Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solut kanssa pallo muodostavat kapasiteetti, pallomainen solut, ovat läsnä pahanlaatuiset askites potilaiden epiteelin munasarjasyöpä (EOC) ja muodostavat merkittävän esteen tehokkaaseen hoitoon johtuen niiden otaksuttu rooli etenemistä, etäpesäke ja kemoterapian resistenssin. Tarkka mekanismeja että taustalla EOC etäpesäke ja lääkeresistenssin eivät ole selkeitä. Ymmärtäminen biologian alan muodostavien solujen voi edistää tunnistamisen uusia terapeuttisia mahdollisuuksia metastaattisen EOC. Täällä syntyy pallomainen soluja ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ja ensisijainen munasarjasyöpä. Xenoengraftment on niin vähän kuin 2000 erottaa pallomainen solujen immuunijärjestelmän hiirissä saa täyden kertaus alkuperäisestä kasvaimesta, kun taas 10

5 emotuumorisoluille pysyi ei-tuumorigeenisiä. Rakeiden solujen havaittiin rikastaa solujen syöpään kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia kuten säätelyä kantasolujen geenien, itseuudistumisen, korkea proliferatiivinen ja erilaistumista potentiaalia, ja korkea aldehydi (ALDH) aktiivisuus. Lisäksi pallojakaantuminen solut olivat aggressiivisempia kasvu, muuttoliike, invaasio, naarmu elpyminen, klonogeeniset selviytyminen ankkurista riippumaton kasvu ja kestävät paremmin kemoterapiaa

in vitro

.

13C-glukoosin aineenvaihdunnan tutkimukset paljastivat, että sferoidiviljelmiä solut reitti glukoosia pääasiassa anaerobista Glykolyysivaiheen ja Pentoosi sykli vahingoksi uudelleenreititys glukoosia anabolisia tarkoituksiin. Aineenvaihduntamuutoksia ominaisuuksia pallo muodostavien solujen näyttävät antavan lisääntyneen resistenssin apoptoosia ja edistää aggressiivisempia kasvaimen kasvua. Yhdessä osoitimme, että sferoidiviljelmiä soluja syövän kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia osaltaan kasvaimen sukupolvi, etenemistä ja kemoterapia vastus. Tutkimus tarjoaa tietoa suhdetta kasvaimen levittämisen ja metabolinen ominaisuuksia ihmisen syövän kantasoluja ja on kliininen vaikutuksia syövän hoidossa.

Citation: Liao J, Qian F, Tchabo N, Mhawech-Fauceglia P, Beck Qian Z, et al. (2014) munasarjasyöpä Sferoidiviljelmiä Solut kantasolun Like Properties Osallistutaan Kasvain Generation, etäpesäke ja kemoterapia Resistance kautta Hypoksia hylkivät Aineenvaihdunta. PLoS ONE 9 (1): e84941. doi: 10,1371 /journal.pone.0084941

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 10 syyskuuta 2013 Hyväksytty: 29 marraskuu 2013; Julkaistu: 07 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Liao et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Cancer Research Institute munasarjasyöpä työryhmän Grant, syövän rokotteen Collaborative myöntämisestä Cancer Research Institute ja Ludwig Institute for Cancer Research, Anna-Maria Kellen kliininen tutkija Award of Cancer Research Institute (Ko), Roswell Park Cancer instituutti Alliance Foundation, NIH P30 CA016056; NIH R01CA158318-01A1 ja RPCI-UPCI munasarjasyöpä SPORE P50CA159981-01A1. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia. On yli 23000 tapausta vuosittain Yhdysvalloissa, ja 14000 naiset voidaan odotetaan kuolevan tautiin [1]. Huolimatta vaatimaton parannuksia hoitovaste, taudin etenemisestä vapaa ja eloonjäämismediaani käyttämällä adjuvanttia platinaa ja taksaania kemoterapiaa seuraava sytoreduktiivisen leikkauksen, yleinen eloonjäämisasteesta joilla on pitkälle EOC ja munasarjojen kaltaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia (ensisijainen vatsakalvon) pysyvät pettymys [2]. Tämä on katsottu johtuvan useista eri syistä. Ensinnäkin, toisin kuin useimmat muut kiinteät kasvaimet, yli 75% EOC potilaista on pitkälle edennyt sairaus (FIGO III tai IV). Toiseksi, vaikka useimmat potilaat aluksi vastata platina ja paklitakselikemoterapia lukien täydelliset vasteet, relapsien on noin 85%. 2 vuoden kuluessa sytoreduktiivisen kirurgian ja systeeminen kemoterapia kasvaimet yleensä toistuu ja kerran uusiutuu, parantava hoito on vaikeaa. Siksi on välttämätöntä ymmärtää mekanismi (t) EOC etäpesäke ja kemoterapian resistenssin parantamiseksi hoitotuloksia tässä sairaudessa.

