Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä kuolinsyy maailmanlaajuisesti . Herkät, ei-invasiivisia diagnostisia näytön menetelmiä tarvitaan kiireellisesti parantaa selviytymismahdollisuuksia. Vakaa kiertävä microRNA tarjoaa ainutlaatuisia mahdollisuuksia varhaiseen toteamiseen useiden sairauksien, kuten syöpien. Tavoitteenamme on ollut löytää uusia plasma miRNA, joita voidaan käyttää biomarkkereina havaitsemiseksi CRC.

Menetelmät /Principal Havainnot

mukaan tulosten miRNA profilointi suoritetaan kokoamalla plasmanäytteistä muodostavat 10 CRC potilaiden tai 10 tervettä verrokkia, paneeli miRNA (HSA-miR-10a, -19a, -22 *, -24, -92a, 125a-5p, -141, -150, -188-3p, -192, -210, -221, -224 *, -376a, -425 *, -495, -572, -601, -720, -760 ja HSA-let-7a, -7e) vapautui CRC plasman kertaiseksi muutoksia Hyväksytty: 06 elokuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu avustuksia National Natural Science Foundation of China (Grant nro. 81000867 ja 81071791), tiede- ja TechnologyCommission Shanghai kunta (Grant nro 09JC1403700 ja 10XD1401300), ja Starting Mérieux tutkimusapurahoja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CRC tilit maailmanlaajuisesti 600 tuhatta kuolemaa vuosittain. Kiinassa CRC edelleen neljäs yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien mennessä [1], [2]. Kasvain vaiheessa diagnoosi on tärkein ennustetekijä CRC, joten varhainen havaitseminen ratkaisevan tärkeää vähentää kuolleisuutta ja parantaa vaatimustenmukaisuusasteisiin. Uusien biomarkkereiden varhaiseen toteamiseen tarvitaan kiireesti. Advanced adenoomia ovat yleensä määritelty adenoomia 1 cm tai suurempi, ja ne, joilla villous osat (tubulovillous tai villous) tai dysplasiaan [3], [4]. Advanced adenoomia selvästi yhdistää ketjussa, hyvänlaatuinen adenooma edistyneisiin CRC. Niinpä useimmat CRC seulonta strategioita keskittyä havaitsemismäärä sekä CRC ja kehittyneet adenoomia.

miRNA ovat pienet ei-koodaavat RNA: t (18-22 nt pitkiä), jotka säätelevät ilmentymistä kohde- geenien post transkription tasolla sitoutumalla kohde- mRNA-. Koska niiden löytö vuonna 1993, muuttuneessa ilmauksia miRNA on liittynyt monenlaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien CRC [5], [6]. Heidän yhdessä kasvaimen Genesis osoittaa niiden mahdollisuuksia diagnostisia markkereita ja terapeuttisia tavoitteita [7], [8].

Kiertävä miRNA stabiilisti havaittu plasmassa /seerumissa ja toimivat biomarkkereita useiden sairauksien [9], [10 ], [11], [12], [13], [14], mikä tekee niistä mahdollisesti käyttökelpoisia ei-invasiivisia markkereita varhaisdiagnosointiin tai seurantaan syövän etenemiseen. Olemme aikaisemmin havainneet, että kohonneet miR-29a ja miR-92a plasmassa on merkittävää diagnostista arvoa CRC [15]. Vahvistaa diagnostinen tehokkuus kiertävien miRNA, on välttämätöntä tunnistaa uusia tavoitteita. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että plasma miR-601 ja miR-760 pitoisuuksia voitaisiin edistää varhaisen havaitsemisen CRC mukaan sirun profiloinnin ja myöhemmin suuren mittakaavan validointi käyttäen qRT-PCR.

Materiaalit ja menetelmät

tutkimus Väestö

ryhmä 10 CRC (mukaan lukien 5 vaiheen II ja 5 vaiheen III potilasta) ja 10 normaalit kontrollit ensin valmisteltu miRNA profilointi (taulukko S1). Riippumaton 191 ikään ja sukupuoleen sovitettua henkilöitä rekrytoitiin suuren mittakaavan qRT-PCR validointi, mukaan lukien 90 CRC potilasta (vaihe I-IV), 43 kehittyneet adenooma potilasta ja 58 tervettä osallistujia (taulukko S2, S3). Parilliset kudosnäytteitä käyttää analyysiin valittujen miRNA ilmaisun toimittivat toisen 19 CRC potilasta (taulukko S4). Potilaat, joilla on aiemmin ollut pahanlaatuisia kasvaimia, perinnöllinen ei-polypoosin CRC tai familiaalinen adenomatoottisen polypoosin jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Verinäytteet kerättiin ennen käyttöä ja kudosnäytteet otettiin leikkauksen jälkeen. Kasvain oli lavastettu mukaan International Union syöpää vastaan ​​(UICC) ohjeet. Clinical Research eettisen komitean Fudanin yliopiston Cancer sairaalan hyväksyi tutkimussuunnitelmissa ja kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin osallistujille.

