Krooninen sairaus

tiivistelmä

endoteelikasvutekijä (VEGF) on tärkeä säätelijä angiogeneesiä. VEGF ilmentymistä jopa säädellään vastauksena mikro-ympäristön ärsykkeille huonosta verenkierto kuten hypoksiaa. Kuitenkin, VEGF: n ilmentymisen syöpäsoluissa ei rajoitu stressiä johtuvasta lisääntyneestä kasvaimen tilavuuden massaa. Lipidivälittäjäaineita erityisesti arakidonihapon johdettujen prostaglandiinin (PG) E

2 ovat sääntelyviranomaisten VEGF ilmaisun ja angiogeneesin paksusuolensyöpä. Lisäksi lisääntynyt osmolaarisuus, joka syntyy aikana paksusuolen veden imeytymistä ja ulosteet vakauttaminen näyttää aktivoida koolonkarsinoomasoluissa ja edistää PGE

2 sukupolvi. Sellaiset fysiologiset stimulaatio saattaa tarjota signalointi syövän edistämiseen. Täällä tutkimme vaikutus altistumisen hypertonisen keskipitkällä, jäljitellä paksusuolen ympäristöön, VEGF tuotantoa koolonkarsinoomasoluissa. Rooli samanaikaista PGE

2 sukupolvi ja MAPK aktivointi osoitettiin erityisten farmakologinen esto. Ihmisen koolonisyöpäsolulinja Caco-2 altistuu hypertoniseen ympäristön vastasi selvästi VEGF ja PGE

2 tuotantoa. VEGF tuotanto estyi selektiivisiä ERK 1/2 ja p38 MAPK polkuja. Vastatakseen säätelevän roolin PGE

2 VEGF tuotantoa, Caco-2-soluja käsiteltiin CPLA

2 (ATK) ja COX-2 (NS-398) estäjät, jotka estävät täysin PGE

2 sukupolvi . Caco-2-soluja käsiteltiin myös ei- selektiivinen PGE

2-reseptorin antagonisti. Jokainen hoito lisäsi merkittävästi Hypertonisen stressin aiheuttama VEGF tuotantoa. Lisäksi lisäämällä PGE

2 tai valikoiva EP

2 reseptoriagonisti aktivoituihin Caco-2-solujen esti VEGF tuotantoa. Autokriinisen estävä rooli PGE

2 näyttää olevan selektiivinen hypertonisen ympäristölle, koska VEGF tuotantoa aiheuttama altistuminen CoCl

2 pieneni estämällä samanaikaisesti PGE

2 sukupolvi. Tuloksemme osoittivat, että hypertonicity stimuloi VEGF tuotantoa koolonsyöpäsolulinjoissa. Myös PGE

2: lla estävä rooli VEGF tuotantoa Caco-2-solut altistettiin hyperosmotic stressiä EP

2 aktivointi.

Citation: Gentile LB, Piva B, Diaz BL (2011) hypertonisten stressi Aiheuttaa VEGF Production in Human koolonisyöpäsolulinja Caco-2: inhiboiva rooli autokriininen PGE

2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10,1371 /journal.pone.0025193

Editor: Ben C. B. Ko, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 17 joulukuu 2010; Hyväksytty: 30 elokuu 2011; Julkaistu: 28 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Gentile ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasilia) ja Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasilia) (jotta BLD) ja terveysministeriön (Brasilia) PhD apurahan (ja LBG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

muodostuu uusia verisuonia ennestään verisuonisto on keskeinen prosessi kehittämisessä eniten kasvaimia erityisesti kiinteät tuotteet. Tätä prosessia kutsutaan angiogeneesiä ja säätelee tasapainoa negatiivisen ja positiivisen biokemialliset signaalit. Juuri muodostunut verisuonet ovat vastuussa toimittaa happea ja ravinteita kasvaville kasvaimen massan ja reitti levittämistä metastaattisen syöpäsoluja. VEGF on näkyvin positiivisena säätelijänä angiogeneesin koska sen kyky rekrytoida endoteelisolujen hypoksinen sivustoja ja kykyä stimuloida tämän matkaviestintyyppisiä, edistää erilaistumista verisuonirakenteisiin [1]. VEGF ilme korreloi positiivisesti negatiivisen tuloksen syöpäpotilailla. Paksusuolen syöpä, VEGF: n ilmentyminen korreloi lisääntyneeseen metastaattista potentiaalia [2], kun taas ilmaus sen reseptori on markkeri lyhyemmän leikkauksen jälkeisten eloonjääminen [3].

