr ja pCMV-VSVG pakkaus plasmidit 293FT soluihin. HT-29-solujen, jotka oli transfektoitu pGIPZ-shPAR4 tai tyhjän vektorin pGIPZ valittiin 5 ug /ml puromysiiniä tuottaa HT-29-shPAR4 ja HT-29-pGIPZ, vastaavasti. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota on täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä.

Cell invasion

Invasion toimintaa LoVo- mock ja LoVo-PAR4 soluja ja HT-29-pGIPZ ja HT-29-shPAR4 soluissa in vitro mitattiin käyttäen Matrigel invaasiomääritys [21]. InnoCyte Cell Invasion Assay Kit (8 um huokoskoko, Calbiochem, Merck) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 5 x 10

4 solut LoVo-mock, LoVo-PAR4, HT-29-pGIPZ ja HT-29-shPAR4 lisättiin vastaavasti ylempään kammioon, ja alustaa, joka sisälsi yhdistelmä-TFF2 lisättiin alempaan kammioon. Inkuboinnin jälkeen 24 tuntia 37 ° C: ssa, solususpensio heitettiin pois ja ylempi kammio insertit asetettiin hellävaraisesti solujen värjäysliuosta 30 minuutin ajan. Seuraavat alempaan kammioon sisältävät solut irrotetaan soluja inkuboitiin vielä 30 minuutin ajan samoissa olosuhteissa. Lopuksi 200 ui irronneen solut siirrettiin kaksinkertaisesti kuoppiin 96-kuoppaisella levyllä, ja mitataan fluoresenssi viritysaallonpituudella 485 ± 10 nm ja emissioaallonpituutta 520 ± 10 nm. Samaan aikaan, alempi kammio solut valokuvattiin kautta konfokaali laser fluoresenssimikroskopiaan.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 11.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) . Chi potenssiin testi (taulukot 1 ja 2) ja Mann-Whitneyn U teksti käytettiin merkitystä korrelaatioita PAR4 ja TFF2 ilmaisun ja kliinisiä patologisia parametrit. Erot numerotietoja välillä pariksi ryhmien arvioitiin käyttämällä pariksi Studentin testiä. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettu tasolle

p

0,05.

Tulokset

Ilmaisu tasot PAR4 ja TFF2 mRNA lisääntyi kolorektaalisyövässä kudoksissa

ilmentyminen PAR4 ja TFF2 mRNA peräsuolen kudoksista tutkittiin RT-PCR. Kuten on esitetty kuviossa 1A, RT-PCR suoritettiin vastaaviin normaaleihin ja syövän näytteet valitaan satunnaisesti neljä potilasta ja tulokset osoittivat, PAR4 ja TFF2 mRNA-tasoja merkittävästi lisääntynyt syöpien kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin.

(EN) vastaaviin normaaleihin (normaali) ja syöpä- (syöpä) kudoksissa kukin potilaista valitaan satunnaisesti analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen PAR4- ja GAPDH- spesifisiä alukkeita (n = 4). Sen jälkeen kun näytteet normalisoitiin GAPDH tasolle, mRNA-tasot PAR4 ja TFF2 lisättiin merkittävästi syöpä verrattuna normaaleissa kudoksissa; (B) Western blot kudosta lysaatit neljä tapausta ja peräsuolen syöpä (syöpä) ja niitä ympäröivillä ei-neoplastisten limakalvon (normaali). Ilmentyminen aktiini toimi kontrollina. Merkittävä ylössäätöä ilmentymistä PAR4 havaittiin syöpäkudokset toisin kuin niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin (n = 4).

Seuraavaksi tutkimme tasot PAR4 ja TFF2 mRNA 38 peräsuolen syöpänäytteissä reaaliaikaisella PCR: llä. Ylös-säädellään of PAR4 ja TFF2 peräsuolen kasvaimet olivat 58% (22 38) verrattuna sovitetun epäneoplastisis- limakalvoa. Olemme edelleen tutki kliinistä merkitystä sääteli ilme klinikalla patologisten tietojen. Oli huomattavia eroja PAR4 ja TFF2 mRNA ilmaisun imusolmuke invasiivisia kasvaimia vs. ei-invasiivisia kasvaimet (

p

= 0,016 ja

p

= 0,002, chi neliö tekstiä). Ero havaittiin myös huono-eriytetty kasvain versus hyvin- /moderated- eriytetty kasvaimet (

