Krooninen sairaus

tiivistelmä

On yhä enemmän todisteita siitä, että monet kiinteät kasvaimet ovat hierarkkisesti järjestäytynyt ja suurin kasvainsolujen heikkolahjaisina toistettavuusmahdollisuudet, mutta ylläpiti varren kaltainen solu, joka ikuistaa kasvain. Nämä syövän kantasoluja on arveltu olevan peräisin muutosta aikuisen kudoksen kantasolujen, tai uudelleen hankinnan varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia esisolut. Adenosquamous karsinooma (ASC) on aggressiivinen keuhkosyöpään, joka sisältää sekoitus solujen levyepiteelikarsinooma (sytokeratiini- 5+) ja adenokarsinooman (sytokeratiinia 7+) fenotyypit. Alkuperä nämä seokset on epäselvä squamous karsinoomat uskotaan johtuvan Tyvisolut ylemmissä hengitysteissä kun adenokarsinooman uskotaan muodostavan kantasoluista keuhkoputkien alveolaarinen risteyksessä. Olemme eristettiin ja karakterisoitiin syövän kantasoluja kaltaisia ​​populaatioita ASC soveltamalla valikoivan määriteltyihin viljelyalustaa käytettiin aluksi kasvaa ihmisen keuhkojen kantasoluja. Homogeeninen solut valitaan ASC kasvain näytteet vakaasti laajennettiin

in vitro

. Ensisijainen ksenografteissa ja etäpesäkeleesioita johdettu näistä soluista NSG hiirissä täysin kerrata sekä adenokarsinooma ja squamous piirteitä potilaan kasvain. Mielenkiintoista, kun taas CSLC kaikki koekspressoi sytokeratiineja 5 ja 7, useimmat ksenografti- solut ilmaista joko yhden, tai ei, jossa 10% jäljellä kaksinkertainen positiivinen. Olemme myös osoittaneet potentiaalia CSLC erilaistumaan monilinjainen rakenteita, joilla haaroittumista keuhkojen morfologia ilmentävät keuhkoputken, keuhkorakkuloiden ja neuroendokriininen markkereita in vitro. Yhdessä ominaisuuksia näiden ASC johdettujen CSLC viittaa siihen, että ASC saattaa syntyä alkeellisia keuhkoja kantasolu eroaa keuhkoputken-alveolaarinen tai pohjapinta kantasoluja.

Citation: Mather JP, Roberts PE, Pan Z, Chen F, Hooley J, Young P, et al. (2013) eristäminen Cancer Stem Like Solut Ihmisen Adenosquamous keuhkon tukee monoklonaalisia Alkuperäinen peräisin multipotentti Tissue Stem Cell. PLoS ONE 8 (12): e79456. doi: 10,1371 /journal.pone.0079456

Editor: Alan P Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2013; Hyväksytty 23 syyskuuta 2013 Julkaistu: 04 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Mather et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: No current rahoitusmahdollisuudet tätä tutkimusta varten. Työ rahoitetaan kokonaan MacroGenics, Inc. kautta yritys- varainkeruun pääomasijoitusalalta. Rahoittajat eivät osallistuneet millään osa suunnittelua tai tutkimuksen toteuttaminen edellyttää.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: tämä työ rahoitetaan kokonaan MacroGenics, Inc. kautta yritys- varainkeruun pääomasijoitusalalta. Kaikki kirjoittajat ovat työskennelleet MacroGenics, Inc. kun tämä työ on suoritettu ja omien optio ja /tai optio yhtiössä. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Syöpä kantasolu hypoteesi toteaa syövät syntyvät mutaatiotutkimukset tai epigeneettiset muutokset kudoksessa varteen (tai progenitorisolujen) soluja, jotka mahdollistavat nämä solut paeta ulkoisen ja sisäisen kasvun ehkäiseminen ja tulla invasiivisia [1]. Sen lisäksi, että vahvat todisteet tukevat tätä hypoteesia hematopoieettisen syöpiä, on yhä enemmän todisteita siitä, että useita kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien aivot, paksusuoli-, rinta- ja keuhkosyöpä [2] ovat hierarkkisesti järjestetään osajoukon itseuudistuvien Stern- kuten soluja. Lisäksi on viime aikoina suoraa näyttöä Eläinmalleista että paksusuoli, aivot, ja ihosyöpiä voi syntyä kudoksesta kantasolujen kaltaisia ​​soluja läsnä aikuisen kudoksissa [3-5]. Varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia itseuudistumisen, tuumorigeenisyyteen, lääkeresistenssin ja kyky kerrata kaikkia solutyyppejä kasvaimen, ovat mahdollistaneet tutkijat käsitellä tärkeitä kysymyksiä biologia tämän solupopulaation, joka vastaa suoraan potilaiden hoitoa [3,6].