VEGF ilme on jopa säännelty vastauksena mikro- ympäristön ärsykkeille huonosta verenkierto kuten hypoksiaa [4], asidoosi [5] ja alhainen ravinnepitoisuudet [6]. Kasvaimissa, alentuneet O

2 johtaa HIF-1α stabilointi, alayksikkö transkriptiotekijä HIF-1, ja sen jälkeen transkription geenien aktivaation esittää hypoksia-vastaavan elementin (HRE) niiden promoottoreita, kuten VEGF . Kuitenkin, VEGF-ilmentymisen asetus syöpäsoluissa ei rajoitu stressiä johtuvasta lisääntyneestä kasvaimen tilavuuden massaa. Useat muut tekijät on osoitettu indusoivan VEGF, kuten reaktiivisen hapen [7] – [9], kasvutekijät [10], [11], sytokiinit [12], ja lipidivälittäjäaineet [13] – [16]. Arakidonihappo johdettujen prostaglandiinin (PG) E

2 on tärkeä säätelijä VEGF ilmaisun ja angiogeneesiä usealla eri syöpätyyppejä ja paksusuolen syövän erityisesti. Eksogeeninen PGE

2 indusoi HIF-1α vakauttaminen [13] ja VEGF ilmaisun [17] koolonsyöpäsolulinjaa. VEGF: n ja COX-2: n ilmentymisen ja kasvainten angiogeneesin korreloivat positiivisesti paksusuolen syövän näytteissä [18] – [20].

Kuitenkin, hypoksia ei ole ainoa ulkoinen stressi ärsyke, joka aktivoi soluvasteita paksusuolen syöpä. Jatkuvasti muuttuvan sisällön suolistossa altistaa normaalia ja syöpä- epiteelisolujen lukemattomia ärsykkeitä. Sellaiset fysiologiset stimulaatio saattaa tarjota signalointi syövän edistämiseen. Itse asiassa, lisääntynyt osmolaarisuus, joka on prosessin aikana syntyneet paksusuolen veden absorption ja ulosteet vakauttamista [21] – [23] tulee aktivoida paksusuolen syövän soluja, ja edistävät COX-2: n ilmentymisen ja PGE

2 sukupolven, mutta ei aktivoi normaalin suoliston soluihin [24]. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli määrittää vaikutus Hypertonisen stressiä VEGF tuotantoa Caco-2 koolonisyöpäsolulinja. Mahdollinen rooli autokriinisiä PGE

2 ja MAPK signaalireaktioteissä modulaatio VEGF sukupolven analysoitiin myös.

Methods

reagenssit

Natriumkloridi (NaCl) oli saatu Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) ja liuotettiin steriiliin veteen kantaliuos 2 M pitoisuuden. IPLA

2-estäjä, Bromoenol laktoni (BEL), The CPLA

2 /IPLA

2-estäjä, arakidonyyli- trifluorimetyyli Ketoni (ATK), ja prostaglandiini E

2 ostettiin Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, MI) ja laimennettiin etanolissa vastaavasti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Estäjien COX-2, NS-398 (Cayman); p38, SB202190; JNK, SP600125; MEK1 /2, U0126 (kaikki BIOMOL, Plymouth Meeting, PA), laimennettiin DMSO: hon (Sigma). Monoklonaalisia vasta-aineita immunoblot määrityksissä olivat anti-COX-2-IgG-hiiri (klooni 33), BD Transduction Laboratories, ja anti-GAPDH (klooni 6C5) IgG-hiiren Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), joka oli laimennettu 0,003 ug /ml. Vuohi HRP-sidoksissa sekundaarinen vasta-aine anti-hiiri-IgG Santa Cruz Biotechnology käytettiin 0,1 ug /ml.