Ensisijaisesti kaukaisten etäpesäke EOC kuuluu irtoaminen solujen ensisijaiselta kasvain, vatsaonteloon, minkä jälkeen implantoinnin on mesothelial limakalvon vatsakalvon [3], [4]. Tällä hetkellä tietoja, jotka osoittavat, että ”pallo muodostavien solujen” tai ”palloset” esiintyy yleisesti vatsaonteloon sekä pystyvät tumorigeneesin

in vivo

, ovat vasteen heikkenemisen kemoterapeuttisten

in vitro

ja voi olla tärkeä rooli etäpesäkkeitä [5] – [9]. Koska aineenvaihdunnan muutokset saattavat etua kyky syöpäsolujen hengissä, lisääntyä, ja tunkeutua [10] – [12], me arveltu, että alan muodostavien solujen todennäköisesti näytteille aineenvaihdunnan ominaisuuksia, jotka edistävät niiden kyky selviytyä ja etäispesäkkeitä. Nykyisessä tutkimuksessa olemme syntyy pallomainen soluja EOC solulinjojen ja potilailla, joilla on primaarinen munasarjasyöpä. Meidän

in vivo

ja

in vitro

biologinen tutkimukset ehdotti, että nämä alalla muodostavat solut rikastettu syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCL), joka kriittisesti edistävät munasarjasyöpä tuumorigeneesiprosessin etäpesäke ja kemoterapia vastus. Sitten käyttää isotooppia-pohjainen dynaaminen metabolinen profilointi [13], [14], samanaikaisesti arvioida alustaan ​​vuon ja tärkeimmille metaboliareittiä makromolekyylin synteesi ja energian tuotannon erilaisissa fysiologisissa olosuhteissa. Huomasimme, että sferoidiviljelmiä solut lisäävät anaerobiset Glykolyysivaiheen ja Pentoosi sykli ja vähentää uudelleenreititys glukoosia anabolisia tarkoituksiin. Tutkimus tarjoaa oivalluksia suhdetta kasvaimen levittämisen ja metabolinen ominaisuuksia munasarjojen CSCL soluja, ja on kliininen vaikutuksia syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

eristys kasvainsolujen Human munasarjasyöpä

kasvain näytteet ja vesivatsanestesupernatan- saatiin potilailta, joille suoritetaan kasvain rajaamisvai- kirurgia epiteelin munasarjasyöpä (EOC) at Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY. Kaikki näytteet kerättiin osana hyväksyttyä pöytäkirjan CIC 02-15 päässä Institutional Review Board at RPCI, ja tietoisen kirjallisen suostumus saatiin kunkin potilaan. Kasvainsolujen askites saatiin sentrifugoitiin solujen pelletit vesivatsanesteestä. Pelletit pestiin kahdesti PBS: llä, asetettiin Ficoll-Hypaque tiheys kaltevuudet ja sentrifugoitiin jälleen satoa kasvainsoluihin. Saada syöpäsolujen kiinteän kasvainkudoksen, kasvaimen näytteet hienonnettiin solukasvatusväliaineessa ja yhden solun suspensiot pestiin kahdesti PBS: ssä ja sen jälkeen Ficoll-Hypaque-puhdistus.