p

= 0,002 ja

p

= 0,020, chi potenssiin teksti) (taulukko 1). Yksityiskohtiin, PAR4 mRNA lisääntyi 2,2 (1,8, 4,7) (neljänneksessä 25, kvartiili 75) taittuu 14 imusolmuke invasiivisia kasvaimia ja 1,0 (0,4, 2,0) taittuu 24 non-invasiivisen kasvaimet (

p

= 0,008, Mann-Whitney U Text); TFF2 mRNA lisääntyi 3,2 (2,2, 7,6) taittuu 14 imusolmuke invasiivisia kasvaimia ja 0,8 (0,3, 1,5) taittuu 24 non-invasiivisen kasvaimet (

p

= 0,001, Mann-Whitney U Text) (kuvio 2A). Lisäksi PAR4 mRNA lisääntyi 2,3 (2,0, 3,8) taittuu 16 huono-eriytetty kasvaimia ja 0,9 (0,5, 1,2) taittuu 22 hyvin- /moderated- eriytetty syöpiä (

p

= 0,001, Mann -Whitney U Text); TFF2 mRNA lisääntyi 2,2 (1,8, 5,8) taittuu 16 poor- eriytetty kasvaimia ja 0,8 (0,3, 1,5) taittuu 22 hyvin /moderoitu jaksottamattomat syöpiä (

p

= 0,002, Mann-Whitney U teksti) (kuvio 2B).

Expression of PAR4 ja TFF2 mitattiin 38 peräsuolen syöpäpotilaiden reaaliaikainen PCR. (A) PAR4 mRNA lisääntyi 86% (12 14) imusolmukkeesta invasiivisia kasvaimia ja 42% (10 24) ei-invasiivisia kasvaimia. TFF2 mRNA lisääntyi 93% (13 14) imusolmukkeesta invasiivisia kasvaimia ja 38% (9 24) ei-invasiivisia kasvaimia. Oli merkitsevä ero PAR4 (p = 0,008) ja TFF2 (p = 0,001) mRNA: n ekspression välillä imusolmuke invasiiviset kasvaimet ja ei-invasiivisia kasvaimet; (B) PAR4 mRNA lisääntyi 88% (14 16) on huono eriytetty syöpiä ja 36% (8 22) hyvin /valvottu-eriytetty syöpiä. TFF2 mRNA lisääntyi 81% (13 16) on huono eriytetty syöpiä ja 46% (9 22) hyvin /valvottu-eriytetty syöpiä. Lisäksi on huomattava ero PAR4 (p = 0,001) ja TFF2 (p = 0,002) mRNA: n ilmentymisen välillä on huono eriytetty ja hyvin /valvottu jaksottamattomat syövät; Tarkoittaa kertaiseksi kasvainkudoksessa suhteellisen ei-neoplastisen peräsuolen kudos on esitetty. Mediaani (neljänneksessä 25, kvartiili 75) käytettiin vertaamaan poimuihin PAR4 (TFF2) lisäys imusolmuke invasiivisia kasvaimia ja ei-invasiivisia kasvaimia, ja huono-eriytetty syöpien ja hyvin- /valvottu-eriytetty syöpiä. Lisääntynyt poimuihin ” 1″ määriteltiin ”lisääntynyt”, kun taas lisääntynyt poimuihin ”≤1” määriteltiin ”ei kasvanut”.

Proteiini tasojen PAR4 ja TFF2 korotettiin kolorektaalikarsi- syöpä kudoksiin

PAR4 ja TFF2 proteiinit olivat alhaiset tai huomaamatta normaalissa peräsuolen limakalvoa western blotting-analyysi (kuvio 1 B). Kuitenkin potilaiden kudosten kanssa kolorektaalisyöpä, sen jälkeen kun näytteet normalisoitiin p-aktiini tasot, merkittävä voimistunutta ilmentymistä PAR4 ja TFF2 havaittiin peräsuolen syövän kudoksissa verrattuna sovitetun pahanlaatuisissa kudoksissa (kuvio 1 B).

Seuraavaksi suoritettiin immunohistokemiallinen värjäys analysoida proteiinin ekspressiotasot PAR4 ja TFF2

in vivo

. Ei ollut lähes mitään ilmentymistä PAR4 ja TFF2 epäneoplas- peräsuolen epiteelisolujen, mutta ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt pahanlaatuisten peräsuolen epiteelisolujen. Lisäksi suurin osa PAR4 ja TFF2 värjäytymistä pahanlaatuisten paksusuolen ja peräsuolen syövän näytteet olivat paikallisia sytoplasmassa (kuvio 3). Vuonna 66 analysoiduista näytteistä, PAR4 ilmentyminen säädellään ylöspäin 57 (86,1%) ja peräsuolen syövän näytteitä verrattuna vastaaviin normaaleihin limakalvo. TFF2 ilmentyminen säädellään ylöspäin 46 (69,7%) ja peräsuolen syöpä näytteitä. Lisäksi erot PAR4 ja TFF2 proteiinin ilmentymisen välillä on huono eriytetty ja hyvin /moderated- eriytetty kasvaimet olivat merkitseviä (

p

= 0,017 ja

p

= 0.022, chi potenssiin teksti) (Taulukko 2).