on todisteita sekä eläinmalleissa ja ihmisten sairauksien keuhkojen syövät ovat ne, jotka syntyvät kantasolujen kaltaisia ​​soluja [7-10]. Kuitenkin kantasolujen lähde (SC) mukana normaalissa keuhkojen kehittäminen, ylläpito ja korjaaminen vaurion jälkeen on jonkin verran hankalampaa kuin kudoksissa, kuten ihon tai paksusuolen (katsauksia varten katso: [11,12]), jossa useat ”ehdollinen ”kantasoluja on ajateltu olevan mukana korjaukseen eri keuhkon osien loukkaantumisen jälkeen [13]. Nämä voivat tai eivät voi olla samoja kantasoluja vastuussa kudoksen ylläpitoon [14]. On ehdotettu, että sisällä keuhkosyövässä, NSCLC (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) adenokarsinooman syntyvät SC keuhkoputken alveolaarinen risteykseen (BASC), levy- karsinoomista syntyvät pohjapinta SC keuhkoputkien ja henkitorven, ja pieni solu karsinoomat johtuvat keuhkojen neuroendokrii- solut [11,12].

Adenosquamous karsinooma (ASC) keuhkojen on harvoin alatyypin NSLC syöpä diagnosoidaan kasvaimia, jotka sisältävät sekä solujen levyepiteelikarsinooma ja adenokarsinooma (AC) histologinen fenotyypit (määritelty 10% kutakin). ASC koostuu 4-8% NSCLC, mutta on hyvin aggressiivinen niin että potilailla, joilla ASC on huonompi ennuste, että ne joko levyepiteelisyöpä tai adeno- karsinoomien [15]. On oletettu, että nämä kasvaimet syntyvät joko solujen seoksia, jotka ovat peräisin kahdesta kasvaimia erilaisia, edelleen mutaatio on yhtä tyyppiä, joka aiheuttaa muiden, tai monoklonaalinen alkuperää, jossa molemmat ovat peräisin yhteisestä, vielä tuntemattoman, esiaste [16-19]. Tutkimukset ASC kasvaimia potilaista ovat osoittaneet, että solut adeno- ja suomuinen osia kasvain on samanlainen, mutta ei välttämättä samoja, kromosomivirheet [16], tai mutaatioita, [17] viittaa siihen, monoklonaalinen peräisin tämän tyyppisen tuumorin. Tämä ei kuitenkaan ole todiste siitä, voiko näiden kahden fenotyypit syntyvän yksittäisen solun, ja solun, josta ASC saattavat olla peräisin jää tunnistamatta.