Cell Culture

Ensisijainen EOC solulinjat perustetaan kiinteä kasvain ja askites viljelemällä soluja 13 eri olosuhteissa [15], [16] 30 EOC potilaista yli 2 vuoden. Sferoidiviljelmiä soluja tuotetaan uusi EOC solulinjoista ja vakiintunut munasarjasyövän solulinja, OV2774, jotka on saatu Sloan Kettering Institute, New York, NY (kiitos Lloyd J. Old, Ludwig Institute for Cancer Research, NY), jonka kuvattua menetelmää [17] muutoksin suspendoimalla 8 x 10

4 solut seerumittomalla DMEM /F12, johon oli lisätty 10 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF; Invitrogen), 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF; Invitrogen), ja N2 täydennys-A (StemCell Technologies Inc) Ultra Low Liite 6-kuoppaisille levyille (Corning) ja myöhemmät organisaatio palloiksi.

in vivo

vierassiirrekokeissa

Kaikki eläinkokeet kiinni protokollien hyväksymän Institutional animal Care ja käyttö komitean RPCI. Dissosioitunut sferoidi tai emotuumorisoluille laskettiin, suspensoitiin uudelleen 50 ul 1:01 RPMI /Matrigel (BD Biosciences), ja injektoitiin ihon alle (sc) oikeaan jalat 3- ja 4-WK-vuotias nainen SCID-hiirten (CB-IGH -1blcrTac-Prkdcscid /Ros) tarjoamat RPCI Animal Facility (peräisin Taconic Farms, Hudson, NY). Siirto tehty hiiret tarkastettiin joka toinen viikko kasvaimen ulkonäön silmämääräisesti ja tunnustelu ja kasvaimen latenssit määritettiin. Hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat, jonka tuumorin halkaisija on 1 cm tai 6 kuukautta transplantaation jälkeen. Ksenograftikasvaimissa resekoitiin, kiinnitettiin 10% neutraaliin, puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin leikkeiden (5 um) on rotaatiomikroskooppi, jonka jälkeen luisti asennus, H 0,1 mm halkaisijaltaan) 3 viikon kasvun pehmeässä agarissa laskettiin; 10 eri alojen kvantitoitiin kohti ja keskimäärin pesäkettä alalla on laskettu. AIG (ankkurista riippumaton kasvu) indeksi ilmaistiin suhteessa solujen lukumäärä kylvetään.

Kemoterapia Resistance Pitoisuus

Kuulat hajotettiin trypsinisaatiolla ja pipetoimalla ja solut ympättiin 5000 solua kuoppaa kohti (96-kuoppaisilla levyillä, Corning) 200 ul: CM väliaineessa. Kaikki solut käsiteltiin 24 h 0-6 ug /ml sisplatiinia (BD Biosciences) tai 0-18 ng /ml paklitakselia (Sigma; n = 5 per lääkkeen annos). Suhteellinen solujen lukumäärät määritettiin CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys [18]. Annos-vaste-kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Prosentuaalinen solujen eloonjääminen on ilmaistu suhteessa käsittelemättömään kontrolliin. Sferoidi solujen lääkeaineen cytotoxicities verrattiin sen jälkeen, kun 48-h hoito Sisplatiini (4 ug /ml). Sen jälkeen lääkehoidot, soluja inkuboitiin 8 päivän lääkkeettömässä CM keskipitkän ja solujen pesäkkeet tutkittiin mikroskoopilla.

klonogeeninen eloonläämismääritys

Soluja käsiteltiin eri määriä sisplatiinia 24 tunnin . Poistamisen jälkeen lääkkeen, solut pestiin PBS: llä, kerättiin ja 300 eloonjääneiden solujen /kuoppa uudelleen syötettiin CM väliaineeseen 6-kuoppaiselle levylle. 10-14 päivä myöhemmin pesäkkeet värjättiin 0,1% kristalliviolettia ja laskettiin.

immunohistokemia

Kasvaimen näytteet kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Osaa (5 um), asetettiin lasilevyille, kuumennettiin 60 ° C: ssa 20 minuutin ajan, ja sitten poistettiin parafiini ksyleenillä ja etanoli. Antigeenin haku, Tuumorinäytteet asetettiin lasilevyille upotettiin esilämmitettyyn antigeenin haku liuosta (DAKO korkea pH liuos, DAKO, Carpinteria, CA) 20 minuutin ajan ja annettiin jäähtyä 20 min ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun inaktivaatio endogeenisen peroksidaasin, puhdistettua, spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta CA125 (Ov 185:1, Novocastra) (1:200 laimennos) ja CK7 (Dako) (1:20 laimennus tai 75 ug /ml) lisättiin sitten, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aine todettiin biotinyloidulla anti-hiiri-IgG (DAKO). Diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla Sitten lisättiin kehittämiseen 10 minuuttia, jonka jälkeen counterstaining hematoksyliinillä ratkaisu.