Soluviljely ja hoitoja

Caco-2 (ATCC HTB-37, lahja Dr. José Morgado Díaz, Instituto Nacional de syöpä, Brasilia) solulinjaa ylläpidettiin Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 44 mM NaHCO

3, 1 mM NaH

2PO

4.H

2O, 1 mM natriumpyruvaattia, 10 mM HEPES, MEM-vitamiineja liuos, MEM välttämätöntä ja ei-välttämättömiä aminohappoja liuosta, 2 mM L-glutamiinia, 55 uM β-merkaptoetanolia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (kaikki soluviljelyreagenssit Invitrogen). IEC-6 solulinja (Rio de Janeiro Cell Bank, Brasilia) ylläpidettiin DMEM täydennetty 5% FBS ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja ylläpidettiin dosviljelypulloihin (solujen kasvuun pinta 25, 75 ja 150 cm

2). Solut kerättiin 0,25% trypsiiniä ja 0,38 g /l EDTA HBSS ilman Ca

++ ja Mg

++ ja 5 x 10

5 solua /kuoppa maljattiin 6-kuoppaisille tasapohjaisille levyille (ala 9,03 cm

2 /hyvin, Techno Plastic Products, Sveitsi). 1,9 ml: lla tuoretta täydennetyssä DMEM elatusaineeseen lisättiin viljelykuoppiin kanssa tai ilman farmakologisen estäjiä ja soluja inkuboitiin 15 min (30 min MAP kinaasien inhibiittorit) 37 ° C: ssa. Kaikki solut saivat saman määrän ajoneuvon siksi, että lopullinen pitoisuus oli alle 0,1% DMSO: ssa tai etanolissa, ja ei muuttanut solujen aktivaation. Soluja stimuloitiin lisäämällä 0-100 ui 2 M NaCl-liuosta. DMEM lisättiin hyvin saattamaan lopulliseen tilavuuteen 2 ml. Lopullinen osmolaarisuus keskipitkällä lisäyksen jälkeen 100 mM NaCl oli noin 540 mOsm verrattuna 367 mOsm of isosmoottisessa väliaineen. Medium osmolaarisuus oli määrittää empiirisesti jäädyttämällä menetelmällä käyttämällä osmometrillä (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). Minimoida vaihtelua kineettinen kokeissa koko ajan kulttuuri pinnoituksen jälkeen oli sama joka kerta kohta analysoitiin.

määritys PGE

2 ja VEGF supernatantit

PGE

2 tuotannon Caco-2 cell line määritettiin EIA viljelysupernatanttia vastaavasti valmistajan ohjeiden (Cayman) ja edellä kuvatulla tavalla [25]. Lyhyesti, elatusaine kerättiin 24 tunnin kuluttua solujen aktivaatiota hypertoniset stressiä ja sentrifugoitiin 250 x g: ssä 5 min poistamiseksi kelluvat solut ja jäädytettiin -70 ° C: ssa. PGE

2-tasot määritettiin käyttämällä monoklonaalista vasta PGE

2 EIA Kit. Kehittämisen jälkeen levy luettiin 405 nm levynlukijalaitteella (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). VEGF-tuotanto Caco-2-solulinjaa määritettiin ELISA: lla viljelmän supernatantista vastaavasti valmistajan ohjeiden (R NaCl 150 mM, pH 7,4) 12 tuntia COX-2 merkintöjä, tai 2 h kaikkien muiden vasta-aineiden huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettu TTBS (TBS 0,2% Tween 20) ja 0,05% natriumatsidia 2 tuntia huoneenlämpötilassa COX-2 tai 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa muiden vasta-aineiden. Sen jälkeen toissijainen merkinnät HRP-kytkettyä anti-IgG-vasta-aineita, proteiinit analysoitiin käyttämällä ECL Western blotting Analysis System (Amersham Biosciences).

Tilastollinen

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvo (SEM) kokeiden suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kuvaajat ja western blotit Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Useat vertailut Blandgrupp tehtiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin tai Dunnettin testi (Prism versio 4.03, Graphpad Software, Inc. La Jolla, CA). Symbolit

+ ja * edustaa

p

arvojen 0,05 verrattuna ohjaamaan muita kuin kannustanut ryhmä tai ylijännittyneestä stressi /CoCl

2-stimuloitujen ryhmä vastaavasti.