Tässä raportissa kuvaamme syövän kantasoluja, kuten solujen (CSLC ) eristettiin potilaista, joilla ASC määritellyillä seerumittomassa viljelyolosuhteissa. Lisäksi osoitamme, että nämä solut ovat ominaisuuksia itseuudistumisen, tuumorigeenisyyteen, ja etäpesäkkeitä. Kasvaimet, jotka ovat peräisin näistä soluista, nimetty LUCA22 ja LUCA35, mukaan lukien kloonatuista yksittäisistä soluista ja etäpesäkkeitä sisälsi sekä komponenttien glandulaarinen (adeno) erilaistumista ja alueet squamous erilaistumista, tukee monoklonaalisella peräisin tämän kasvain. CSLC kasvu ominaisuudet, geenien ilmentyminen ja kyky muodostaa haarautumisen rakenteiden 3D rinnakkaisviljelemällä keuhko strooman edelleen tukevat oletusta, että nämä CSLC ovat kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia. Lisäksi ksenografteissa johdettu näistä CSLC sisältävät positiivisten solujen Kromagraniini A, Mucin 5A, vimentiinin, pinta-aktiivisen proteiini D, akvaporiini 5 ja sytokeratiineja 5, 7, 14 ja 20, jotka osoittavat kykyä näiden solujen tehdään monilinjainen erilaistumista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ASC ovat monoklonaalisia alkuperältään ja mahdollisesti syntyvät alkeellisia keuhkoja kantasolu eroaa keuhkoputkien alveolaarinen kantasolu (BASC) tai pohjapinta kantasolu ylähengitysteiden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Keuhkosyöpä kudokset saatiin kautta National Disease Research Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6. kerros, Philadelphia, PA 19103 (url: https://ndriresource.org/) . Institutionaaliset Sisäiset asiakasriskiluokitukset hyväksyi NDRI protokollia kudosten hankintaan ja käyttöön, ja asianmukainen suostumus saatiin potilailta NDRI. Tietoa ei ollut saatavilla, jotka olisivat millään tavalla vaarantaa anonymiteetin potilaista. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. MacroGenics West Institutional Animal Care ja käyttö hyväksyi kaikki protokollat ​​hiirillä. Kaikki Leikkaus suoritettiin nukutuksessa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Eläimet tarkastettiin päivittäin ja sairaiden eläinten poistettiin ja lopetettiin. Kaikki eläimet lopetettiin lopussa kokeen ennen kudoksen keräämistä. Eutanasia oli CO2 tukehtumisen toimitetaan pakattuna kaasupullo.

CSLC valinta, laajennus- ja luonnehdinta

Keuhkosyöpä kudokset saatiin kautta National Disease Research Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6. kerros, Philadelphia, PA 19103. Institutional Sisäiset asiakasriskiluokitukset hyväksyi protokollat ​​kudosten hankintaan ja käyttöön, ja asianmukainen suostumus saatiin potilailta NDRI. Keuhkosyöpä johdetut solulinjat laajentunut ASC ja AC kasvaimet (tai kasvain strooman) sekä päällikön ja työsolupankkien valmis. Lyhyt tandem-toisto (STR) analyysi käytetään tunnistamiseen.

määritellyt ehdot soveltuvat ihmisen normaalista keuhkokudoksesta epiteelin kantasolujen /esisolujen [20] käytettiin aluksi ja sitten optimoitu empiirisesti eristämistä ja syöpäsolujen kasvun kudoksen kuten aikaisemmin on kuvattu [21]. Seerumittomuuteen olosuhteet olivat peräisin rikastuttavat varten, ja sallia laajeneminen, pienen populaation soluja ASC ja AC (mutta ei levyepiteelisyöpä (SCC)) keuhkojen. Lisäksi 1-2% seerumia hormoni täydentää tai lisäravinteen korkea 10% (v /v) seerumin johti ei-tuumorigeenisiä solupopulaatio rajalliset kasvumahdollisuudet

in vitro

ja ominaisuudet stroomasoluissa . Katso menetelmät S1 ja taulukko S1 yksityiskohtaiset menetelmät solujen eristäminen kasvaimia; ja määritelty median ja täydentää pitoisuuksien valinnassa, laajentamiseen, kloonaus ja erilaistumista ASC-CSLC; ja laajentaminen stroomasolujen. Olosuhteet erilaistumista keuhkojen kantasolujen 3 ulotteinen Matrigel

TM viljelmiä muokattu Delgado, et al kuvatulla tavalla Methods S1. Kasvain näytteet ja eristetyt CSLC linjoja kaupallisesti tunnusomaista niiden ainutlaatuinen Short Tandem Toista kuvioita 16 STR alueilla. Tämä analyysi on kuvattu menetelmät S1 ja yhteenveto taulukossa S2.

kasvaimen tyyppi ja vaihe (alkaen patologiaraporteista) ja 4 kasvaimen CSLC ja 3 strooman CSLC viljelmät on esitetty taulukossa S3. Viisi ATCC-solulinjat, jotka ovat peräisin AC, SC ja ASC käyttäen seerumia sisältävällä elatusaineella, käytettiin verrokkeina useissa kokeissa. Ominaisuudet nämä rivit on koottu taulukkoon S4

geneettisiä analyysejä

Käänteistranskriptaasilla (RT-PCR) analyysi.