RNA: n eristäminen

Määrä on 5 10 ml kokoverta saatiin kultakin osallistujalta. Plasma saatiin sentrifugoimalla 1200 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Loppuun poistamalla jäljellä solukomponenttien, plasmanäytteet sentrifugoitiin uudelleen nopeudella 12000 g: ssa vielä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti plasma jäädytettiin erillisinä erinä -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tämä menettely toteutetaan 2 tunnin kuluttua laskimopunktion. Tilavuus 600 ui sulatettua plasmaa kuumennettiin 65 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 42 ° C: ssa 1 tunnin ajan proteiinin denaturoimiseksi. Kokonais-RNA uutettiin esilämmitys plasmaa käyttämällä Mirvana PARIS Kit (Ambion, USA), eluoimalla se 60 ui (95 ° C) RNaasi-vapaaseen veteen. Sitten plasma-RNA: t konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 20 ui käyttäen Eppendorf Concentrator Plus 5301 (Eppendorf, Saksa). Sillä normalisoituminen näytteen ja näytteen vaihtelun RNA: n eristys ja sisäisenä kontrollina, sama määrä (25 fmol) Synteettisten C. elegans miRNA-39 (cel-miR-39) lisättiin kuhunkin denaturoitua näytettä. Kokonais-RNA CRC kudosten uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA) mukaisesti tarjotaan protokollaa. Pitoisuus RNA-näytteet kvantifioitiin NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, USA).

miRNA Profilointi

miRNA profiloinnin tehtiin kanssa miRCURY LNA ™ Universal RT microRNA PCR -järjestelmää (Exiqon, Demark ) 2. yhdistetyt plasmanäytteet 10 CRC (mukaan lukien 5 vaiheen II ja 5 vaiheen III potilasta) ja 10 normaalia valvontaa. Menetelmä perustuu yleisen käänteistranskriptio (RT), minkä jälkeen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-monistuksella, jossa LNA ™ parannettu alukkeita käyttämällä SYBR Green. Pre-pieniin eriin LNA ™ PCR-alukkeet asetettu 384-kuoppaisen PCR levyjä kutakin reaktiota kohden hyvin [16]. Tilavuus 600 ui kutakin plasmanäytteistä oli poiminut ja sekoittuneet tasaisesti. Kokonais-RNA valmistettiin kuten edellä on kuvattu, ja määränä, joka on 500 ng käytettiin seuraavassa profilointiin. Kaikkiaan 742 tavoite miRNA havaittiin ja kertamuutoksia kunkin miRNA ilmaisun laskettiin.

kvantifiointi miRNA by qRT-PCR

Noin 30 ng rikastettua RNA käänteistranskriptio TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA) 10 ul: n reaktiotilavuudessa. RT tuotteita käytettiin templaatteina seuraavan PCR-prosessin jälkeen 1:10 laimennuksen. Ekspressiotasot miRNA kvantitoitiin kolmena kappaleena qRT-PCR: llä käyttäen ihmisen TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems, USA) ABI 7900 HT qRT-PCR väline (Applied Biosystems, USA). Molemmat nousi jyrkästi cel-miR-39 ja endogeenisen miR-16 käytettiin normalizers plasman miRNA kvantifiointiin, kun taas RNU6B varten kudosnäytteitä.

Mirna vakaus Plasma

Sama plasma näytteen jaettu useisiin eriin, saatettiin useita hoitoja, kuten inkuboimalla huoneenlämpötilassa eri aikoina (1, 2, 4, 8, 16, 24 h) tai saattamalla ne eri määrä pakastus /sulatus syklien säilytyslämpötila ( -80 ° C) huoneen lämpötilaan (22 ° C). Arvioida vakautta plasma miR-601 ja miR-760, Ct-arvoja havaitaan qRT-PCR heijastava pitoisuudet kokeessa näytteitä verrattiin joille Vakioprotokollien.