(A) immunohistokemiallisella värjäyksellä PAR4. (A) normaali peräsuolen limakalvolla; (B) peräsuolen syöpä kudos numero yksi potilas. (C) peräsuolen syöpä kudos numero kaksi potilasta; (B) immunohistokemiallisella värjäyksellä TFF2. (D) normaali peräsuolen limakalvolla; (E) peräsuolen syöpä kudos numero yksi potilas; (F) peräsuolen syöpä kudos numero kaksi potilasta. Bar, 100 pm kunkin paneelin, ja 50 pm varten sisäkkeet.

yli-ilmentyminen PAR4 lisääntynyt hyökkäystä aktiivisuutta LoVo solujen aiheuttama TFF2

Aikaisemmat tulokset ovat osoittaneet, että TFF2 edistää solujen muuttoliike kautta PAR4 [17]. Tutkia roolia PAR4 in TFF2 aiheuttama soluinvaasiota, tutkimme vaikutus TFF2 LoVo-mock ja LoVo-PAR4 solujen invaasio toimintaa. Kuten kuviossa 4A, 200 nM TFF2 ei aiheuttanut hyökkäys aktiivisuutta LoVo-mock soluissa Matrigel määrityksessä. Kuitenkin se lisäsi merkittävästi hyökkäyksen aktiivisuutta LoVo-PAR4 soluissa. Konfokaalimikroskopia osoitti myös, että hyökkäys aktiivisuutta LoVo-PAR4 soluissa oli 2 taittuu korkeampi kuin LoVo-mock soluja stimuloidaan TFF2 (kuvio 4B).

(A) Cell invaasio stimuloidaan TFF2 testattiin käyttämällä InnoCyte solu invaasiomääritys. Invasion of LoVo-mock ja LoVo-PAR4 solut stimuloidaan 200 nM TFF2 testattiin, BSA ja 10 nM EGF kontrolleina. Tulokset osoittivat merkittävää eroa on 200 nM TFF2 LoVo-mock ja LoVo-PAR4 solujen invaasio aktiivisuutta. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; (B) Invasion of LoVo-mock ja LoVo-PAR4 solut stimuloidaan 200 nM TFF2 tutkittiin Confnocal laser fluoresenssimikroskopialla.

PAR4 Knockdown HT-29-solujen vähentynyt soluinvaasiota aktiivisuutta reagoivat TFF2

vieressä määritti TFF2 soluihin hyökkäystä toimintaa PAR4- knockdowned HT-29-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 5A, 200 nM TFF2 huomattavasti hyökkäyksen aktiivisuus HT-29-pGIPZ solujen Matrigel määrityksessä, mutta sillä ei ollut vaikutusta PAR4-knockdowned soluja. Konfokaalimikroskopia Tulokset osoittivat myös, että hyökkäys HT-29-pGIPZ on enemmän kuin 3-4 taittuu HT-29-shPAR4 kun soluja stimuloidaan TFF2 (kuvio 5B). Tulokset viittasivat siihen, että TFF2 aiheuttama invasion oli PAR4-riippuvainen.

(A) Cell invaasio stimuloidaan TFF2 testattiin käyttämällä InnoCyte solua invaasiomääritys. Invasion aktiivisuus HT-29-pGIPZ ja HT-29-shPAR4 soluja käsiteltiin 200 nM TFF2 arvioida hyökkäyksen aktiivisuutta, BSA: ta ja 10 nM EGF käytettiin kontrolleina. Siellä oli merkittävä ero 200 nM TFF2 HT-29-pGIPZ ja HT-29-shPAR4 solujen invaasiota. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, * p 0,05; (B) Invasion solut HT-29-pGIPZ ja HT-29-shPAR4 stimuloitiin 200 nM TFF2 tutkittiin Confnocal laser fluoresenssimikroskopialla.