Tulokset

Hypertoninen stressi indusoi VEGF tuotantoa Caco-2 ja PGE

2 moduloi angiogeeninen tekijä tuotanto tässä ympäristön stressi

Hypertoninen stressi stimuloi VEGF tuotantoa Caco-2 24 tunnin kuluttua aktivoinnin ( kuvio 1A) sen jälkeen, kun sama annos vaste ja ajan myötä (aineistoa ei esitetty) PGE

2 sukupolven samoissa stimuloivan olosuhteissa [24]. Koska PGE

2 on kuvattu olevan rooli angiogeneesissä ja VEGF tuotantoa päätimme onko PGE

2 oli säännellä VEGF tuotantoa Caco-2 aikana stimulaation hypertonisten välineellä. Inhibitioanalyysissä PGE

2 tuotanto käsittelemällä CPLA

2 (ATK) (kuvio 1 B) tai COX-2 (NS-398) (kuvio 1 C) estäjät lisääntyi VEGF tuotantoa. Tämä ilmiö on päinvastainen lisäämällä PGE

2 soluviljelyväliaineeseen (kuvio 1 D) osoittaa erityinen tehtävä PGE

2.

(A) Caco-2-soluja stimuloitiin 10 -100 mM NaCl aikana 24 tuntia ennen VEGF tuotantoa analyysiä. VEGF tuotanto määritettiin ELISA: lla Caco-2-solut stimuloidaan hypertonisella stressi (100 mM NaCl) aikana 24 tuntia esikäsittelyn jälkeen estäjien CPLA

2, ATK (B); COX-2, NS-398 (C) tai PGE

2 (D). HCT116 soluja stimuloitiin 100 mM NaCl aikana 24 tunnin kuluttua esikäsittely estäjillä CPLA

2, ATK (E); COX-2, NS-398 (F). +, *

p 0,05

, ei-stimuloiduista tai stimuloitujen solujen, vastaavasti. **

p 0,05

, verrattuna NS-398-käsitellyt solut. Kaavio palkit osoittavat keskiarvoja ± SEM kolmesta näytteestä.

Voit tarkistaa, onko VEGF tuotantoa Caco-2 stimuloidaan hypertonisten stressi oli seurausta PGE

2 toiminta eikä seuraus nonespecific toiminta farmakologisten lääkeaineiden käytettiin kokeissa, teimme sama kokeilu HCT116, paksusuolen syövän solulinja, joka ei ilmennä COX-2 ja ei tuota havaittavia määriä PGE

2 mukaisesti hypertonisten stressiä. Emme havainneet mitään muutoksia VEGF tuotantoa, ilman mahdollisuutta sekaantumista farmakologisen estäjien (kuviot 1E ja F). Nämä tulokset osoittivat, että PGE

2 tuottama Caco-2 aktivoidaan hypertonic stressi on autokriini estävä vaikutus VEGF tuotantoa.

EP

2-reseptori on rooli säätelyssä VEGF tuotantoa PGE

2 Caco-2 stimuloidaan hypertonisten stressi

Voit selvittää, mikä on vaikutusmekanismi PGE

2 sääntelyssä VEGF tuotantoa hypertonisessa stressi, Caco-2-solut aktivoitiin hypertonisella keskipitkän aikana 24 tuntia ja käsiteltiin AH6809, EP reseptoriantagonisti. Varmistimme inhibitio EP-reseptorin signalointi aikaansai VEGF tuotantoa (kuvio 2A). Sitten, mitkä erityiset reseptori osallistuu tähän ilmiöön Caco-2 stimuloitiin hypertonisten keski- ja käsiteltiin ATK ja EP-reseptorien agonistit. CPLA

2-estäjä (ATK) poistanut häiriön PGE

2 tuottama koolonkarsinoomasoluissa ja EP reseptorit aktivoituvat vain ulkoisesti lisätty agonistit. Niinpä kuvio 2B esittää, että hoito ATK lisää VEGF tuotantoa ja kun PGE

2 tai 16,16-dimetil PGE

2, yleiseurooppalainen EP reseptoriagonisti, lisättiin keskipitkän tämä vaikutus oli päinvastainen, vahvistavat, että EP -reseptorin aktivointi on estävä vaikutus VEGF: n tuotantoa. Lisäys VEGF tuotantoa estämällä endogeenisen PGE

2 oli myös päinvastaiseksi butaprost, erityinen EP2 reseptoriagonisti (kuvio 2B). Aktivointi EP1, 17-fenyyli-Trino-PGE

2, tai EP3, sulprostonia, agonistit ollut vaikutusta kasvoi VEGF tuotantoa. Koska EP4 ilme näyttää olevan poissa Caco-2-solujen [26], tuloksemme osoittavat, että endogeeniset PGE

2 moduloi VEGF tuotantoa aiheuttama hypertonic stressi aktivoimalla EP2.

