Krooninen sairaus

tiivistelmä

β-lapatsoni, pääkomponenttina etanoli ote

Tabebuia avellanedae

kuori, on lupaavia hoitava lääke erilaisten kasvainten, mukaan lukien keuhkosyöpä, suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Ensimmäisessä osassa Tässä tutkimuksessa havaittiin, että apoptoottinen solukuolema, keuhkosyövän soluja suuria pitoisuuksia β-lapatsoni välitti aktivoitunut pro-apoptoottinen tekijä JNK ja vähentynyt aktivoituminen solun eloonjäämisen /lisääntymiseen tekijät PI3K, AKT, ja ERK. Lisäksi, β-lapatsoni toksisuutta korreloi positiivisesti ilmentymistä ja toimintaa NAD (P) H kinoni oksidoreduktaasi 1 (NQO1) kasvainsoluissa. Toisessa osassa, huomasimme, että FDA: n hyväksymä steroideihin tulehduskipulääke sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteet sulindaakkisulfidilla ja sulindaakkisulfoni, lisääntynyt NQO1 ilmaisun ja aktiivisuus keuhkoadenokarsinooma solulinjat CL1-1 ja CL1-5, joka on alhaisempi NQO1 tasoilla ja alhaisempi herkkyys p-lapatsoni hoitoa kuin A549-solulinjoja, ja että inhibitio NQO1 joko dikumarolityyppisten hoitoon tai NQO1 siRNA pudotus esti tämän sulindaakki aiheuttama kasvu β-lapatsoni sytotoksisuutta. Lopuksi sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteet synergistisesti lisätä syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on β-lapatsoni ensisijaisesti lisäämällä NQO1 aktiivisuutta ja ilmaisun, ja nämä kaksi lääkkeet voivat aikaansaada uudenlainen yhdistelmähoitoa keuhkosyövässä.

Citation: Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) Sulindaakilla yhdisteet helpottaminen sytotoksisuus β-lapatsoni by Up-asetuksella NAD (P) H ki- oksidoreduktaasi Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10,1371 /journal.pone.0088122

Editor: Gergely Szakacs, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 05 tammikuu 2014; Julkaistu: 05 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Kung et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia (NSC 101-2320-B-002-020-MY3, NSC 98-2320-B-715-001-MY3 (YPC) ja NSC 101-2320-B-002-008) National Science neuvosto , Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

β-lapatsoni, luonnollinen o-naf alun perin saatu

lapacho

puita Etelä-Amerikassa, on lupaava antituumorivaikutuksen eri kasvainsoluihin [1] – [6] ja on ollut testattu anti-kasvain kandidaattilääkettä vaiheen I /II /III kliinisissä tutkimuksissa yhdessä muiden kemoterapia huumeet [1], [7]. Sen syövän vastaista aktiivisuutta ajatellaan johtuvan kahden elektronin pelkistys on β-lapatsoni katalysoi NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi (NQO1, DT-diaforaasi), käyttäen NAD (P) H tai NADH elektronilähde [ ,,,0],1], [8], [9]. Läsnäollessa NQO1, β-lapatsoni läpikäy vähennys epävakaa hydrokinonin, joka nopeasti läpi kaksivaiheinen hapetus takaisin kantayhdisteen, ylläpitävät turha redoksijaksossa ja johtaa sukupolven reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sisältäen superoksideja [ ,,,0],8], [10] – [12]. Nämä reaktiiviset lajit voivat hapettaa tioliryhmien mitokondrion potentiaalin siirtymisen huokosesta monimutkainen, mikä lisää mitokondrion sisemmän kalvon läpäisevyyttä, vähentää mitokondrion kalvon depolarisaation, ja vapautumista sytokromi c: n, mikä johtaa solun kuolemaan [13], [14]. Koska NQO1 on korkeammin ilmaistu eri kiinteiden syöpien kuin normaaleissa kudoksissa [15], β-lapatsoni voidaan tappaa selektiivisesti nämä syöpäsoluja. Lisäksi korkeammat NQO1 ilmentymistä tai aktiivisuutta syöpäsoluissa voi tehdä niistä herkempiä p-lapatsoni. Jotta voitaisiin lisätä kliinistä tehoa β-lapatsoni, monia menetelmiä on tutkittu lisätä NQO1 ilmentymistä tai aktiivisuutta syöpäsoluissa [3], [5], [16] – [19].