DNA eristettiin eläinten näytteistä käyttäen Wizard SV Genominen DNA Purification kit noudattamalla valmistajan protokollan (Promega). Ihmisen DNA kvantifioitiin PCR: llä käyttäen ihmisen erityinen RPL19 geenin alukkeita ja koettimia [22]. Alukkeet hankittiin SA biotieteiden kuin ”RT

2 qPCR Primer määritykset”. Luettelo alukkeiden ja luettelo numerot esitetään taulukossa S5. Arvioida spesifisten geenien RT-PCR-reaktiot suoritettiin cDNA tuotettu kokonais-RNA eristettiin yksittäisistä CSLC viljelmät käyttäen RT² qPCR Primer määritykset ja

GAPDH

(glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi), kuten konstitutiivisesti aktiivinen geeni ohjaus, ja RT² SYBR® Vihreä /ROX qPCR Mastermix (Qiagen). Ilmentyminen valitun geenin määritettiin myös normaaleissa ihmisen keuhko- ja eristetty normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa. Kynnys Cycle (Ct) kunkin alukesarjan määritettiin ajamalla RT-PCR-reaktioissa ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Life Technologies Corporation). DCT kunkin ISC geenin määritettiin (Ct [geeni] – Ct [GAPDH]), sitten suhteellinen Expression GAPDH määritetään 2

-DCt.

Short tandem-toisto (STR) analyysi.

Sixteen-lokuksen lyhyen tandem-toisto (STR) analyysi suoritettiin alkuperäisestä kasvaimesta näytteitä, jos riittävää materiaali oli saatavilla (7/9 tapausta), master ja työsolupankkien ja pituussuunnassa useissa välein kullakin linja, sekä kudoksista leikattiin hiiren tuumoriksenografteja arvioida identiteettiä. STR-analyysi suoritettiin AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City CA). Amplified loci ladattiin Applied Biosystem 3730xl Automated Sequencer ja analysoitiin käyttäen Applied Biosystem GeneMapper ohjelmistoversion 4. MSI-H diagnosoitiin läsnäolo alleelinen epävakauden yli 5 15 peittyvästi STR loci [23].

mutaatio analyysi.

mutaatio analyysi solulinjoissa toteutettiin kaksi toisiaan täydentäviä menetelmiä. Analyysi

KRAS

eksonin 2,

BRAF

eksonin 15,

PIK3CA

eksonit 9 ja 23, sekä Mutaatio Cluster alue (MCR) on

APC

eksoni 15 suoritettiin sekvensoimalla monistettu genomista DNA aikaisemmin kuvatulla [24,25]. MALDI-TOF-massaspektrometrialla alustan ja OncoCarta paneeli käytettiin havaitsemaan mutaatioita 238 sivustoja 19 geenilokusten, mukaan lukien edellä, kuten aikaisemmin on kuvattu [26].

Virtaussytometrianalyysi

Viljellyt solut poistettiin kollagenaasi /dispaasi (Roche Applied Science), tai trypsiini /EDTA: a (Invitrogen), pestiin, ja suspendoitiin uudelleen F12 /DMEM-alustassa (Gibco /Invitrogen) + 1,0% BSA (Rockland Immunochemicals). Solulaskennat saatiin käyttäen Guava ViaCount reagenssit (Guava Technologies). Viisikymmentätuhatta elävät solut jaettiin pyöreäpohjaiseen, alhainen sitovia HTS 96-kuoppaisille levyille (Beckton Dickinson), inkuboitiin vasta-aineella 4 ° C: ssa 20 min., Pestään analyysi puskuriin, ja vasta-värjätään tarvittaessa 2 ug /ml GAM-IgG (H + L) konjugoitu Alexafluor532 tai PE (Invitrogen). Solut pestiin ja joko vahvistetaan analyysiin puskurissa + 0,1% formaldehydiä (Polysciences), tai suspendoitiin uudelleen analyysissä puskuriin, sitten analysoitiin Guava-PCA96 tai FACScan (Becton Dickinson). Data analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (TreeStar Inc.). Tulokset laskettiin sitoutumisen intensiteetti (log

10 [värjättyä] – log

10 [isotyyppikontrolli]). Katso menetelmät S1 ylimääräisiä yksityiskohtia. ALDH arvioitiin käyttäen vuopohjainen ALDEFLUOR

® määritys (Stem Cell Technologies) [27] kanssa alustan titrattiin 1:10 1: 100 laimennus.