Tilastollinen analyysi

suhteellinen ilmentyminen miRNA analysoitiin 2

– △△ Ct menetelmällä. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin vertaamaan ilmentymisen plasman miRNA eri ryhmien välillä. Vastaanotin-toiminta-(ROC) käyriä ja ala ROC-käyrän (AUC) arvioitiin mahdollisuutta käyttää plasmaa miRNA diagnostisena välineenä CRC. Younden indeksi määritetty kynnys plasman miRNA pitoisuuksia. Korrelaatio viittaavia tekijöitä ja plasman miRNA tasot määritettiin U-testi, Studentin t-testi tai Χ2 testi. Kaikki testit olivat 2-puolinen ja merkittävyystasolla P 0,05 (95% CI) pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi tukeutunut SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Ltd., UK) ja kuvaajat muodostettiin kanssa Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, USA).

Tulokset

Mirna Profilointi

Kun jätetään useita miRNA tavoitteensa Ct-arvot 35 syöpänäytteissä niiden erittäin pieni ilmaisu, 86 miRNA oli ilmennetty eri välillä CRC ja ohjaus kertamuutoksia 2 (taulukko S5). Sekä miR-29a ja miR-92a sisällytettiin sääteli lista kuten olemme aiemmin raportoitu [15]. Joitakin muita vapautettu tavoitteita, kuten on-miR-95, -181b, -200c, -220 ja -221, raportoitiin aikaisemmin CRC [13], [17]. Raakadata on miRNA profilointia on siirretty GEO-tietokanta (GSE38716). Jotta rajata tutkimuskohteen paneeli 9 sääteli miRNA (HSA-miR-19a, -22 *, -24, -92a, -125a-5p, -210, -221, -376a ja hsa- let-7e) ja paneelin 13 alassäädetty miRNA (HSA-miR-10a, -141, -150, -188-3p, -192, -224 *, -425 *, -495, -572, -601 , -720, -760 ja HSA-let-7a) on valittu kertamuutoksia 5. Harkittaessa Meidän tavoitteena on löytää uusia plasman biomarkkereiden, 5 edellinen raportoitu tavoitteita (HSA-miR-92a, -141, -210, -221 ja HSA-let-7a) poistettiin [13], [17], [18], [19], [20], [21], [22], ja loput 17 miRNA valittiin edelleen laajamittaista qRT-PCR validointi.

Diagnostic arvo miR-601 ja miR-760 CRC

tunnistamiseksi 17 ilmentyvät eri plasma miRNA tunnistaa ilmentymisen profilointi, niiden tasot mitattiin qRT-PCR 90 CRC ja 58 normaalit kontrollit normalisoida piikki in cel-miR-39. Sekä miR-601 ja miR-760 oli merkittävästi vähentynyt CRC plasmassa kontrolleihin verrattuna (P 0,0001, kuva 1). ROC-käyrä analyysi osoitti niiden potentiaalista diagnostista arvoa ja AUC Mir-601 ja miR-760 oli 0,747 (95% CI: ,666-,828) ja 0,788 (95% CI: +0,714-+0,862), tässä järjestyksessä. Tällä kynnyksellä -11,50 Mir-601, optimaalinen herkkyys ja tarkkuus olivat 69,2% ja 72,4% vuonna erottamalla CRC normaalista valvontaa. Tällä kynnyksellä -8,09 Mir-760, herkkyys ja spesifisyys olivat 80,0% ja 72,4%, tässä järjestyksessä. Samanaikainen analyysi miR-601 ja miR-760 osoitti samanlaista AUC 0,792 (95% CI: 0,719-0,865), kuten miR-760, jossa on 83,3% herkkyys ja 69,1% spesifisyys, osoittaa huono additiivinen vaikutus 2 miRNA (kuvio 2). Olemme aiemmin tunnistettu, että plasman miR-29a ja miR-92a on merkittäviä diagnostista arvoa CRC [15]. Useimmissa tapauksissa, että tutkimuksessa oli sama kuin tässä asiakirjassa, nämä kaksi tavoitetta lisättiin yhdistettyihin ROC käyrä analyysi miR-760. Tuloksena AUC nousi 0,943 (95% CI: +0,908-,979), jossa 83,3% herkkyys ja 93,1% erityisyyttä erotteleva CRC ohjauspaneelista, mikä viittaa lisäaineen vaikutus diagnostinen arvo on 3 miRNA (Kuva S1, S2). Lisääminen miR-601 Näiden kolmen miRNA eivät parantaneet erilaistumista vallan välillä CRC potilaiden ja normaalit kontrollit ja johti samaan AUC 0,943 (95% CI: 0,907-0,978). Lisäksi ei havaittu merkittävää eroa välillä CRC potilaiden ja verrokkien jäljellä 15 miRNA (