(A) Caco-2 soluja stimuloitiin hypertonic stressi (100 mM NaCl) aikana 24 tuntia esikäsittelyn jälkeen EP ja DP-reseptorit antagonisti, AH 6809 (A); jossa estäjän CPLA

2, ATK (10 uM); PGE

2; EP reseptorit agonisti, 16,16-dimetyyli Prostaglandiini E

2; EP1 ja EP3-reseptorit agonisti, 17-fenyyli trinor Prostaglandiini E

2; EP2-reseptorin agonisti, butaprost ja EP3-reseptorin agonisti, sulprostonia (B); tai PKA-estäjä, H-89. PGE

2 ja sen analogeja käytettiin 0,1 uM. VEGF-tuotanto määritettiin ELISA: lla Caco-2-soluja. +, *

p 0,05

, verrattuna ei-stimuloitujen solujen tai stimuloitujen solujen, vastaavasti. **

p 0,05

verrattuna ATK-käsitellyt solut. Kaavio palkit osoittavat keskiarvoja ± SEM kolmesta näytteestä.

EP2 on rodopsiinin tyypin reseptorin kytketty Gs ja välittää nousu leirillä [27]. Niinpä testasimme jos PKA ollut merkitystä PGE

2 vaikutukset välittyvät EP2 aikana hypertonisten stressiä. Esto PKA H-89 lisäsi VEGF tuotantoa Caco-2-solut altistettiin hypertoninen keskipitkän (kuvio 2C). Vahvistaminen potentiaali estävää reitti, johon liittyy PGE

2-EP2-cAMP-PKA.

rooli hormonaalisten PGE

2 CoCl

2 aiheuttama VEGF tuotantoa

Myös tarkisti, oliko PGE

2 oli rooli sääntelyn VEGF tuotantona standardin simulatory kunnossa. Aktivoi Hypoksia-aiheuttama Factor (HIF) reitin ja simuloida hypoksia, Caco-2-solut aktivoitiin CoCl

2. 24 tunnin kuluttua stimuloitaessa CoCl

2, Caco-2 esitetään selvästi PGE

2 (kuvio 3A) ja lisääntyneen ekspression COX-2 (kuvio 3B). Lisäksi kokeet suoritettiin sen jälkeen, kun lisäyksellä 1 mM CoCl

2 väliaineeseen 24 tunnin kuluttua aktivaatiosta. Lisäksi, CoCl

2-stimuloiduissa PGE

2 sukupolvi on riippuvainen COX-2, koska se inhiboitui täysin NS-398 (kuvio 3C).

Caco-2-soluja stimuloitiin 0,1- 1 mM CoCl

2 aikana 24 h, ennen kuin PGE

2: n ja VEGF tuotantoa (A ja D, vastaavasti) ja COX-2-proteiinin ekspressio (B) analyysi. PGE

2 ja VEGF tuotantoa Caco-2-soluja stimuloidaan 1 mM CoCI

2 aikana 24 tunnin kuluttua esikäsittely estäjä COX-2, NS-398 (C ja E, tässä järjestyksessä). VEGF tuotantoa Caco-2-solut stimuloidaan 0,1-1 mM CoCI

2 aikana 24 h (D). PGE

2: n ja VEGF tuotantoa määritettiin ELISA: lla Caco-2-soluja. COX-2 ja GAPDH ilmentyminen solupelletit analysoitiin Western-blottauksella. +, *

p 0,05

, verrattuna ei-stimuloitujen solujen tai stimuloitujen solujen, vastaavasti. Kaavio palkit osoittavat keskiarvoja ± SEM kolmesta näytteestä.