Biokemialliset analyysit

käyttö [U-

13C

6] glukoosi merkkiaineen yhdessä massaspektrometrian avulla arvioinnin metabolisen vuon kautta Haitallisia helpottaa energian tuotannon ja biosynteettistä solun metaboliassa. Normaali munasarjojen solut (RPNLOv78) ystävällisesti toimittanut Dr. T Pejovic [19]. Soluja viljeltiin 01:01 seos RPMI ja DMEM (glukoosi-free) + 10% FBS + 10 ug /ml insuliinia + 10 ng /ml EGF: ää + 0,1% gentamysiiniä + [U

13C

6] glukoosia (180 mg /ml). Kantasoluja (RP-OV17534) viljeltiin RPMI (glukoosi-free) + 10% FBS + [U

13C

6] glukoosia (180 mg /ml). RP-OV17534 pallomainen-soluja viljeltiin DMEM /F12 (glukoosi-free) + N2 täydennys-A + EGF 10 ng /ml + bFGF 10 ng /ml + [U

13C

6] glukoosia (180 mg /ml). 24 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut sentrifugoitiin (1500 rpm, 5 minuuttia) ja inkubointielatusaineeseen ja solujen pelletit saatiin. Glukoosin ja laktaatin inkubointialusta pitoisuudet määritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. Laktaatin soluviljelyaine uutettiin etyyliasetaatilla jälkeen happamaksi HCl: lla. Laktaatti derivatisoitiin sen amidi-heptafluorivoihappo muotoa ja

m /z

330 ja 331 (hiilet 2-3 laktaatin, kemiallinen ionisointi) seurattiin havaitsemiseksi

m2

(

13C kaksoisleimattua laktaatti) ja

m3

(triple-leimattu laktaatti) estimointijärjestelmässä pentoosin kierron toiminnan vs. anaerobinen Glykolyysivaiheen [21]. Glutamaatti erotettiin keskipitkän käyttäen ioninvaihtokromatografiaa [22]. Glutamaatti muutettiin sen

n

-trifluoroacetyl-

n

butyyli johdannainen ja ionin klusterien

m /z

198 (hiilet 2-5 glutamaatin, elektroni iskuionisaatiolle ) seurattiin.

13CO

2 vapautuminen mitattiin Finnegan Delta-S ionisuhde massaspektroskopia ja käytettiin arvioitaessa glukoosin hiilen hyödyntämisen kautta hapettumista solulinjat [23]. Massaspektritulokset analyysit tehtiin kolmen riippumattoman automaattisen injektioita näytteenottolaitteen ja hyväksyä vain, jos standardinäytteen poikkeama oli 1% normalisoitu piikin intensiteetin.

Data Analysis ja tilastolliset menetelmät

tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen parametrisen parittomia, kaksihäntäinen riippumatonta näytettä

t

testi 99%: n luottamusväli.

tulokset

generointi Sferoidiviljelmiä Solut Ensisijainen munasarjasyöpä Näytteet ja perustettu EOC solulinjat

Stable solulinjat perustettiin onnistuneesti 3 30 (10%) viljelmät aloitettiin alkutuotannosta EOC yksilöt yli 2 vuoden. RP-OV15526 oli peräisin kiinteän kasvaimen taas RP-OV17534 ja RP-OV313777 olivat peräisin EOC askites. Nämä solut on viljelty