P

0,05, tuloksia ei ole esitetty). Kun qRT-PCR data normalisoitiin miR-16 [15], plasma miR-601 ja miR-760 oli vielä merkittävästi säädellä vähentävästi CRC verrattuna normaaleilla verrokeilla (

P

= 0,002 varten asennuspalveli- 601 ja

P

0,0001 miR-760, kuva S3).

Laajamittainen validointi miR-601 ja miR-760 plasmanäytteissä (n = 191). Sirontakaavioissa of plasman miR-601 (A) ja miR-760 (B) terveillä koehenkilöillä (n = 58), kehittynyt adenoomia (n = 43) ja CRC potilailla (n = 90). Ekspressiotasot miRNA normalisoitiin ruuttaa-miR-39. Viiva edustaa mediaania. U-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä.

Diagnostic arvo miR-601 ja miR-760 Advanced adenoomia

jatkaa tutkimus diagnostinen arvo miR -601 ja miR-760 CRC kehittämiseen, mittasimme niiden plasma ilmaisun 43 kehittynyt adenoomia, jotka määriteltiin syövän esiasteita CRC. Plasmatasot miR-601 ja miR-760 vähenivät huomattavasti pitkälle adenoomia verrattuna normaaleilla verrokeilla (

P

= 0,018 niin miR-601 ja miR-760, kuva 1). Sekä 2 miRNA voisi heikosti erottamaan kehittynyt adenoomia normaaleista valvontaa, kuten on esitetty ROC käyrä analyysi; ja AUC oli 0,638 (95% CI: 0,530-0,747) Mir-601 ja 0,682 (95% CI: 0,576-0,789) Mir-760. Optimaalinen herkkyys ja spesifisyys miR-601 olivat 72,1% ja 51,7%, kun raja-arvo -10,73; nämä arvot miR-760 olivat 69,8% ja 62,1%, kun raja-arvo on -7,63. Yhdistetty analyysi miR-601 ja miR-760 ei parantamaan diagnostista tehokkuutta miR-760 ja osoitti samanlaista AUC 0,683 (95% CI: 0,576-0,789), jossa on 72,1% herkkyys ja 62,1% spesifisyys (kuva 2). Lisäksi ilmaus plasma miR-601 ja miR-760 kehittyneissä adenoomien lisääntyi merkitsevästi verrattuna CRC (

P

= 0,0174 Mir-601,

P

= 0,0214 Mir-760, Kuvio 1). Vakioituna miR-16, plasma miR-601 ja miR-760 pysyi alassäädetty kehittyneiden adenoomia verrattuna normaaleilla verrokeilla (

P

= 0,0198 Mir-601 ja

P

= 0,0184 mir-760, kuvio S3).

(A, B, C) miR-601, jolloin saatiin AUC 0,747 (95% CI: ,666-0,828) ja 69,2% herkkyys ja 72,4% spesifisyys (leikkaus- off-arvo = -11,50), ja miR-760 saatiin AUC 0,788 (95% CI: 0,714-0,862), jossa 80,0% herkkyys ja 72,4% spesifisyys (cut-off-arvo = -8,09) erotteleva CRC normaalista valvontaa. Yhdistetty analyysi miR-601 ja miR-760 paljasti AUC 0,792 (95% CI: ,719-,865), jossa on 83,3% herkkyys ja 69,1% tarkkuus. (D, E, F) MiR-601 tuotti AUC 0,638 (95% CI: 0,530-0,747), jossa 72,1% herkkyys ja 51,7% spesifisyys (cut-off-arvo = -10,73), ja miR-760 paljasti AUC 0,682 (95% CI: ,576-,789), jossa 69,8% herkkyys ja 62,1% spesifisyys (cut-off-arvo = -7,63) erotteleva kehittyneiden adenomas kontrolleihin. Yhdistetty analyysi miR-601 ja miR-760 ei parantanut diagnostista tehokkuutta, ja antoi samanlaisen AUC 0,683 (95% CI: 0,576-0,789), jossa 72,1% herkkyys ja 62,1% spesifisyys kuin miR-760.