Sulindaakilla on Food and Drug Administration (FDA) -hyväksytty ei-steroidiset anti-inflammatorinen lääke (NSAID) ja nivelrikon, selkärankareuman, kihdin, tai nivelreuma [20] – [23]. Sen anti-inflammatorinen vaikutus johtuu sen estämällä prostaglandiinien [24], jotka aiheuttavat tulehdusta ja kipua kehon. Sulindaakki on myös todettu estää syklisen guanosiinimonofosfaatin-fosfodiesteraasin, entsyymiä, joka estää normaalin apoptoosin signalointireitin, ja tämä estävä vaikutus mahdollistaa apoptoottisten signalointireitin edetä yksimielisesti, jolloin apoptoottisen solukuoleman ja vähentämiseen erilaisten kasvainten, mukaan lukien rintasyöpä, ruokatorven, mahan, eturauhasen, virtsarakon, munasarjojen ja keuhkojen syövät [25], [26]. Ihmisillä, sulindaakki alennetaan aktiivisen anti-inflammatorisen metaboliitti, sulindaakkisulfidi läpikäy 2-vaihe uudelleenhapetuksen ja sulindaakkisulfoni [27], [28]. Kaikki kolme yhdisteiden on osoitettu olevan chemoprotective vaikutuksia. Paksusuolen syöpä, sulindaakki on käytetty lisäämään syöpää ehkäisevistä vaikutuksista joidenkin reagenssien tai jännityksiä, mukaan lukien bortetsomibilla [4], vetyperoksidia [29], ja oksidatiivisen stressin [30]. Tärkeää on, sulindaakki ja sen metaboliitit ilmentymisen moduloimiseksi multioxidative entsyymien, mukaan lukien glutationi-S-transferaasit sekä NQO1, joista jälkimmäinen on keskeinen säätelijä β-lapatsoni-indusoituvaa solukuolemaa syöpäsoluissa [28], [31], [32], ja sulindaakki saattaa siksi olla synergistinen antituumorivaikutuksen kanssa β-lapatsoni.

Keuhkosyöpä, suuret syöpä maailmassa, on nyt suurin syy syöpään liittyvien kuolemien [33] – [35]. Mukaan raportin, Department of Health, Executive Yuan, ROC (Taiwan) julkaisi vuonna 2010 kuolleisuus keuhkosyöpään on 20%, keveiden luettelo kaikista syöpään liittyvien kuolemien. Kustannukset terveydenhuollon hoitoon keuhkosairaus kasvaa valtavasti vuosittain ja uhkaa hukuttaa julkisen terveydenhuollon [36]. Jotta saataisiin parempi kohde terapia, tutkijat ovat yrittäneet tunnistaa keskeiset erot keuhkosyövän solujen ja normaalien keuhkojen soluja, kuten mutaation tai yliekspressio geenien, kuten

EGFR, ras

, ja

VEGF

[37] – [39]. Valitettavasti nykyiset solunsalpaajahoitojen keuhkosyövän puuttuu riittävä spesifisyys, tehoa, ja hoito heterogeenisuus on myös iso ongelma [40]. Siksi tarvitaan pikaisesti uusia terapeuttisia lääkkeitä tai uusia yhdistelmiä lääkkeitä tehokkaiksi keuhkosyöpää terapiassa. Koska NQO1 yli-ilmentyminen on havaittu sekä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjassa [41], [42], β-lapatsoni voisi olla mahdollinen hoitava lääke keuhkosyövässä. Kuitenkin jotkut keuhkosyöpäsoluissa heikompi NQO1 ilmentymistä tai aktiivisuutta ja saattaa siksi olla resistenttejä p-lapatsoni myrkyllisyys. Tässä tutkimuksessa, ensin tutkitaan suhdetta β-lapatsoni myrkyllisyys ja NQO1 tasoilla NSCLC solulinjoissa, määritetään sitten signalointireitin mukana solukuoleman aiheuttama korkeita pitoisuuksia β-lapatsoni. Käytimme myös pienempiä pitoisuuksia β-lapatsoni tutkia onko sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteiden voisi helpottaa syövän vastaisen vaikutuksen β-lapatsoni lisäämällä NQO1 ilmentymisen tai aktiivisuuden keuhkosyöpä solulinjoissa alhainen NQO1 tasoilla ja tarkistanut tärkeyttä NQO1 tässä yhdistelmähoidossa . Olemme havainneet, että myrkyllisyys β-lapatsoni liittyi tasoon NQO1 ekspression tai aktiivisuuden keuhkosyövän soluille ja että korkeat pitoisuudet β-lapatsoni tappoi solut vähentämällä fosforylaatio PI3K, AKT, ja ERK ja aktivoimalla JNK. Lisäksi sytotoksisuuden alhaisia ​​pitoisuuksia β-lapatsoni kasvoi yhdessä sulindaakki ja sen metaboliittien, menetelmällä, jossa voimistumista ekspressiota tai aktiivisuutta NQO1.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen keuhkosyöpää solulinjoissa CL1-1, CL1-5, ja A549, viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 mg /ml streptomysiiniä (kaikki Gibco). Solulinjat olivat lahja Dr. PC Yang, National Taiwan University Hospital [43], jonka laboratoriossa CL1-5 solut valittiin vanhempien CL1-1 soluista enemmän metastaattinen potentiaali käyttäen siirtokuoppaan järjestelmää.