Samanlainen hypertoninen stressiä stimulaatiota, CoCl

2-solu- myös tuottanut VEGF (kuvio 3D). Kuitenkin autocrine PGE

2 näyttää olevan päinvastainen vaikutus tässä kunnossa, koska NS-398 käsittely esti VEGF tuotantoa (kuvio 3E). Nämä tulokset osoittavat, että PGE

2 on stimuloiva autokriinisella rooli VEGF tuotantoa CoCl

2 aktivointi.

rooli MAPK VEGF tuotantoa Caco-2-solut

Määritä jos VEGF tuotantoa säädellään eri tavalla in Caco-2-solut kuin potentiaali autokriinisen roolia PGE

2, käännyimme tunnistamiseen MAPK reittejä mukana. Koska olemme osoittaneet aikaisemmin rooli ERK 1/2, JNK ja p38 PGE

2 sukupolven [24] ja välttää mahdollisen ongelman tämä saattaa aiheuttaa tulkita tuloksia, kokeet suoritettiin, kun läsnä oli 1 JlM NS-398. Farmakologinen esto ERK 1/2 ja p38 osoitti yhteinen rooli aktivoituminen joko hypertonic stressi tai CoCl

2 (kuviot 4A ja B). JNK rooli oli suppeampi, koska SP 600125 selvästi esti VEGF: n tuotanto indusoitiin CoCl

2 aktivointi, kun se ei vaikuttanut VEGF tuotantoa aiheuttama hypertonic stressi (kuviot 4A ja B).

estäjät JNK, SP600125 ; p38, SB202190; ja MEK 1/2, U0126 lisättiin ennen stimulaatiota hypertonisella stressi (100 mM NaCl) (A) tai 1 mM CoCl

2 (B) 24 tuntia. Caco-2-soluja esikäsiteltiin 1 uM NS-398 estää endogeenisen PGE

2 tuotannon kaikissa näytteissä. VEGF-tuotanto määritettiin ELISA: lla Caco-2-soluja. +, *

p 0,05

, verrattuna ei-stimuloitujen solujen tai stimuloitujen solujen, vastaavasti. Kaavio palkit osoittavat keskiarvoja ± SEM kolmesta näytteestä.

Keskustelu

rooli PGE

2 syövän kehittymisessä on yleensä kuvattu Autokriinisenä tekijä, joka kykenee moduloimaan monista näkökohdista syöpä solubiologian, erityisesti epiteelin alkuperä [28], [29]. PGE

2 on osoitettu lisäävän leviämisen, metastaattisen kapasiteetti ja tuotannon pro-angiogeenisten tekijöiden [17], [30], [31]. Tällaiset tutkimukset yleensä ole tietoisia ärsykkeitä, jotka ajavat arakidonihappokaskadin ja lopulta PGE

2 sukupolven pidemmälle indusoima COX-2. Olemme viime aikoina osoittaneet, että hyperosmotic miljöössä voi aiheuttaa COX-2 ilmaisun ja PGE

2 sukupolven Caco-2 koolonsyöpäsoluihin [24]. Tärkeintä on, hyperosmolaarisuus voi laukaista rajoittava vaihe PGE

2 sukupolven aktivoimalla CPLA

2-α ja houkutella vapauttamaan vapaan arakidonihapon. Normaalit suolen epiteelisolujen ei osoittanut PGE

2 samoissa hyperosmotic ärsyke. Havaittuaan relevantti fysiologisten ärsyke paksusuolen syöpäsoluissa, tutkimme vaikutus Hypertonisen väliaineen tuotantoon suurten pro-angiogeeninen tekijä, VEGF, ja mahdolliset autokriinisen vaikutuksen PGE

2.