yhteyksiä kliinisiin Ominaisuudet

osoittamiseksi vähentynyt suuntaus plasman miR-601 ja miR-760 ilmaisun CRC kehittämiseen, CRC tapausta edelleen ositettu niiden TNM lavastus. Potilaat jaettiin 5 ryhmään, mistä kehittynyt adenooma (vähiten kehittyneet leesio) vaiheeseen IV CRC (pisimmällä vaurio). Verrattuna normaaliin valvontaa, plasman miR-601 ja miR-760 vähenivät kaikissa 5 ryhmässä. Vielä tärkeämpää on, tämä oli sopusoinnussa alassäätöä trendi tasojen 2 miRNA on pienin vaiheessa IV potilaiden ja korkein vaiheessa I potilailla. Sekä plasman miR-601 ja miR-760 vähennettiin aikana etenemisen CRC normaalista kehittyneiden adenooma CRC (kuva 3). Ei ollut merkittävää yhteyttä näiden 2 miRNA ja sukupuoli, ikä, imusolmukestatuksesta, kasvaimen sijainti, kasvaimen koon tai histologian (

P

0,05, tuloksia ei ole esitetty).

Rasiakuvaajat of plasmatasot miR-601 (A) ja miR-760 (B) normaalihenkilöillä (n = 58), kehittynyt adenoomia (n = 43) ja CRC potilailla (n = 90) eri TNM (26 I, 25 kanssa II, 29 kanssa III ja 10 IV). Ekspressiotasot miRNA normalisoidaan ruuttaa-miR-39. Viivat sisällä laatikot merkitsevät medians. U-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä.

Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) on biomarkkereiden avulla seurataan CRC toistuminen ja ei ole kelvollinen diagnostinen biomarkkeri kliinisestä näkökulmasta sen pieni herkkyys ja spesifisyys. Kuitenkaan ole ihanteellinen potentiaali biomarkkereita CRC seulonnan tasalla ja CEA on edelleen toiminut alustavan kasvain indikaattori terveystarkastukseen. Arvioimaan mahdollisia komplementointiin plasma miRNA ja CEA varhaiseen havaitsemiseen CRC, CEA data verrattiin miR-601 ja miR-760 tasot 51 vaiheessa I ja vaiheessa II potilaille. Cut-off-arvot miR-601 ja miR-760 ROC käyräanalyysi olivat -11,50 ja -8,09, vastaavasti. Cut-off-arvo CEA oli 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). MiR-601 tai miR-760 tunnistettiin ylimääräisen 26 tai 29 tapauksessa jäänyt CEA yksin, osoittaa suurempaa voimaa erottaa alkuvaiheessa CRC. Yhdistetty käyttö miR-601 ja miR-760 voisi havaita 30 CEA-jäi tapauksia kaikissa. ROC-käyrä analyysi osoitti, että yhdistäminen miR-601 ja miR-760 voisi parantaa diagnostisen herkkyyden CEA 29,4%: sta 80,4%: n AUC 0,805 (95% CI: ,457-,683) (kuva S4).

miR-601 ja miR-760 Expression CRC kudokset

varten kaivaa esiin sisäisen suhdetta miRNA ilmaisun välillä plasman ja vastaavien kasvain kudosnäytteitä, miR-601 ja miR-760 mitattiin kasvaimen kudokset toisesta 19 CRC tapauksissa. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu sekä 2 miRNA syövän ja noncancerous kudoksissa (

P

= 0,32 Mir-601 ja

P

= 0,43 miR-760, kuva 4). Vapautuminen miRNA kasvaimen solut verenkiertoon vaikuttavat useat parametrit voivat selittää ristiriitaa. Lisäksi ei tiedetä, onko tuumorisolujen voisi muuttaa miRNA vapauttavan vereen muiden elinten tai solujen. Suuremmat näytteet validointi tarvittiin vahvistamaan miR-601 ja miR-760 ilmentymisen CRC kudoksissa.

Ei merkittäviä eroja siitä miR-601 (A) ja miR-760 (B) pitoisuudet olivat välillä CRC kudosten ja pariksi ei-syöpä kudoksiin (NCT) (n = 19). Ekspressiotasot miRNA normalisoitiin RNU6B. Viiva edustaa mediaania. U-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä.