Kaksikantaisten immunovärjäyty- analyysi CK5 /7 sitova, konfluentteja levyt solut irrotettiin 0,05% trypsiini /EDTA: ta, neutraloitiin soijapavun trypsiini-inhibiittori, ja pestiin sentrifugoimalla. Saatu pelletti kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) ja sen jälkeen permeablization 0,1% Triton-X-100: Primary antiseerumia lisättiin 1:50 hiiren anti-humaani-sytokeratiini 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459), lisättiin samaan aikaan kuin 0,5 ng /ml hiiren anti-humaani-sytokeratiini 5 (BioCare Medical, # PM234AA). Toissijainen antiseerumi oli 1 ug /ml vuohen anti-kani-Alex Fluor 488 (Life Technologies ™), lisättiin samanaikaisesti 1 ug /ml vuohen anti-hiiri-R-Phycoerytherin (Life Technologies ™). Unstained näytteitä, sekundaarinen vain näytteitä, ja yksittäinen perusnäyte verrokkia käytettiin analyysissä.

In vivo kasvainten muodostumiseen

CSLC linjat istutettiin alle munuaiskapselin (SRC) immuunijärjestelmän puutosta NOD-SCID yhteisen γ-ketju reseptorin hiirten (NSG) hiirten kollageenin upotettu soluissa kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],22,28] ja annettiin kasvaa jopa 32 viikkoa. Eläimet tutkittiin 2-8 kuukautta kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Kasvaimet poistettiin ja upotettiin IHC tai erotettu yksittäisiä soluja ja käytettiin PCR tai merkkiaine analyysi kuten on osoitettu.

immunohistokemia

Kiinteät kudoksiin.

Leikatut -tuumoriksenografti kudos fiksoitiin 10% neutraalissa formaliinilla (Sigma), upottaa parafiiniblokkiin ja 5pm kohdat leikataan. Objektilasit de-paraffinized ja rehydratoitiin, esikäsitelty antigeenin haku (sitraatti pH 6) on decloaking kammion (biocare Medical), ja värjättiin 1 tunnin ajan osoitti anti-ihmisen vasta-aineita (esim CD34, CD44) käyttäen toimittajan protokollan ( biocare Medical). Objektilasit huuhdeltiin PBS: llä ja inkuboitiin 30 minuuttia vuohen anti-hiiri-HRP: tä (MACH2, biocare Medical) ja diaminobentsidiini kromogeeni alustan, sitten kevyesti vastavärjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

Frozen kudoksiin.

jääleikkeille ihmisen normaali keuhko ja keuhkosyövän, LUCA johdettu ksenografteissa, solupellettejä 2D kulttuureista, tai organoids 3D kulttuuri upotettiin OCT, sitten kryostaatti leikattiin 7 um. Serial leikkeet kiinnitettiin 4 ° C: ssa asetonia 10 minuutin ajan, ja kuivattiin ilmassa 30 minuuttia. Laseja inkuboitiin 3% H

2O

2 10 minuuttia ja sen jälkeen kaksi huuhtelua puskuriin. 5% normaalia vuohen seerumia levitettiin dioja 10 minuuttia, sitten puhalletaan pois. Laseja inkuboitiin tutkittavan vasta-aineita (pitoisuudet ja inkubaatioaikojen määräytyy edellinen optimoidut protokollat) ja pestiin kahdesti puskurilla. Controls inkuboitiin isotyyppikontrolli vasta-ainetta, joka vastaa kutakin kokeellista vasta-aine testataan. Seuraavat primaarisen vasta-aineen inkuboimisen jälkeen levyille inkuboitiin Dako Envision HRP anti-hiiri tai kaniini polymeeriä 30 minuuttia, mitä seurasi kaksi huuhtelua puskuriin. Diaminobenzidene tetrahydrochloride (DAB) käytettiin kromogeenina visualisoida värjäystä.

Immunofluoresenssi on yksikerrosviljelmissä.