Exposure Caco-2-solujen hypertonisen keskipitkällä johtanut merkittävään tuotannon VEGF. Kuten edellä on osoitettu ennen tämän VEGF tuotantoa esiintyi rinnakkain PGE

2 sukupolvi. PGE

2 kuvataan indusoi VEGF perustuvat kokeisiin, joissa COX-2 yliekspressio lisäsi VEGF tuotantoa paksusuolen ja rintasyövän solulinjoissa. Lisäksi tämä VEGF-tuotanto inhiboitui selektiivisten COX-2-estäjät. Siksi pyrittiin tutkimaan autokriinisen vaikutusta PGE

2 sukupolvi Caco-2-soluja stimuloidaan hypertonisten välineellä. Yllättäen inhibitio joko CPLA

2 tai COX-2, ATK tai NS-398 vastaavasti, entisestään tuotannon VEGF. Tämä vaikutus voi johtua esto PGE

2 sukupolvi kuin palauttaminen PGE

2 tasoa eksogeeninen palautui VEGF tuotantoa alkuperäiseen tasolle ATK käsitelty Caco-2-soluilla. HCT116-solut voidaan myös aktivoida hypertonic väliaine tuottaa VEGF. Kuitenkin HCT116-solut eivät express COX-2 eivätkä tuota PGE

2 [31], vaikka solut aktivoidaan vai ei. Siten puute vaikutuksesta ATK ja NS-398 on HCT116 sulkee pois mahdolliset armottoman vaikutukset nämä inhibiittorit [32].

PGE

2 vaikuttaa ryhmä G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptorien ( GPCR: t). On neljä GPCR: ien reagoida PGE

2 nimetty alatyyppejä EP1, EP2, EP3 ja EP4, mikä johtaa erillisten signalointireitin ja yleinen biologinen vaikutus [27]. Määrittää riippuvuus PGE

2 autokriininen vaikutus EP signaloinnin, käytimme epäspesifinen antagonisti kaikkien neljän EP-reseptoreihin, AH 6809. Käsittely AH 6809 matkia vaikutus VEGF: n tuotannon PGE

2, mikä osoittaa, että PGE

2 signaalien kautta plasmakalvoreseptoreihin saadaan säädeltyä VEGF tuotantoa aiheuttama hypertonisten välineellä. Erityisesti alatyypin mukana näyttää olevan EP2 sen agonistia, Butaprost, pystyy täysin korvata PGE

2. Vastakkaisella, ei EP1 eikä EP3- agonistit hoidot esitetään estovaikutusta VEGF tuotantoa. EP2 näyttää pari lisääntynyt cAMP-tasoja ja myöhemmän aktivoinnin PKA, koska esto PKA H-89 toistaa vaikutuksia estämällä PGE

2 sukupolvi tai toimintaa. On tärkeää huomata, että kokeet suoritettiin PGE

2 ja sen analogit pitoisuuksina, jotka olivat yhteensopivia endogeenisesti tuotetun tasoa. Vaikutukset VEGF tuotantoa koolonkarsinoomasoluissa ovat katsoneet PGE

2 käyttäen pitoisuuksia jopa 100 uM [13], mikä huomattavasti ylittää PGE

2 todella tarvitaan aktivoimaan sen reseptoreihin [27] tai mikä on tuotettu kasvainten massa [33].

on osoitettu aktivointi EP2-cAMP-PKA-GSK-3-signalointireitin johtaa vähentää beeta-kateniinin fosforylaation, mikä mahdollistaa sen translokaation ja aktivoinnin Tcf /LEF riippuvaisen transkription (katsaus, katso [34]) liittyvien geenien syöpää, kuten COX-2 ja VEGF. Kuitenkin mallimme Hypertonisen stressi, EP2 signalointireitin aktivaatio aiheuttaa tukahduttaminen VEGF tuotantoa. Jotta ymmärtää paremmin sääntelyn tämän väylän Hypertonisen stressi tutkimme rooli GSK-3in tämä aktivointi käyttämällä SB216763, kilpailukykyisen GSK-3 α ja β-estäjä (50-5000 nM, tuloksia ei ole esitetty). Hoito lisäsi VEGF tuotantoa, mikä osoittaa, että inhiboiva vaikutus EP2 on angiogeeninen tekijä tuotanto ei ole riippuvainen tämän kinaasin. Yksi mahdollisuus erillisten vaikutuksen EP2 aktivaation hypertonic stressi on, että tämä asetus tapahtuu läpi cAMP. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, cAMP voi estää sytokiinien tuotanto estämällä Ras-riippuvaisten signaalien PKA, inaktivoimalla MEK /ERK signaloinnin tai estämällä fosforylaation p38 MAPK [35] – [37]. Kuten ERK /p38 MAPK-reitin osallistuu mallissamme asiakkuutta VEGF tuotantoa, tällaiset havainnot saattaa osoittaa mekanismi, jolla EP2 signalointi estää VEGF tuotantoa hypertonisia stressi.