MiR-601 ja miR-760 vakaus Plasma

plasmatasot miR-601 ja miR-760 havaittiin oltava vakaa, kun on altistettu pitkittynyt inkubointi huoneenlämpötilassa, ja Ct-arvoja ei osoittanut merkittäviä vaihteluita. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin seuraavan jäädytys-sulatus-syklien kokeessa (kuva 5). Siksi pidimme että ne olivat melko stabiileja plasmanäytteistä ja tuskin huonontuneen aikana protokolla ja tallennusasetukset. Näiden tulosten perusteella, olemme tulleet siihen tulokseen, että miR-601 ja miR-760 periaatteessa täyttänyt kliiniseen käyttöön.

plasmatasot miR-601 ja miR-760 olivat vakaat pitkittyneen huoneenlämmössä inkuboinnin 1-24 tuntia (A) tai vähintään 4 jäädytys-sulatus-jaksolla (B).

keskustelu

miRNA tärkeä rooli syövän synnyssä. Vapauttaminen miRNA ilmaisun esiintyy erilaisissa syövissä, erityisesti miR-143 ja miR-145 CRC [23]. MiRNA voi edistää hoitostrategioita diagnostisina biomarkkereita ja ennustettaessa syövissä [5], [6]. Kuitenkin koepala-pohjainen ilmaisu- menetelmät ovat edelleen invasiivisia ja aikaavievä seulontaan ja seurantaan syöpäpotilailla. Kasvain- miRNA ensin kuvanneet Mitchell et ai. osoittavat selvästi, että vakaa miRNA ovat läsnä ihmisen plasmassa ja seerumissa, mikä avaa erittäin laajan kentän kliiniseen käyttöön [9], [24], [25], [26], [27].

Julkaistu raportit kiertävän miRNA CRC ovat rajalliset. Kuitenkin, Ng et ai. havaitsi, että miR-17-3p ja miR-92 oli merkittävästi kohonnut seerumin CRC potilaalla on merkittävä vähentäminen leikkauksen jälkeen. Lisävalidointia riippumaton joukko 180 näytteiden osoitti, että miR-92 plasmassa voi erottaa peräsuolen ja syöpien, tulehduksellinen suolistosairaus tai normaalihenkilöihin [13]. Ja me aiemmin raportoitu, että plasman miR-29a ja miR-92a olivat merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC potilailla, joilla on hyvä diagnostisten arvot CRC seulonnan [15].

MiR-601 ja miR-760 oli 2 miRNA vähemmän huolenaihe syöpäsairauksia. MiR-601, joka sijaitsee

DENND1A

geeni säädellään ylöspäin kohdun kohdunkaulan syövän, voivat vaikuttaa tumatekijä-kappa B signaalireaktioteissä ihmisen keuhkosyövän soluja A549 [28], [29]. MiR-760, joka sijaitsee introni-1

BCAR3

geeni, säätelee estrogeenien ja on pienempi ilmentyminen CRC kudoksissa [30]. Ei muita toiminnallisia tutkimuksia ovat sittemmin parhaillaan suoritetaan 2 miRNA. Tiedot niiden suhteita syövän synnyn on vähäistä, mutta meidän romaani havainnot viittaavat siihen, että plasman miR-601 ja miR-760 voi toimia sopiva varhaisdiagnostiikan merkkiaineita CRC.

Tässä tutkimuksessa olemme ensin löydetty miR-601 ja miR-760 oli säädellä vähentävästi CRC plasmassa miRNA profiloinnin ja validoitu ne qRT-PCR: llä yhteensä 17 valittujen miRNA. Olemme osoittaneet, että plasman miR-601 ja miR-760 määrä väheni edennyttä paksu- tai peräsuolen kasvain verrattuna terveisiin verrokkeihin, ja että miR-760 oli merkittävämpi kuin miR-601 CRC biomarkkereiden. Kokemuksemme mukaan ja aiemmat tutkimukset, 11% vastaavuutta välillä sirun seulonnan ja validointi oli alhainen mutta hyväksyttävää. ROC-käyrä analyysi osoitti heikkoa ilmentymistä näistä 2 miRNA voisi edistää varhaista havaitsemista CRC 69,2% herkkyys ja 72,4% spesifisyys miR-601 (AUC = 0,747) ja 80,0% herkkyys ja 72,4% spesifisyys miR-760 (AUC = 0,788). Näiden biomarkkereita täydentää CEA havaitsemisessa alkuvaiheen CRC (vaiheet I ja II) sai AUC 0,805 kanssa 80,4% herkkyys ja 65,5% tarkkuus. Lisäksi yhdistetty miR-601 ja miR-760 voi myös syrjiä kehittyneitä adenoomia peräisin terveiden verrokkien antaa AUC 0,683 kanssa 72,1% herkkyys ja 62,1% tarkkuus. Enemmän huomattavasti, tasot molempien miR-601 ja miR-760 kaatui vaiheittain I ja II CRC, joka voimakkaasti kohonnut niiden mahdollinen arvo varhaiseen havaitsemiseen CRC. Vaikka diagnostinen arvo miR-601 ja miR-760 voi ovat kaukana optimaalinen, paneeli kolme plasma miRNA (miR-760, -29a ja -92a) merkkiaineiden paljasti hyvä diagnostinen tehokkuus.