Soluja kasvatettiin joko lasipeitinlevyille tai lasia kammioon dioja (Lab-Tek), sitten kiinnitettiin 4% PFA ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100. Ensisijainen antiseerumi 1 ug /ml hiiren anti-humaani-sytokeratiini 5 (BioCare Medical, # PM234AA), lisättiin samanaikaisesti kuin 1: 100 laimennosta kanin anti-ihmis-sytokeratiini 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459). Toissijainen antiseerumi oli 2 ug /ml vuohen anti-hiiri Alex Fluor 488 (Life Technologies ™), lisättiin samanaikaisesti 2 ug /ml vuohen anti-kani-Rhodamine Red ™ X (Life Technologies ™). Hiiren IgG1 käytettiin isotyyppikontrolli, ja toisen vain olosuhteita käytettiin ei-spesifisen värjäytymisen valvontaa. Immunovärjäys visualisoitiin Nikon TE300 mikroskooppi, jossa on ET Sedat Quad Filter Set ja Retiga EXi CCD-kamera. ivision ohjelmistoa käytettiin kaapata kuvia.

Tulokset

LUCA CSLC luonnehdinta

Tuumorikudos, kuljetetaan jäällä, saatiin kiila resektio ensisijainen keuhkokasvaimia. Kudos hajotettiin ja solut maljattiin seerumittomissa olosuhteissa (tai väliaineessa, joka sisältää seerumia laajentamiseen stroomasoluissa). Tämä on määritelty, väliaine ja laajennettu pieni osa epiteelisolujen 3 4 keuhkojen adenokarsinoomat (AC) (LUCA 32, LUCA33) ja 2 2 adenosquamous karsinoomien (ASC) (LUCA22, LUCA35) kudoksiin. Sen sijaan ei onnistunut viljelmiä saatiin squamous kohdunkaulan kudosnäytteistä (4 erillistä yritystä) käyttämällä tätä samaa alustaa. Lisäämällä seerumia aloittamisesta primääriviljelmien kasvain tuloksia alussa laajentamiseen stroomasolujen 3 3 tapauksissa (esim LUCA11 (1% seerumia + hormoni lisäaineet), LUCA36 (10% seerumia)), joka voi olla laajennettu rajoitetun passage ja varastoitujen. Nämä stromasoluja on fibroblastisella ulkonäkö 10% FBS ja eivät ole tuumorigeenisia kun istutetaan 5×10

5 alla Saharan munuaisten kapseli immuunipuutteiselle hiiren.

STR karakterisointi ja mutaatioanalyysin kasvain- soluviljelmissä

Short tandem-toisto (STR) analyysi 16 sivustoja antoi ainutlaatuinen kuvio kullekin 6 riviä, jotka erosivat toisistaan ja mistä tahansa ATCC linjat (katso taulukko S2). Kolme 4 riviä osoitti jonkin verran Heterotsygotian menetys verrattaessa kasvaimen näytteen (joka sisältäisi ei-kasvainsoluja) ja CSLC. Jotkut voitto Heterotsygoottisuuden nähtiin laajennettu passage (P47 = 150 populaation kaksinkertaistumista).

Mutaatioanalyysit paljasti, että 100%: n ASC (LUCA22) CSLC näyttelyitä yhden G12V pistemutaatio sisällä koodausalueissa

KRAS

ilman mutaatioita löytyy

APC

tai

PIK3CA

. AC linjat (LUCA32 ja LUCA33) oli myös yksi pistemutaatio KRAS vain (G12V ja G12C vastaavasti) (taulukko S3).

tuumorigeenisyyteen ja etäpesäkkeitä

testaamiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa, LUCA22 soluja eri siirrosten (5x10e4, 5x10e3 tai 5x10e2) upotettiin kollageenia painikkeet ja istutettu alle Saharan munuaisten kapseli (SRC) vakavasti immuuni puutteellinen NSG hiirillä. Kasvaimet havaittiin kaikkina solussa siirrosten 31 viikon aikana (kuvio 1, taulukko S6). Suurempi solujen siirrosten etäpesäkkeitä havaittiin monissa elimissä jo 10 viikko sen jälkeen, kun SRC implantaation. Etäpesäkkeet kasvoi jakelu- ja kooltaan aikaa kaikkien eläinten ympätty korkein solujen määrä osoittaa etäpesäkkeitä 16 viikkoa tai pidempään. Etäpesäkkeitä nähtiin maksassa, pernassa, haimassa, suoliliepeen, pallean ja joskus kaukaisiin kohteisiin, kuten keuhko- ja aivot (kuvio 1). Solut istutettiin ihonalaisesti kasvoi kasvaimia, mutta ei etäispesäkkeitä (5x10e5, enintään 24 viikkoa).