Voit selvittää estävää roolia PGE

2, voidaan laajentaa muihin ärsykkeisiin, käytimme CoCl

2 aiheuttaa HIF-1α vakautus- ja jäljittelee vastetta hypoksia [13]. Kuten esitetty hypertonic stimulaatiota, CoCl

2 indusoi PGE

2 sukupolvi oli riippuvainen COX-2. PGE

2 sukupolvi oli myös rinnastettiin VEGF tuotantoa. Induktion VEGF-tuotannon CoCl

2 on esitetty, ennen kuin ihmisen fibroblasteissa [38], keuhkosyövän solulinjassa [39], verkkokalvon epiteelin [40], glioomasolulinjoja [41], eturauhassyövän solulinjoissa [42] ja astrosyyttien [43], mutta ei yritetty tutkia mahdollisuuksia tuotannon PGE

2 tai sen autokriininen vaikutuksia. COX-2 esti VEGF tuotantoa aiheuttama CoCl

2, mikä osoittaa stimuloiva rooli PGE

2 ja että autokriinisen vaikutus PGE

2 riippuu tyypistä ärsykkeiden käytetty.

Hypertoninen keskipitkän indusoi aktivoinnin useita MAP-kinaasien, jotka voivat olla mukana säätelyssä VEGF ilmaisun [24]. Koska nämä MAP-kinaasien ovat mukana myös stimuloivan CPLA

2-α aktiivisuus ja PGE

2, poistaisimme estävää vaikutusta PGE

2, ennen kuin yrität analysoida rooli VEGF tuotantoa. Caco-2-solut aktivoitiin hypertonisten väliaineessa NS-398 osoittavat selvästi voimakas riippuvuus p38 ja vähemmän niin edelleen ERK 1/2 tuottavan VEGF: ää. CoCl

2 aiheuttama VEGF tuotantoa Caco-2-solut osoittivat samanlaisia ​​herkkyyttä profiilin MAP estäjät lukuun ottamatta merkittävä vähennys JNK estäjä. Erillinen roolit JNK-reitin mukaan erot hypertonic keskipitkällä ja CoCl

2 aiheuttama tuotannon VEGF ylitetä herkkyys autokriinisiä estäviä vaikutuksia PGE

2. Se on parhaillaan tutkittavana, jos tällaista signalointia erot voivat olla vastuussa eri syystä PGE

2 kutakin ärsykkeitä.

Yksi tunnusmerkeistä nykyisen mallin angiogeneesin säätelyyn kasvaimen massa, erityisesti paksusuolen syövän, on säätelyyn endoteelisolujen toimintoa syöpäsoluja. Niinpä rooli PGE

2 angiogeneesissä on rajoitettu autokriini stimulaation pro-angiogeenisten tekijöiden tuotantoa kasvainsolu. Vaikka mielenkiintoista, tämä malli ei käsittää mahdollisten ulkoisten ärsykkeiden mukana COX-2: n ilmentymisen ja VEGF: n tuotantoa tai tilanteissa, joissa solu, joka ilmentää COX-2 ja tuottavat PGE

2 on muu kuin syöpäsolun. Esimerkiksi, ektooppinen kasvu HCT116 ja HT29-solut, jotka eivät ilmennä COX-2 tai tuottavat PGE

2, on riippuvainen COX-2: n ilmentymisen endoteeli- ja stroomasolujen [44]. COX-2: n ilmentymisen hiirimalleissa familiaalinen adenomatoottisen polypoosin,

Min

[33], [44] ja APC

Δ716 [45] hiirillä, on rajoitettu strooman ja interstitiaalinen soluja. Erot JNK riippuvuutta ja autokriininen PGE

2 estävä vaikutus VEGF tuotantoa samalla koolonisyöpäsolulinja ovat selkeä osoitus siitä, miten malli on myös otettava huomioon, että nämä solut altistuvat eri microenvironmental ärsykkeisiin.

Kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää tohtori Karen A. Bell hänen kommentteja käsikirjoituksen.