in vitro

varten 465, 312, ja 125 päivää 68, 65, ja 17 kohtia, vastaavasti. Kaikki linjat olivat myöhäisen vaiheen (IIIC tai IV) munasarjasyöpä serous adenokarsinooman syöpäpotilailla. Yksisolukerroksena ensisijainen ihmisen EOC soluissa kuvattu tyypillinen epiteelin mukulakivi morfologia kanssa 3-ulotteinen kasvaa ylöspäin solu-kondensoitu alueilla (Fig. 1A). Tutkiminen epiteelin merkkiaineiden CK-7 ja CA-125 edelleen vahvisti epiteelin luonne ensisijaisen solulinjoista (kuvio. 1 C). Jotta saadaan aikaan pallomainen soluihin, munasarjasyövän solulinja OV2774 tai ensisijainen EOC solut entsymaattisesti hajotettiin ja siirrostettiin ultra-low kiinnitys lymaljoilla seerumittomassa väliaineessa EGF, bFGF, ja N2 täydennys-A. Tässä viljelyolosuhdetta joitakin soluja kuoli seerumistarvaatio, kun taas toiset joutuivat jousitus ja muodostivat aggregaatteja. Kolme viikkoa sen jälkeen, kun pinnoitus, joitakin aggregaatteja puristetaan palloiksi, joita ei voitu erottaa pipetoimalla. Osa pallojen myös yhteen muodostaen alalla klustereita. Kelluva palloja ja klustereita hajotettiin pipetoimalla, ja maljattiin uudelleen kahdesti viikossa, josta aiheutuu solujen tuottaa toissijainen palloja, esiintyy erotuksena prototypical pallosia (kuviot. 1B 1E), samanlaisia ​​kuin potilaiden Askites [5], [6] . Tätä lähestymistapaa käyttäen saimme kestävä pallosia vakiintuneista solu- linjan OV2774 (kuviot. 1D ja 1E) ja ensisijaisen EOC solujen HE-OV17534 (kuviot. 1A ja 1B) alle varsi-selektiivisissä olosuhteissa. Olemme viljeltiin OV2774 ja RP-OV17534 solujen sferoidit ja 6 kuukautta, mikä osoittaa itseuudistuvien kyky sferoidi soluja.

(A) Kolme ensisijaista solulinjat muodostetaan EOC potilaalla ilmenee epiteelisolujen morfologia. (B) Yksi ensisijainen EOC solulinjan tuottamat 3-D itsenäinen, uusimista sferoidiviljelmiä soluilla kantasolujen valinta media. (C) Primäärisolulinjoja ilmaista munasarjasyöpäpotilailla merkki CA-125 ja epiteelin merkki CK-7, mikä näkyy IHC RP-OV17534. (D) EOC solulinja OV2774 pystyy tuottamaan OV2774 pallomainen solut (E). Kaikki mittakaavajana yksikkö tässä kuviossa ja seuraavat luvut ovat um.

Sferoidiviljelmiä Solut tuumorigeenisyyteen ja etäpesäkkeiden immuuni-hiirissä

Seuraavaksi tutkimme tuumorigeenisyyden pallo muodostavien solujen . Tutkimme, onko eksponentiaalisesti pienempi määrä (verrattuna vanhempien syöpäsoluja) kykenivät tumorigeneesin, kuten aiemmin on esitetty muissa epiteelisyöpäsolujen aloittamista soluja (CIC) [24] – [28]. Sferoidiviljelmiä soluja tai vastaava vanhempien irtotavarana kasvainsoluja injektoitiin s.c. osaksi oikeus jalat SCID hiirillä. Pistosten kanssa vain 2000 solua hiirtä kohti, pallojakaantuminen solut tuumorigeenisiä 4 4 SCID-hiirissä RP-OV17534 sferoidiviljelmiä soluja ja 2 2 OV2774 pallomainen soluja, mistä on osoituksena palpoitavissa kasvaimia injektiokohdassa (Fig. 2A; Taulukko 2 ). Mediaani kasvain latenssiaika tässä kohortissa oli 31 90 päivään RP-OV17534 sferoidiviljelmiä ja 50-57 varten OV2774 pallomainen, samanlainen tai pienempi kuin CIC muiden maligniteettien [24] – [27]. Vastaavasti, injektioita 5000 ja 10000 RP-OV17534 pallomainen solut olivat myös tuumorigeenisiä kolme kolmesta hiirestä lyhyempi kasvaimen latenssit (Fig. 2A, taulukko 2). Ilman ei-tarttuva pallomainen valinta, bulk kasvainsolut eivät muodostaa kasvaimia jopa 40000-solujen HE-OV17534 engraftmentissa (taulukko 2). Kaikki ihonalainen ksenograftikasvaimissa peräisin sferoidiviljelmiä solut luokiteltiin seroosinen adenokarsinoomat kohtalainen /heikko erilaistumiseen (grade 2 /luokka 3), samanlainen kuin vanhempien ensisijainen potilaan kasvaimissa (H taulukko 2). I.p. injektio pallo muodostavien solujen johti kehittämisessä verinen vatsaonteloon sekä vatsakalvon etäpesäke on omentum, maksa, paksusuoli, maha, ja munuaisten (Fig. 2B), ja vatsaonteloon kasvainhistologiaa samanlainen sekä ihonalainen ksenografti ja ensisijainen potilaan kasvaimet (Fig. 2C ). Yhdenmukainen tulokset RP-OV17534, myös havaittu korkeampi aiheuttavan kasvaimia OV2774 sferoidiviljelmiä solujen verrattuna niiden emosoluihin samanlaisissa i.p. engraftmentti eläinkokeissa OV2774 peräisin olevia soluja (taulukko 2).