vertailu morfologia ja histopatologia alkuperäisen potilaan kasvain, josta LUCA22 on peräisin ja ksenografteissa ja etäpesäkkeitä johdettu LUCA22 CSLC. Osat kasvaimet värjätään H AC: LUCA32, LUCA33) ja 2 strooman linjat (LUCA11, LUCA36) analysoitiin virtaussytometrialla sitoutumisen paneelin vasta-aineiden ihmisen markkereita käytetään usein valitsemiseksi, tai tunnistaa, CSLC kiinteiden kasvaimien (kuvio 4 B). CD44 ja CD29 olivat läsnä kaikilla radoilla, kuten strooman linjat. CD24 oli läsnä kaikissa 4 CSLC linjat, mutta ei stroomasoluihin. Mikään linjat sitoutuneen jompikumpi CD133 monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on raportoitu valitsemaan CSC joissakin kasvaimissa, vaikka universaaliuden CD133 kantasoluja markkeri keuhkosyövässä on kyseenalaistettu [12]. Mucin 1 (MUC1) ja vaihespesifisellä alkioantigeeni 1 (SSEA1) ilmaistiin korkeammalla tasolla AC linjat kuin ASC linjat kun ABCG2 löytyy LUCA22, mutta ei muilla radoilla. Etsiä homogeenisuus väestön tilanteen LUCA22-5E11 klooni ja LUCA35 solulinjaa kaksinkertainen leimattiin CD24 /CD44 (kuva 4 C). Kaksinkertainen merkinnät osoitti, että yksi populaation sitoo molempia vasta-aineita. Neljä kloonia LUCA22 valittiin ja analysoitiin rinnakkain LUCA22 emolinjan. Sitoutuminen oli hyvin samankaltainen, että kloonien ja vanhempien linja useimmille markkereita unimodaalisesta jakaumia, vaikka jonkin verran vaihtelua huippu sitoutumista todettiin. (Kuva S5 A-C). Koska kantasolujen markkeri CD117 löytyi vain pieni osa CSLC, yritimme rikastaa tämän populaation FACS. Kun 4 peräkkäisen lajittelee, emme voineet lisätä prosenttiosuutta positiivisten solujen CD117, mikä viittaa siihen, että nämä solut eivät edusta erotettavissa alapopulaatio solujen CSLC (kuva S5 D).

Geeniekspressio CSLC linjat

laajemmin luonnehtivat geeniekspressiota näissä CSLC, tarkastelimme joukko 23 geenien valitaan niistä kuulemma ilmaistaan ​​AC ja SCC keuhkosyövässä ja eriytetty normaali keuhkojen solutyypeistä RTPCR. Ekspressiokuviota ASC linjojen oli ainutlaatuisia, että ne koekspressoi (myös kloonit) useiden geenien ajatellaan olevan ominaisia ​​AC ja SCC, sekä useita normaalin keuhkojen linjaa markkereita. Ilmaisu useita geenejä oli vahvasti säädellään ylöspäin ASC linjat verrattuna AC riviä (kuva 5), ​​mukaan lukien:

MAGEA3, MAGEA6, CSTA, TFPI2

,

KRT5, TWIST1

ja

PTHLH

. Näistä vain MAGEA3 /A6 ilmentyminen oli täysin rajattu keuhkosyövän soluihin ( 30X suurempi ASC kuin AC) ja ei nähdä lainkaan kasvaimen strooman tai normaali keuhkojen näytteitä. Tussit Muiden eriytetyn solutyyppejä ilmaistiin alhaisilla tasoilla CSLC (

SCGB1A1

, Clara-solut;

MUC5AC

, pikarisoluille;

AQP5

, tyypin I penumosyy-; ja

SFTPC

, BASC) tai hyvin vähäistä (

SFTPD

, tyypin II penumosyy-;

cHga

, neuroendokriinisoluissa).