Cell Elinkykymääritykset

CL1-1, CL1-5, tai A549-solut (1×10

4) ympättiin 24 h 37 ° C: ssa 96-kuoppaiselle viljelylevylle, sitten alistettiin nälkään 14 h RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 2% vasikan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 mg /ml streptomysiiniä. Seuraavat 6 h esikäsittelyn keski- tai ilmoitetun pitoisuuden sulindaakin tai sen aineenvaihduntatuotteiden (kaikki Sigmalta), soluja inkuboitiin 12 tuntia tai ilman ilmoitetun pitoisuuden β-lapatsoni in jatkuva läsnäolo sulindaakin tai sen metaboliittien, ja sitten solujen elinkelpoisuus arvioitiin.

kaksi solujen elinkelpoisuuden määritykset käytetty. Kristallivioletti- fluoresenssi, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min, värjättiin 0,4% kristallivioletilla 15 minuutin ajan, ja pestiin H

2O, sitten 50% happoa alkoholia käytetään liuottamaan sitoutuneen kiteen violetti ja OD 550 nm: ssä mitattiin ELISA-lukijalla. MTT-määrityksessä, 10 ui MTT: tä (0,5 mg /ml) (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tuntia, sitten formatsaanipitoisuus tuote liuotettiin 100 ul: aan DMSO: ta 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja OD 570 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla.

akridiinioranssia (AO) Värjäys

Solut (5×10

4) viljeltiin kannessa-dioja 24 kuopan levyjä inkuboitiin 14 tuntia RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 2% vasikan sikiön seerumia, esi-inkuboitiin sulindaakkisulfidin 6 h, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman β-lapatsoni 24 tuntia, minkä jälkeen ne heti kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT), ja värjättiin 10 minuuttia 0,5 ml: AO (10 mg /ml PBS: ssa) (Sigma). Kun useita PBS pesun jälkeen solut tutkittiin Olympus BH-2 -käänteismikroskoopissa varustettu fluoresenssin kiinnitys.

Detection of Apoptosis ja mittaus solunsisäisen kalsiumin tasot

apoptoosin havaitsemiseen, soluja ( 1×10

6) hoidettiin 3, 6 tai 9 h 5 uM β-lapatsoni, sitten pestiin jääkylmällä PBS: llä, trypsinoitiin 0,05% trypsiiniä, 0,02% EDTA, värjättiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa anneksiini V-FITC (10 ug /ml) (Strong Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Taiwan), ja analysoitiin virtaussytometrialla FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson).

mittaamiseksi solunsisäisen kalsiumin tasoa, soluja inkuboitiin 10 min ajan 37 ° C: ssa 2 mM Fluo-4 /AM (Molecular Probes), pestiin PBS: llä, trypsinoitiin ja analysoitiin FACSan virtaussytometrialla käyttäen FL1H parametrin.

Western Blot Analyysit

Käsitellyt solut lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 10 ug /ml proteaasi-inhibiittorin (Sigma), ja sitten lysaattia sentrifugoitiin 10000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti kerätään immunoblottauksella. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmällä, ja näytteet, jotka sisältävät 20 ug proteiinia erotettiin 10 tai 12% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin Immobilon-P -kalvoille 2 h 200 V (Millipore) on Trans-Blot Sähköforeesisiirto solu. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan RT: ssä 5% kuorittua maitoa PBS-0,2% Tween 20 (PBS-T) ja inkuboitiin sitten 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa vasta-aineilla NQO1 (Cell Signaling), PI3-kinaasin tai p-PI3-kinaasi (Millipore), AKT tai p-AKT (Epitomics), ERK, p-ERK, JNK, tai p-JNK (Cell Signalling), GAPDH (Genetex) tai β-aktiini (Abcam) laimennettuna 1:1000 1% BSA: ta. Pesun jälkeen 30 minuuttia huoneenlämpötilassa PBST: llä, kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Perkin-Elmer, Boston, MA; 1:5000 laimennos PBST), sitten sitoutunut vasta-aine havaittiin käyttäen ECL Western blotting reagenssia (Amersham), kemiluminesenssin havaitaan käyttämällä Fuji Medical röntgenfilmille (Tokio, Japani) ja kvantifioidaan geelikuva analyysit Image Pro -ohjelmistoon. Intensiteetti kaistalla jaettiin että β-aktiini tai GAPDH (lastaus valvonta) ja tätä arvoa normalisoida että nähdään ilman hoitoa.

RNA Häiriöitä

Solut transfektoitiin ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (siNeg) tai siRNA kohdistaminen NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) käyttäen XtremeGene siRNA-transfektioreagenssia (Roche), sitten tasot ilmoitetaan transkriptien ja proteiinit tutkittiin reaaliaikainen PCR (käyttäen alukkeita taulukossa S1 ), RT-PCR, ja Western blotting, ja sitten solut käytettiin kokeita.

Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin Trizol (Invitrogen) ja käänteistranskriptoidaan cDNA käyttäen SuperScript II käänteistranskriptio (Invitrogen), sitten PCR suoritettiin käyttäen seuraavia alukkeita: NQO1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC, R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) tai GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC, R, GCCAGTGGACTCCACGAC).

NQO1 Activity Pitoisuus

mittaamiseksi endogeenisen NQO1 aktiivisuus solu-uutteet, solut pestiin PBS: llä ja sonikoitiin lyysipuskuria (25 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT). Määritys Reaktioseos (lopullinen tilavuus 200 ui) sisälsi 25 mM Tris, pH 7,5, 0,01% Tween 20, 0,7 mg /ml BSA: ta, 40 uM 2,6-dikloori (DCPIP, Sigma), 5 uM FAD, 200 uM NADH: ta, 50 ug solu-uutetta, ja joko 10 uM dikumarolityyppisten tai keskipitkällä. Väheneminen DCPIP absorbanssin 600 nm puuttuessa tai läsnä dikumarolityyppisten mitattiin 5 sekunnin välein 60 sekunnin ajan ja aktiivisuus ilmaistaan ​​suhteellisen aktiivisuuden, kanssa tarkastustoimen annetaan arvo 1.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kvantitatiiviset tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolme erillistä koetta. Erot ryhmien tutkittiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA Scheffen testi, jossa p 0,05 (* tai #), p 0,005 (**) tai p 0,001 (***) harkitaan tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

NQO1 Expression ja toiminta Lung Cancer Cells korreloivan β-lapatsoni myrkyllisyys

Jos haluat vertailla sytotoksisuutta β-lapatsoni eri keuhko- syöpäsoluja, kolme solulinjat, CL1-1 , CL1-5, ja A549, inkuboitiin 12 h β-lapatsoni (0-10 uM), sitten solujen eloonjäänti mitattiin kristallivioletilla värjäämällä. Kuten kuviossa 1A on esitetty, käyttäen 1-5 uM β-lapatsoni, A549-solut osoittivat merkitsevästi alhaisempi eloonjääminen kuin CL1-1 ja CL1-5 soluja, mutta ei ollut merkittävää eroa eri-soluihin käyttäen 10 uM β- lapatsoni. Koska NQO1 aktiivisuus on korreloi positiivisesti β-lapatsoni sytotoksisuutta rintasyövän solulinjoissa [8], [9], [44], tutkimme, onko herkkyys eri keuhkosyövän solulinjat P-lapatsoni toksisuus liittyi solunsisäistä NQO1 ilme. Luvut 1B-D osoitti NQO1 aktiivisuutta (Fig. 1 B), NQO1 RNA-tasot (Fig. 1 C), ja NQO1 proteiinin tasot (Fig. 1 D) on CL1-1, CL1-5, ja A549-soluja ja osoittivat, että tavanomaisissa kulttuuri olosuhteissa kaikki kolme arvot olivat korkeimmat A549-soluja ja pienin CL1-5 soluissa. Sitten verrataan herkkyys A549, CL1-1, ja CL1-5 solujen käsittely 0-10 uM β-lapatsoni 3, 6, 12, tai 24 tuntia käyttäen kristalliviolettia värjäystä ja totesi, että prosentuaalinen selviytyminen CL1- 5-soluissa oli suurempi kuin CL1-1 solujen kaikki 4 ajankohtina, ja että A549-solut osoittivat pienin prosentuaalinen säilyminen (kuvio 1E). Nämä tulokset vastasivat hyvin solunsisäistä NQO1 tasot kolmessa solulinjoissa, koska herkkyys p-lapatsoni oli korkeampi solujen korkeammat NQO1 tasoja. Nämä tulokset osoittivat, että NQO1 taso tai aktiivisuus on avainasemassa in β-lapatsoni sytotoksisuuden keuhkosyöpä solulinjat.

(A) prosentuaalinen selviytyminen keuhkosyövän solulinjat CL1-1, CL1-5, ja A549 . Soluja käsiteltiin 0-10 uM β-lapatsoni 12 tuntia, sitten solujen elinkelpoisuus määritettiin kristalliviolettimäärityksellä värjäys määritys ja ilmaistiin prosentteina arvon viljelmät ilman β-lapatsoni. (B-D) NQO1 aktiivisuudesta (B), NQO1 RNA ekspressiotasot (C), ja NQO1 proteiinin ekspressiotasoja (D) kolmessa keuhkosyövän solulinjoja kasvatettiin normaaleissa viljelyolosuhteissa. (E) prosenttiosuus eloonjäämistä A549-solut (vasen paneeli), CL1-1 solut (keskiosa), ja CL1-5 solut (oikea paneeli) inkuboitiin ilmoitetun pitoisuuden β-lapatsoni 3, 6, 12, tai 24 h tutkitaan kristalliviolettia värjäys ja ilmaistaan ​​prosentteina säilyminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tulokset ovat keskiarvo ± SD 3 itsenäisestä kokeesta, kukin kolminkertaisena.