Palauttaminen PAR4 ilmentymisen käsittelemällä 5-atsa-DOXY peräsuolen LoVo soluissa

Kuten raportoitu Zhang tutkimuksen paperi, PAR4 ei ilmaistu ihmisen koolonisyöpäsolulinja Lövön [17]. Valottaa mahdollisia molekyylimekanismin taustalla PAR4 sääteli ilmaisu kolorektaalisyövässä kudoksissa LoVo soluja käsiteltiin 5-atsa-dC, demetyloivan agentti. Kuviossa 6A ja 6B, RT-PCR: llä ja Western blot osoitti, että ilmentymistaso PAR4 palautettiin sen jälkeen 3 päivää hoidon 5-atsa-dC, ja ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat HT-29-ilmentävien PAR4 käytettiin kontrollina.

LoVo, ei- PAR4 ilmentäviä soluja, inkuboitiin 5-atsa-dC (10 uM) tai DMSO: ta 72 tunnin ajan, ja solut käytetään erottamaan mRNA: ta ja proteiinia. (A) Ilmaisu taso PAR4 mRNA tutkittiin RT-PCR; (B) Ilmaisu taso PAR4 tutkittiin proteiinin Western blot. Kolorektaalikarsi- syöpäsolulinja HT-29 ilmaistaan ​​PAR4 käytettiin positiivisena kontrollina.

Analyysi metylaatio taso promoottorialueen PAR4 kolorektaalisyövässä kudoksissa

Koska demetylaatio 5- atsa-dC johtaa palauttamiseen PAR4 ilmaisun LoVo soluissa, vertasimme metylaatio tasoon PAR4 promottorista peräsuolen syövän ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Käyttämällä genominen bisulfiitti sekvensointi menetelmä, tutkimme 19 CpG sivustoja 380 emäsparin alueen PAR4 promoottori. Kolme kolorektaalisyöpä näytettä korkea PAR4 ilme näkyy lausutaan hypomethylations, ja niiden keskimääräinen metylaatio hinnat 19 CpG sivustoja on 22,1%. Kuitenkin hypermetylaation löytyi sovitettu ei-syöpä kudoksia, jotka oli matala ilmentymä PAR4, ja niiden keskimääräinen metylaatio hinnat oli 41,6% (kuvio 7A). Korkea PAR4-ilmentyminen HT-29-solut näkyvät hypometylaatio sen edistämiseksi, kun taas ei-PAR4 ilmentymisen LoVo soluilla hypermetylaation (kuvio 7B).

(A) PAR4 promoottori metylaatio analysoitiin DNA kolmesta peräsuolen syöpä ja niiden yhteensovitettujen ei-neoplastiset kudokset. (B) PAR4 promoottori metylaatio DNA peräsuolen syöpäsolujen linjat, LoVo ja HT-29. Keskimäärin metylaatio kussakin analysoitu CpG sivusto PAR4 promoottori osoitetaan perustuu bisulfiitti sekvensointi 19 yksittäisiä klooneja.

Keskustelu

Ero ilmaus PAR4 ja TFF2 havaittiin erilaisten kasvainten , kuten haimasyöpä, keuhkosyöpä ja mahasyöpä, ja tämä ero ilmentyminen liittyi kasvainsolujen kasvua, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi [11,22-24]. Koska PAR tärkeitä rooleja erilaisten syöpien ja niistä on tullut houkutteleva kehittää uusia hoitomuotoja tavoitteet [25]. Tässä tutkimuksessa, esitimme joitakin perustavaa laatua tietoja, että ekspressiotasot PAR4 ja TFF2 lisättiin merkittävästi peräsuolen syövän kudoksissa verrattuna sovitetun noncancerous kudosten, erityisesti metastaattisen positiivisia imusolmukkeita ja huonosti eriytetty kasvaimia. Valtaosa PAR4 ja TFF2 kolorektaalisyövässä kudoksissa on lokalisoitu sytoplasmassa, kuten on esitetty Immunovärjäys. Kasvu PAR4 ilmaisun kolorektaalisyövässä oli yhdenmukainen Gratio tutkimustulokset [12], jossa PAR4 puuttui normaalissa paksusuolen limakalvon epiteelisolujen, mutta korkea koolonadenokarsinooma kudoksissa, ja 71% paksu- ja solulinjoissa vahvaa immunovärjäyksen PAR4 [12]. Päinvastoin, PAR4 ilmentyminen väheni mahasyövän, ruokatorven levyepiteelikarsinooma syöpä ja keuhkojen adenokarsinooman kudoksissa verrattaessa suhteellisen normaali limakalvo [17,26,27]. Tulokset osoittivat, että toiminta PAR4 oli erilainen kasvaimen progressioiden. Koska tuntemattomia tekijöitä saattaa olla mukana poikkeava ilmentymä PAR4, on paljon töitä täytyy ymmärtää mekanismia PAR4 sääntelyn ennen kuin se voi olla potentiaalinen kohde lääke syövän hoidossa.