Ei yksimielisyyttä sisäinen valvonta, jotka ovat ratkaisevan tärkeitä tarkkaa määrällistä RNA tasoilla qRT-PCR on perustettu tähän mennessä. Tulokset vahvistivat, että lineaarinen korrelaatio välillä oli määrä syötetyn synteettistä miRNA ja Ct arvot qRT-PCR [31]. Tässä tutkimuksessa, cel-miR-39 lisättiin kuhunkin denaturoitu näytteen aikana RNA: n eristämistä menettelyt normalisointi [32]. Lisäksi olemme myös käytetty miR-16, ehdotettu sisäisen valvonnan meidän aikaisemman työn, normalisoida meidän qRT-PCR tiedot ja saadut samanlaisia ​​tuloksia (kuva S3) [15]. On kuitenkin osoittautunut, että voimme saada paremman AUC normalisoida kanssa cel-miR-39, joten cel-miR-39 valittiin normalisoida qRT-PCR tiedot tässä tutkimuksessa (kuva S5).

Plasma näytteet voidaan kerätä ei-invasiivisesti ja eivät ole aikarajoja. Olemme todenneet, että kiertävä miRNA uutettu minimaalinen plasmanäytteessä olivat hyvin kvantifiointiin tarkoituksiin. Verrattuna muihin nukleotidin sisältäviä molekyylejä, kuten DNA: n ja mRNA: n, miRNA ovat vastustuskykyisempiä DNaasia ja RNaasi-aktiivisuus, mikä tekee niistä suhteellisen vakaa verenkierrossa. Olemme osoittaneet, että miR-601 ja miR-760 olivat melko stabiileja plasmanäytteistä ja tehtiin pieni hajoamista pitkittyneen huoneenlämmössä inkuboinnin tai useita jäädytys-sulatus syklien.

Yksi rajoitus Tämän tutkimuksen on ollut, että molekyyli oivalluksia syy vapautumisen ei ole saatu. Circulation miRNA tasot vaikuttavat kuvastavan kudosekspressiotutkimuksen joka on osoitettu useissa syövän tyypit mukaan lukien eturauhassyöpä ja rintasyöpä [9], [24]. Vaikka miR-601 ja miR-760-tasot eivät vähentyneet CRC kudoksissa, mikä näytti ei muodostu kanssa plasmassa. Toinen rajoitus tämän tutkimuksen on se, että samanlainen, mutta ei täydentäviä, diagnostiset arvot havaittiin näiden kahden miRNA. Lisääminen miR-601 ei parantanut ero voimaa miR-760 erotteleva kehittynyt peräsuolen kasvainten normaalista valvontaa. Sen toteaminen plasma miR-601 ja miR-760 biomarkkereina pitäisi nyt tarkemmin havaita CRC sen varhaisessa vaiheessa. Vielä enemmän, lisäämällä miR-760 muille kaksi miRNA tunnistettu aiemmin meille paljasti huomattavan parantunut diagnostinen arvo, mikä viittaa siihen, että paneeli plasma miRNA merkit voidaan parantaa herkkyyttä ja spesifisyyttä Tämän määrityksen CRC seulontaan.

Lopuksi plasma miR-601 ja miR-760 tasot CRC ja kehittynyt adenoomia ovat merkittävästi vähentynyt, mikä viittaa siihen mahdollisuuteen, että plasman miR-601 ja miR-760 ovat uusia biomarkkereita klinikan diagnoosi CRC, mutta mekanismit niiden väheneminen edellyttävät lisätutkimuksia.

tukeminen Information

Kuva S1.