Seuraavissa kokeissa, koska β-lapatsoni yksin oli hyvin tehokas tappamaan A549-soluja ja halusimme tutkia sulindaakilla tai sen metaboliiteilla synergistinen vaikutus β-lapatsoni, keskityimme CL1-1 ja CL1-5 soluja. Lisäksi, koska suurin ero selviytymisen CL1-1 ja CL1-5 soluja nähtiin β-lapatsoni pitoisuudet 2-5 uM, käytettiin 5 uM β-lapatsoni tutkia vaikutusta β-lapatsoni yksin ja 2 uM β-lapatsoni tutkimaan synergistiset vaikutukset sulindaakin ja β-lapatsoni.

tunnistetiedot Apoptotic signalointireitin laukaisema β-lapatsoni

tutkimiseksi oleva mekanismi mukana β-lapatsoni myrkyllisyys, 5 uM β-lapatsoni käytettiin tutkimaan apoptoottista signalointireitille aktivoidaan β-lapatsoni in CL1-1 ja CL1-5 soluja. Käyttämällä anneksiini V-värjäyksellä, solukuoleman β-lapatsoni-käsitelty CL1-1 ja CL1-5 osoitettiin esiintyvän apoptoosin (kuvio 2A). Solusyklianalyysiä osoitti myös, että sub G0 /G1-suhde (apoptoottisia soluja) kasvoi ajasta riippuva tavalla (kuva S1A). Tutkimuksissa mittaamalla solunsisäisen kalsiumin tasoa, mikä nähtiin, kun 1 tai 2 h β-lapatsoni hoitoon sekä CL1-1 ja CL1-5 soluja (kuvio 2B, nuoli), kuten nähdään aktivoinnin aikana apoptoottisen reitin, jonka β-lapatsoni [6], [45]. Prosenttiosuus solujen eloonjäämistä, mitattiin käyttäen MTT-määritystä, vain osittain palauttaa lisäämällä 0-10 uM BAPTA (Molecular Probes), solunsisäinen kalsiumkelaattoria, inkuboinnin aikana 24 h 5 uM β-lapatsoni (kuvio 2C), mikä osoittaa, että lisääntynyt solunsisäisen kalsiumin tasoa ei ole ainoa tekijä mukana β-lapatsoni solukuolema näiden solujen. Vaikka kalpaiinia ja kaspaasi 3, komponenttien apoptoottisen signalointireitin, aktivoitiin käsittelemällä 5 uM β-lapatsoni varten 0-9 h (kuvio S1B), kuten on esitetty Täydennyskuvio 2, kaspaaseiksi ja kalpaiinin eivät osallistuneet keuhkosyöpä indusoimaa solukuolemaa β-lapatsoni, kuten 1 h esikäsittelyn pannulla kaspaasiestäjä zVAD tai kalpaiinin inhibiittorit ALLM tai ALLN (kaikki Sigmalta), ei inhiboida (kuva S2). Molemmissa solulinjoissa, mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) pieneni hoito 3, 6 tai 9 h β-lapatsoni (kuvio S1C), mutta solunsisäinen H

2O

2 tasossa ei muutettu β -lapachone hoitoa 3 tai 6 h (kuva S1D). Nämä tulokset osoittavat, että β-lapatsoni aiheuttaa apoptoosia sekä CL1-1 ja CL1-5 solujen vähentämällä MMP.

(A) CL1-1 soluja (vasen paneeli) tai CL1-5 solut (oikea paneeli) inkuboitiin 5 uM β-lapatsoni 0, 3, 6 tai 9 h, sitten tutkittiin apoptoosin käyttämällä anneksiini V (B) CL1-1 solut (vasen paneeli) tai CL1-5 solut (oikea paneeli) inkuboitiin 5 uM β-lapatsoni varten osoitetun ajan, sitten solunsisäisen kalsiumin tasot mitattiin käyttämällä Fluo-4 värjäys ja virtaussytometria. Intensiteetti Fluo-4 värjäytyminen lisääntyi β-lapatsoni hoitoa, erityisesti 1 h (nuolet). (C) CL1-1 solut (vasen paneeli) tai CL1-5 solut (oikea paneeli) jätettiin käsittelemättä tai inkuboitiin 24 h ilmoitetun pitoisuuden BAPTA-AM, solunsisäisen kalsiumkelaattoria, ja /tai 5 uM β- lapatsoni, sitten solujen eloonjäänti mitattiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina säilyminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. * P 0,05, ** p 0,01 verrattuna p-lapatsoni yksin.