Toinen keskeinen kriteeri CIC on niiden kyky sarjatuotantona levittää kasvainten peräkkäin Siirto tehty eläimillä [31]. Tarkastelemaan tätä lopullista stemness ominaisuus, sarja- engraftments Ksenograftien tehtiin. 2 x 10

4 sferoidiviljelmiä soluja i.p. ruiskutetaan SCID hiiriin ja askites kehittyi odotusten 3 out of 3 hiirtä noin 60 päivää. Transplantaatio 8 x 10

4, 1 x 10

5, ja 5 x 10

5 kuten askitesta soluja SCID hiiriin johti vatsaonteloon sekä kasvaimissa, joissa on latenssi huomattavasti lyhyempi kuin vanhempien potilaiden kasvainsolut ( 66/63/49 päivää vastaavasti passage 2 ksenografteissa versus kasvaimen kehitystä emotuumorisoluille 8 x 10

4 elinsiirrot 0 3: SCID hiirillä). Patologian omental massa oli samanlainen kuin s.c. kasvaimet (Fig. 2C). Nämä tulokset osoittavat, että palloja muodostavan solut ovat tuumorigeenisemmiksi kuin niiden vanhempien kasvainsoluja, jotka osoittavat, että erittäin tuumorigeenistä alapopulaatio solut ovat läsnä piirissä muodostavia soluja, ja voi oleskella munasarjojen kasvaimet. Koska RP-OV17534 sferoidiviljelmiä solujen ja OV2774 sferoidiviljelmiä solut osoittivat samanlaisia ​​ominaisuuksia, seuraavat tulokset esitetään RP-OV17534 peräisin olevat solut samanlaisia ​​havaintoja OV2774 soluja.