TFF2, pääasiallisena cytoprotective apilatekijän, lähinnä ilmaistu vatsassa, ja ilmentyminen väärin säädellystä aikana mahalaukun syövän etenemisessä [16,23,28]. Jiang tutkimuksessa, TFF2 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt mahalaukun syöpä, mikä viittaa rooliin TFF2 kuin tuumorisuppressori mahasyövän ja etäpesäkkeiden [29]. Paksusuolen limakalvo, TFF2 ilmaistiin matalan intensiteetin, mutta ilmaus TFF2 edistymisessä paksusuolen syövän ei ollut selvää, [30]. Tutkimuksessamme, oli mielenkiintoista tietää TFF2 ekspressio lisääntyi myös syöpäkudoksiin verrattuna suhteellisen normaalin paksusuolen ja peräsuolen limakalvolle. Furthermor tuloksemme osoitti, että rekombinantti ihmisen TFF2 voisi aktivoida PAR4 edistää LoVo-PAR4 ja HT-29-pGIPZ soluinvaasiota aktiivisuutta, mutta ei ollut merkittävää invaasio vaikutusta LoVo-mock ja HT-29-shPAR4 soluissa. Tulokset koostuvat kanssa aiempaan toteamukseen TFF2 aktivoitu PAR4 edistää epiteelisolujen muuttoliike kautta ERK1 /2 fosforylaatio [17]. Fosforylaatiota ERK1 /2 tarvitaan solujen vaeltamiseen ja on keskeinen TFF välittämä signalointi [14,31]. Siksi tosiasiat että ylössäätöä ilmentymä PAR4 ja TFF2 kolorektaalisyövässä, niiden co-lokalisoitu solulimassa ilmaisun patters, ja TFF2 edistää solujen vaeltaminen ja invaasion kautta PAR4, mikä viittaa vuorovaikutusta PAR4 ja TFF2

in vivo

ja

in vitro

kautta tuntemattoman mekanismin tutkitaan edelleen.

Transkription hiljentämiseltä promoottori hypermetylaation on viime aikoina tullut yksi tärkeimmistä mekanismeista mahasyövän kehittämiseen [32]. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että 5-atsa-dC, demetyloivan agentti, kunnostettu PAR4 ilmentyminen LoVo soluissa. Olemme edelleen analysoineet metylaatiostatuksen sytosiini CpG sijaitsee ei-CpG saaria PAR4 promoottorialueen käyttämällä peräsuolen syövän kudoksissa ja solulinjoissa erilaisilla PAR4 ekspressiotason. Promoottori hypermetylaation vahvistettiin normaalissa peräsuolen limakalvon alhaisen ilmentymisen PAR4. Kuitenkin promoottori hypometylaatio löydettiin kolorektaalisyövässä kudoksista korkealla ilmaus PAR4. Tulokset osoittivat, että promoottori hypometylaatio voi edistää transkriptiota PAR4. Zhang et al havaitsivat, että menetys PAR4 ilmaisun mahasyövistä voi johtua hypermetylaatiota PAR4 promoottori [33]. Mutta PAR4 vähentynyt ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma ei liittynyt promoottori metylaatio [2727]. Nämä seikat ehdotti, että promoottori metylaatio taso oli vain yksi tekijä, joka johtaa ero PAR4 ilmaisun, ja sen ilmentyminen säädeltiin useita tekijöitä.

Yhteenvetona tutkimus osoitti, että PAR4 ja TFF2 ilme olivat usein sääteli peräsuolen syöpä ja lisääntynyt ilmentyminen liittyi kliinisesti aggressiivista fenotyyppi. DNA hypometylaatio johtaa sääteli ilmentyminen PAR4 kolorektaalisyövässä kudoksissa. Osoitimme myös PAR4 edistänyt peräsuolen syövän solujen maihinnousu reagoivat TFF2. Nämä tulokset auttavat meitä ymmärtämään molekyylitason mekanismi TFFs ja PAR karsinogeneesissä ja etenemisessä kolorektaalisyövissä.

Kiitokset

Tätä työtä tukivat avustuksia Kiinan National Natural Science Foundation (81160302, 31270835 ), Kiinan Academy of Sciences (KJZD-EW-L03), Yunnan Science and Technology Department Basic Research Foundation (2011FZ109) ja valtion Key Laboratory of geenivarakeskus ja Evolution (GREKF11-13).