Voit selvittää signalointireittejä aktivoituvat β-lapatsoni aiheuttama keuhkosyöpä solukuoleman tasot fosforyloitua muotojen PI3K, AKT, sekä MAPK ERK ja JNK CL1-1 ja CL1-5 soluja tutkittiin. β-lapatsoni hoito 10-180 min lisääntynyt JNK fosforylaation, mutta laski fosforylaatiota ERK (kuvio 3A) ja PI3K ja AKT (kuvio 3B). Lisäksi, pitoisuuksina 1, 2, tai 5 uM, JNK-inhibiittori SP600125 osittain pelastettiin solujen aiheuttama myrkyllisyys 24 h inkubointi β-lapatsoni (kuvio 3C), mikä osoittaa, että JNK: lla on tärkeä rooli keuhkosyövän solukuolema by β-lapatsoni.

(A) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) inkuboitiin 5 uM β-lapatsoni varten osoitetun ajan, sitten tasot p-ERK, ERK , p-JNK, ja JNK mitattiin Western blottauksella. (B) CL1-1-solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) inkuboitiin 5 uM β-lapatsoni 0, 3, 6 tai 9 h, sitten tasot p-PI3K ja p-AKT tutkittiin Western blotting. (C) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) esikäsiteltiin osoitettujen konsentraatioiden JNK-inhibiittori sp600125 6 h, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 5 uM β-lapatsoni 24 h.Cell selviytymisen mitattiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina säilyminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. * p 0,05 (D) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) jätettiin käsittelemättä tai esi-inkuboitiin 1 tunnin ajan 10 uM dikumarolityyppisten, sitten väliaine tai 5 uM β-lapatsoni lisättiin ja soluja inkuboitiin 9 tuntia ja tasot p-PI3K ja p-AKT mitattiin Western-blottauksella.

sen määrittämiseksi, onko NQO1 oli keskeinen säädin β-lapatsoni-välitteisen keuhkosyöpä solukuoleman, soluja inkuboitiin 6 h 10 uM dikumarolityyppisten, tietyn NQO1 estäjä, ja tämä johti noin 67% ja 77%: n vähennys NQO1 toiminnan CL1- 1 ja CL1-5 soluja, vastaavasti (kuvio S3A). Dikumarolityyppisten hoito inhiboi merkittävästi lasku fosforylaation p-PI3K ja p-AKT aiheuttama 9 h β-lapatsoni hoitoa (kuvio 3D), estetty kasvu solunsisäisen kalsiumin tasot indusoitiin 1 h β-lapatsoni hoitoa (kuvio S3B) ja merkittävästi inhiboi apoptoottisen solukuoleman aiheuttama 6 h inkubointi β-lapatsoni, kuten on esitetty anneksiini V-värjäyksellä (kuvio 4A) ja akridiinioranssia (AO) värjäämällä (kuvio 4B).

(A) CL1 -1 soluja (ylhäällä) tai CL1-5 soluja (alhaalla) jätettiin käsittelemättä tai inkuboitiin 6 h 5 uM β-lapatsoni ja /tai 10pM dikumarolityyppisten, sitten värjättiin anneksiini V-FITC ja anneksiini V fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. (B) Morfologiset muutokset jälkeen lääkehoitoa. CL1-1 tai CL1-5 solut jätettiin käsittelemättä (CTL) tai inkuboitiin 24 h 5 uM β-lapatsoni kanssa tai ilman 10 uM dikumarolityyppisten, sitten värjättiin akridiinioranssilla tarkkailla morfologia solun tumassa. Mittakaavapalkki edustaa 50 um.

Sulindaakilla ja sen aineenvaihduntatuotteiden lisätä sytotoksista vaikutusta β-lapatsoni kautta aktivointi NQO1

NSAID sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteet sulindaakkisulfidilla (alennettu -muoto) ja sulindaakkisulfoni (hapettunut muoto), tiedetään ilmentymisen moduloimiseksi joidenkin multioxidative entsyymejä, mukaan lukien NQO1 [31], [32]. Koska NQO1 tasot ja aktiivisuuden negatiivisesti liittyvä sytotoksisuus β-lapatsoni, tutkimme seuraavaksi sulindaakki ja sen metaboliitit voisi lisätä sytotoksisuutta β-lapatsoni solujen, joilla on alhainen NQO1 ilmaisun ja alemman β-lapatsoni herkkyys, kuten CL1-1 ja CL1-5 soluja.