Plasma miR-29a ja miR-92a ilme. Plasma miR-29a (A) ja miR-92a (B) oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC verrattuna normaaleilla verrokeilla (

P

0,0001,

P

= 0,0005). Adenoomien samanaikaisesti erottaa normaalit kontrollit (

P

= 0,0015,

P

= 0,0003). Viiva edustaa mediaania. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin sen määrittämiseksi, tilastollisen merkittävyyden.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s001

(TIF)

Kuva S2.

Yhdistetty ROC käyrä analyysi miR-29a, miR-92a ja miR-760. Yhdistetty ROC käyrä analyysi 3 miRNA (miR-29a, miR-92a ja miR-760) tuotti AUC 0,943 (95% CI: 0,908-0,979), jossa 83,3% herkkyys ja 93,1% erityisyyttä erotteleva CRC normaalista valvontaa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s002

(JPG) B Kuva S3.

Plasma miR-601 ja miR-760 ilmentymisen normalisoidaan miR-16. Sekä cel-miR-39 ja miR-16 voitaisiin käyttää normalisointia. MiR-601 ja miR-760 oli edelleen merkittävästi alas säännelty CRC ja kehittyneiden adenoomia verrattuna normaaleilla verrokeilla, kun qRT-PCR data normalisoitiin miR-16. Viiva edustaa mediaania. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin sen määrittämiseksi, tilastollisen merkittävyyden.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s003

(TIF)

Kuva S4.

Diagnostic herkkyydet miR-601 ja miR-760 verrattuna CEA vaiheen I ja II CRC. Cut-off-arvot miR-601 ja miR-760 ROC käyräanalyysi olivat -11,50 ja -8,09, vastaavasti. Cut-off-arvo CEA oli 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). (A, B) Kahden parametri luokituksia osoitti, että 26 ja 29 tapauksessa (vaihe I ja II) hukata CEA oli täydentäviä havaita miR-601 ja miR-760, vastaavasti. (C) MiR-601 ja miR-760 oli voimakkaampi kuin CEA erottamaan vaiheen I ja II CRC peräisin terveiden verrokkien ja yhdistettyä käyttöä miR-601 ja miR-760 voisi havaita 30 CEA-jäi tapauksia kaikissa. (D) Yhdistetty käyttö 3 merkkiaineiden tuotti AUC 0,805 (95% CI: +0,457-,683) kohonnut herkkyys 86,3%.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s004

(TIF )

Kuva S5.

ROC käyrä analyysi plasman miR-601 ja miR-760 normalisoida ruuttaa-miR-39 tai miR-16. (A, B, C) Normalisoitu ruuttaa-miR-39, plasma miR-601 saatiin AUC 0,713 (95% CI: 0,634-0,792), jossa 72,4% herkkyys ja 62,4% spesifisyys (cut-off-arvo = -11,50) ja miR-760 saatiin AUC 0,754 (95% CI: 0,682-0,826), jossa 72,4% herkkyys ja 72,2% spesifisyys (cut-off-arvo = -8,08) erotteleva kehittyneiden peräsuolen neoplasia (CRC ja kehittyneet adenoomia) normaalista valvontaa . Yhdistetty analyysi miR-601 ja miR-760 paljasti AUC 0,824 (95% CI: +0,680-0824), jossa on 74,4% herkkyys ja 70,0% tarkkuus. (D, E, F) Normalisoitu miR-16, plasma miR-601 tuotti AUC 0,668 (95% CI: 0,588-0,748), jossa 74,1% herkkyys ja 53,4% spesifisyys (cut-off-arvo = -7,63), ja miR-760 paljasti AUC 0,724 (95% CI: ,651-+0,798), jossa 87,9% herkkyys ja 48,9% spesifisyys (cut-off-arvo = -4,81) erotteleva kehittyneiden peräsuolen kasvainten normaalista valvontaa. Yhdistetty analyysi miR-601 ja miR-760 paljasti AUC 0,732 (95% CI: ,661-0,803), jossa on 43,6% herkkyys ja 94,8% tarkkuus.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s005

(JPG) B Taulukko S1.

Potilaan tiedot miRNA profilointia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s006

(DOCX) B Taulukko S2.

Potilastiedot suuren mittakaavan validointi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s007

(DOC) B Taulukko S3.

patologiset ominaisuudet kehittyneitä adenoomia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s008

(DOCX) B Taulukko S4.

Potilastiedot validointi pariksi CRC kudoksiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s009

(DOCX) B Taulukko S5.

miRNA vapautettiin CRC plasman FC 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s010

(DOCX) B