munasarjakasvain Sphere muodostavien solujen Express Stem Cell Genes

ekspression tutkimiseksi geenin spesifinen alkion kantasoluja, kokonais-RNA sferoidiviljelmiä soluista ja vanhemman solut analysoitiin Human Stem Cell Marker cDNA Plate Array. Niistä 32 geenit testattu, pallojakaantuminen solujen voimistunut Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, ja Myc ilme (Fig. 3A). Kukin näistä geeneistä on välttämätöntä kehitysprosesseja (alkionkehityksen neurogenesis, kantasolu- laajennus, ja hematopoieesin [32] – [34]). Nämä tulokset vahvistettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä data. Ilmaisu tasot Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, ja Myc vuonna sferoidiviljelmiä solut olivat noin 10-2000 kertaa suurempi kuin ei-pallomainen soluissa havaitaan reaaliaikainen PCR (Kuva. 3B, punainen palkki). Kun sferoidi soluja viljeltiin CM ilman kasvutekijöitä, erottavana ehto, kelluvat solut kiinnittyivät kasvoi epiteelisoluihin. Seuraavaksi verrataan samaan sarjaa geenin ilmentymisen taso reaaliaikaisella PCR pallomainen soluissa, viljelemällä joko kantasolu-selektiiviset tai erottaa olosuhteissa 14 päivää. Expression of CD34 ja Nanog oli noin 1 kertainen että ei-pallomainen soluja, CDCP1 ja Myc laski 9 ja 500 kertaiseksi. Notch1 ekspressiotaso sferoidiviljelmiä soluissa pysyi 12 kertainen että ei-pallomainen solujen viljelemisen jälkeen CM 14 päivää (Fig. 3B, vihreä palkki). Kantasolutekijän reseptori CD117 (c-kit) on raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa munasarjasyövän kasvain esiasteita [17], [35]. Siksi tutkimme CD117 ilmentyminen FACS näissä pallomainen soluissa. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien myös havaittu CD117 ylössäätöä in sferoidiviljelmiä soluissa verrattuna vanhemman soluja. Koska suuri määrä sferoidiviljelmiä solujen tapettiin kemoterapiaa huumeita erottuivat kuin kantasoluja, kun taas varsi kaltaisia ​​soluja selviytyi (katso jäljempänä), huomasimme, että CD117 ilmentyminen kasvoi vuonna sferoidiviljelmiä soluissa jälkeen sisplatiinihoitoon 24 tuntia (Fig. 3C) . Nämä tiedot osoittavat, että pallomainen soluja munasarjasyövän yli-ilmentävät kantasolujen geenejä kantasolujen-selektiivisissä olosuhteissa ja menettää tai vähentää näiden geeniekspressioiden mukaisesti erilaistumisen olosuhteissa.

(A) eristetty kokonais-RNA pallomainen solujen ja kantasolujen tutkittiin niiden geeniekspressiota ihmisen kantasolujen merkkiaineita cDNA array ja kantasolujen-geenit osoittivat korkeampia ekspressiotasoja sferoidiviljelmiä soluissa ei-pallomainen soluissa. (B) yli-ilmentyminen tasot Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, ja Myc vuonna sferoidiviljelmiä soluissa verrattuna ei-sferoidiviljelmiä solut varmistettiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Nämä kantasolujen-geenien ilmentyminen menetettiin tai alassäädetty kun sferoidiviljelmiä solut eriytetty viljelemällä CM ilman kasvutekijöitä 14 päivää. Ekspressoitumistasot edustettuina kertaiseksi muutoksia verrattuna nämä ei-pallomainen soluissa. (C) FACS tarkastelu CD117 ilmentymisen sferoidiviljelmiä soluihin ja emosoluina osoittaa korkea CD117 ilmentyminen pallomainen soluissa. Jotkut sferoidiviljelmiä soluja käsiteltiin Sisplatiini 24 tuntia ennen pinnan värjäytyminen CD117 Abs. Virhepalkkien: SD, N = 3. *: p 0,05.

Lisääntynyt ALDH Aktiivisuus Sferoidiviljelmiä Solut

ALDH on tärkeä rooli solujen vieroitus. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että lisääntynyt ALDH toiminta johtaa useita erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, toimii syövän kantasoluja markkeri ja korreloi huonon ennusteen [36] – [39]. Meidän ALDEFLUOR testi osoitti enemmän ALDH

+ solujen sferoidi solujen puuttuessa ALDH-inhibiittoria DEAB (Fig. 4A). Lisääntynyt ALDH funktio sferoidiviljelmiä soluissa varmistettiin jota ALDH toimintaa kolorimetristä, osoittaa merkittävää tehostetut aktiivisuutta sferoidiviljelmiä soluissa (Kuva. 4B).

(EN) ALDEFLOUR sarja etikettejä väestön korkea ALDH entsyymiaktiivisuus in pallomainen soluissa. Alikvootti kustakin näytteestä solujen käsiteltiin ALDH estäjän DEAB negatiivisena kontrolli asettamiseksi FACS portille. (B) toinen BioVision ALDH kolorimetristä havainnut parannettu ALDH aktiivisuutta sferoidiviljelmiä solulysaatissa. Virhepalkkien: SD, N = 2. *: p 0,05.

Sferoidiviljelmiä Solut ovat korkea leviämisen ja muuttopotentiaalia kuin niiden Vanhempien Cells

suhde pallomaisten muodostumisen ja solujen kasvua potentiaalia tutkittiin kineettisen soluproleferaatiomäärityksessä. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. Kuva.