sen määrittämiseksi, sulindaakki ja sen metaboliitit voivat moduloida NQO1 ilmentyminen keuhkosyövän solulinjat, niitä käytettiin pitoisuuksina 100 ja 250 uM hoitoon CL1-1 ja CL1-5 solujen 6, 12 tai 24 h. Kuten on esitetty kuviossa 5A, on CL1-1 soluissa, sekä pitoisuudet sulindaakin tai metaboliitin voimistunut NQO1 proteiinin tasot kaikissa 3 ajankohtina, kun taas vuonna CL1-5 soluja, tulokset olivat monimutkaisempia, mikä nähdään sen jälkeen, kun oli inkuboitu 12 tai 24 h 100 uM, mutta ei 250 uM, sulindaakin kaikkina kolmena ajankohtana molemmilla pitoisuuksilla sulindaakkisulfonin tai 100 uM sulindaakkisulfidi, ja 250 uM sulindaakkisulfidilla 6 h (12 ja 24 tuntia ei testattu) (Kuva 5A). NQO1 entsyymin aktiivisuus lisääntyi myös kaikki kolme kemikaalien (kuvio 5B). Kuten kuviossa S4, 100 ja 250 uM, kolmen lääkeaineen ei ollut merkittävää vaikutusta prosentuaalinen selviytyminen CL1-1 ja CL1-5 solujen inkuboinnin jälkeen sulindaakilla tai sulindaakkisulfoni 54 tunnin tai sulindaakkisulfidin 12 tuntia. Jotta voidaan tutkia synergiavaikutuksesta sulindaakin tai sen aineenvaihduntatuotteet ja β-lapatsoni keuhkojen syöpäsoluja, CL1-1 ja CL1-5 soluja inkuboitiin 0, 50, 100 tai 250 uM sulindaakilla tai aineenvaihduntatuotteiden 6 tuntia, sitten 2 uM β-lapatsoni in jatkuva läsnäolo sulindaakin tai metaboliitin 12 tuntia, ja prosenttiosuus eloonjääminen mitattiin kristalliviolettia värjäystä. Verrattuna soluihin käsitelty β-lapatsoni yksin selviytyminen molemmissa solulinjoissa väheni 10-40%, kun cotreated kanssa β-lapatsoni plus sulindaakin 20-40% kanssa β-lapatsoni plus sulindaakkisulfoni, ja 30-60% kanssa p-lapatsoni plus sulindaakkisulfidin (kuvio 6A). Yhteiskäsittely aiheuttama väheneminen oli suurempi ja CL1-5 soluja kuin CL1-1 solujen, eli se oli suurempi kanssa soluihin, jotka ilmentävät alempi NQO1 tasolla (kuvio 6A); Lisäksi mitään ylimääräisiä vaikutusta yhdistetyn hoidon verrattuna p-lapatsoni yksin nähtiin A549-soluja (kuvio S5), jotka ilmentävät korkeimmat NQC1 tasolla. Nämä tiedot osoittavat, että sulindaakki voi lisätä solujen herkkyys on alhainen NQO1 tasoilla p-lapatsoni sytotoksisuutta. Käyttämällä AO värjäys ja fluoresenssimikroskopian, 6 h esikäsittelyn 100 tai 250 uM sulindaakkisulfidi, minkä jälkeen lisättiin 2 uM β-lapatsoni 12 h johti vähenemiseen CL1-1 ja CL1-5 solutiheys verrattuna p-lapatsoni yksin (kuvio 6B), ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin yhdistelmällä β-lapatsoni ja joko sulindaakki tai sulindaakkisulfoni (tuloksia ei ole esitetty).

(A) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) jätettiin käsittelemättä tai inkuboitiin 100 tai 250 uM sulindaakki, sulindaakkisulfoni, tai sulindaakkisulfidin 6, 12 tai 24 tunnin ajan, sitten proteiinin tasot mitattiin Western-blottauksella. (B-D) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) jätettiin käsittelemättä (CTL) tai inkuboitiin ilmoitetun pitoisuuden sulindaakin (B), sulindaakkisulfoni (C), tai sulindaakkisulfidin (D ) varten osoitetun ajan, sitten NQO1 aktiivisuus mitattiin. *: P 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001 kontrolliin verrattuna.

(A) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja ( oikea) jätettiin käsittelemättä tai niitä esikäsitellään 6 h ilmoitetun pitoisuuden sulindaakin, sulindaakkisulfoni, ja sulindaakkisulfidi, sitten 2 uM β-lapatsoni lisättiin 12 tuntia, sitten solujen eloonjäänti mitattiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena eloonjääminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. *: P 0,05 verrattuna p-lapatsoni yksin. (B) Kaksi sarjaa kunkin solutyypin jätettiin käsittelemättä tai inkuboitiin 6 h 100 tai 250 uM sulindaakkisulfidi, sitten 2 uM B-lapatsoni lisättiin yhden ja inkubointia jatkettiin 12 tuntia, sitten morfologia tutkittiin akridiinioranssivärjäyksellä. Mittakaavapalkki edustaa 100 um.

NQO1 avainasemassa siinä Sulindaakilla aiheuttama lisäys β-lapatsoni sytotoksisuus varten Lung Cancer Cells

Vaikka NQO1 ilmaisun ja toiminnan korotettiin sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteet, onko NQO1 oli merkittävä rahoittaja sulindaakki aiheuttama lisäys β-lapatsoni sytotoksisuus tarvitaan edelleen tutkimusta. Kahta menetelmää käytettiin inhiboimaan entsyymin aktiivisuutta tai proteiinin ilmentymisen NQO1, joka on NQO1 estäjä ja NQO1 siRNA pudotus.

dikumarolityyppisten on aiemmin käytetty estämään spesifisesti ilmentymistä ja toimintaa NQO1 [44]. Kuten kuviossa 7 on esitetty, solujen esikäsittely 100 tai 250 uM sulindaakki (kuvio 7A), sulindaakkisulfoni (kuvio 7B), tai sulindaakkisulfidin (kuvio 7C), minkä jälkeen lisättiin 2 uM β-lapatsoni 12 h lisääntynyt sytotoksisuus ja β-lapatsoni sekä CL1-1 ja CL1-5 solut, ja nämä vaikutukset olivat merkittävästi vähentää lisäämällä 10 uM dikumarolityyppisten.

CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) jätettiin käsittelemättömiä tai niitä esikäsitellään 6 h ajan 100 tai 250 uM sulindaakki (A), sulindaakkisulfoni (B), tai sulindaakkisulfidin (C) kanssa tai ilman 10 uM dikumarolityyppisten, sitten inkuboitiin vielä 12 h lisäyksen kanssa tai ilman 2 uM β-lapatsoni, sitten solujen eloonjäänti mitattiin kristallivioletilla värjäämällä ja ilmaistaan ​​prosentteina säilyminen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. *: P 0,05.

Käyttäen siRNA knockdovvn NQO1, päivinä 1-3, kun NQO1 siRNA transfektion CL1-1 ja CL1-5 soluja, ei muutosta solujen kasvuun tai solujen morfologia Todettiin (Kuva S6). Tehokkuutta pudotus on CL1-1 ja CL1-5 solujen osoitettiin RNA ilmentymisen RT-PCR: llä (kuvio 8A) ja reaaliaikainen PCR (kuvio S7) ja proteiinin ilmentyminen western blottauksella (kuvio 8B ja C), mikä osoittaa, että NQO1 siRNA merkittävästi vaimentua NQO1 ilme. Kuten on esitetty kuviossa 8D, NQO1 siRNA transfektio inhiboi merkittävästi kasvua NQO1 entsyymiaktiivisuuden indusoitiin CL1-1 soluissa inkuboimalla 6 tai 24 tuntia 100 tai 250 uM sulindaakki (vasen paneeli), sulindaakkisulfoni (keskiosa), tai sulindaakki rikkivetyä (oikea paneeli). Kun solut transfektoitiin 24 h siNQO1 tai ohjaus siRNA esikäsiteltiin 6 h sulindaakilla tai sen metaboliittien, sitten cotreated 12 h lääkkeen plus 2 uM β-lapatsoni, prosenttiosuus solujen eloonjäämistä tulokset osoittivat tulokset, jotka on transfektoitu NQO1 siRNA aiheutti merkittävä lasku sytotoksisuutta yhdistelmien β-lapatsoni sulindaakilla (kuvio 9A), sulindaakkisulfonin (kuvio 9B), tai sulindaakkisulfidilla (kuvio 9C). Nämä tulokset osoittivat, että NQO1 on tärkeä rooli lisääntymiseen β-lapatsoni solukuolema aiheuttama sulindaakilla tai sen aineenvaihduntatuotteiden.

(A-C) CL1-1 solut (vasen) tai CL1-5 soluja (oikealla) transfektoitiin 1-3 päivää, jossa ohjaus siRNA (CTL) tai siRNA kohdistaminen NQO1, sitten RNA ilmentyminen mitattiin PCR: llä (A) ja proteiinin ekspressio Western blotting (B ja C). (D) CL1-1 transfektoitu 2 päivää ohjaus siRNA tai NQO1 siRNA inkuboitiin yksin tai 100 tai 250 uM sulindaakin sulindaakkisulfidilla tai sulindaakkisulfonin 6 tai 24 tuntia, sitten NQO1 aktiivisuus mitattiin. *: P 0,05, ***: p 0,001 verrattuna identtisesti käsitellyt solut transfektoitu ohjaus siRNA.

CL1-1 soluja (vasemmalla) tai CL1-5 soluja (oikealla) transfektoitiin ohjaus- siRNA (-) tai NQO1 siRNA (+) 24 tunnin ajan, sitten jätettiin hoitamatta tai inkuboitiin 6 h 100 tai 250 uM sulindaakki (A), sulindaakkisulfoni (B), tai sulindaakkisulfidin (C), sitten