Krooninen sairaus

tiivistelmä

Altistuminen genotoksisia aineita, kuten säteilytys aiheuttaa DNA-vaurioita, myrkyllisyydestä, joka on täydennetty, kun DNA korjaus on heikentynyt. Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) estäjät havaittiin olevan ”

synteettinen tappava

” soluissa puutteellinen BRCA1 ja BRCA2 jotka heikentävät homologinen rekombinaatio. Koska monet kasvaimet, kuten eturauhassyöpä (PCA) on harvoin tällaisia ​​mutaatioita, on huomattavaa kiinnostusta löytää vaihtoehtoisia tekijöitä PARP estäjän herkkyys. Olemme arvioineet tehokkuutta säteilyn yhdessä PARP-inhibiittorin, rucaparib PCA-soluissa. Yhdistelmä indeksi klonogeeniset selviytymisen sädehoidon ja rucaparib hoitoja paljastui synergistiset vaikutukset paneelissa Eturauhassyövän solulinjojen ollessa voimakkainta LNCaP ja VCAP solut, jotka ilmentävät ETS geeniä fuusioproteiineja. Nämä havainnot korreloivat synergistisiä vuorovaikutuksia varten vanhenemista aktivointia, osoitettuna β – galaktosidaasi värjäystä. Absence of PTEN ja läsnäolo ETS geenin fuusio siten helpottanut aktivointia Vanheneminen, mikä osaltaan laski klonogeeniset selviytymistä. Lisääntynyt radioherkkyyttä läsnäollessa rucaparib liittyi pysyviä DNA taukoja, määritettynä χ-H2AX, p53BP1, ja Rad51 pesäkkeitä. VCAP soluja, jotka satama

TMPRSS2-ERG

geenin fuusio ja PC3-solut, jotka ilmentävät stabiilisti samanlainen konstruktio (fuusio III) osoitti parannettu herkkyyttä rucaparib, mikä puolestaan ​​lisäsi säteilyn vastaus samassa määrin kuin DNA-PKcs: n estäjä NU7441. Rucaparib radiosensitized PCa soluja, joilla on selkeä etu matalan annosnopeuden säteily (LDR) annettuna pidemmän ajanjakson ajan, joka aiheutti parannetun DNA-vaurioita. LDR jäljitteleviä brakyhoito, jota käytetään menestyksekkäästi klinikalla, oli tehokkainta, kun se yhdistetään rucaparib indusoimalla pysyviä DNA-vaurioita ja vanhenemista, mikä laski klonogeeniset selviytymistä. Tämä yhdistelmä oli tehokkain läsnäollessa

TMPRSS2-ERG

ja puuttuessa

PTEN

, mikä osoittaa kliininen potentiaalia tyköhoidon potilailla, joilla on keskitason ja korkean riskin PCa.

Citation: Chatterjee P, Choudhary GS, Sharma A, Singh K, Heston WD, Ciezki J, et al. (2013) PARP esto herkistää Low Dose-Rate Säteily TMPRSS2-ERG Fusion Gene-ilmaiseminen ja PTEN-puutteellinen syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (4): e60408. doi: 10,1371 /journal.pone.0060408

Toimittaja: Philip J. Tofilon, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 lokakuu 2012; Hyväksytty: 26 helmikuu 2013; Julkaistu: 02 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli ensisijaisesti tukevat Pfizer RDG, lisätukea National Cancer Institute (CA127264 AA) ja United States Department of Defense Post doc Training Award (PC094405 KS). Se oli myös tukee osittain National Insitutes of Health apurahan P30 CA43703 käytöstä Säteilyturvakeskuksen Resources Core Facility, Case Western Reserve University ja CASE Kattava Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä työ oli ensisijaisesti tuettu Pfizer RDG. Kantaliuoksia rucaparib toimitti Pfizer. Kirjoittajat ”kollegansa Clovis Oncology tarjotaan ehdotuksia ja ohjausta. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on kaikkein diagnosoidaan usein kasvain miehillä osuus yksinään 29% tapahtuman tapauksista [1]. Se on toiseksi yleisin kuolinsyy johtuu syöpä miehillä jälkeen keuhkosyöpään. Säteilytys on tärkeä hoitomuoto PCA, joiden kliininen vaste saavutettiin on -85%. Sitä käytetään lähinnä alkuvaiheen tauti, adjuvanttina leikkauksen, ja yhdistettynä kemoterapia-terapeuttisia, jotka mahdollistavat sen käytön pienemmillä annoksilla, Tehokkaita ja vähemmän sytotoksisen vaikutuksen viereiseen normaaleissa kudoksissa.

Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) edustaa perheen proteiineja, jotka ilmentyvät runsaasti, pääasiassa tumassa, ja ovat mukana monissa tärkeissä solun prosesseja, kuten vasteena DNA-vauriolle, sen korjaus, ja kun vahinko on vakava, solukuolemaa apoptoosin kautta tai kuolion [2]. PARP-1 ja -2 tiedetään olevan rooli DNA: n eri korjausmekanismit, kuten pohja Leikkauskorjauksessa, homologinen rekombinaatio (HR) [3], ja homologisella end-liittymällä (NHEJ) [4]. Havaittuaan DNA-vaurioita, joiden avulla sen DNA: ta sitovan domeenin, aktivoitu PARP-1 laukaisee poly-ADP ribosylaatio- histonien ja PARP-1 itse. Tärkeää on, PARP-1 takaa sääntelyn DNA replikaatiohaarukka eteneminen HR vaurioitunut DNA [5]. PARP-1 osallistuu pääasiassa korjaus yksijuosteisia katkoksia, jotka, jos korjaamatta muunnetaan kaksijuosteinen tauot (DSB: t) aikana DNA: n replikaatiota. PARP-inhibiittorit (PARPi) ovat uusi luokka aineita, jotka estävät synteesi Poly-ADP riboosin mukaan, joka törmää alavirtaan DNA korjaus prosesseja, ja sen seurauksena DNA-vaurio ei poistu [2]. PARPi siksi voi toimia ainoana lääkkeenä HR-puutosta kasvaimet (esim. BRCA1 /2-viallinen) kautta ”

synteettinen kuolleisuutta

” [6]. Poistaminen NHEJ HR-vajaiden solujen kautta DNA- PKcs esto voi kääntää päinvastaiseksi PARPi-välitteisen kuolleisuutta [7]. Säteily aiheuttaa PARP-aktiivisuutta ja sen estäminen parantaa solukuolemaa ja parantaa kasvaimen kasvu viivästyy säteilytetty keuhkosyövän mallit [8]. Tasot PARP-1 kasvoi myös kehittyneet, castrate kestävä PCa [9], [10], tämän vuoksi sen käyttö yhdessä säteilyn parantaa sädehoidon on houkutteleva.

”

synteettinen kuolleisuutta

”käsite on ollut tehokas nisäkässoluissa kasvainmalleissa viallisia BRCA1 tai BRCA2, joka näin ollen on viallinen HR [3] ja ovat sopivat näin ollen käyttöön PARPi monoterapiana [11]. Kuitenkin kasvaimia jos mutaatiot ovat harvinaisia, kuten PCA on kiireellinen tarve tunnistaa uusia DNA-vaurioita ja korjaus vikoja, jotka voivat tarjota ”

synteettinen tappava

” yhdessä PARPi. Siten käytön laajentamista PARPi ulkopuolella kasvainten viallinen BRCA1 /2 on erittäin kiinnostava.

Loppuvaiheen PCA bi-alleelinen poisto

PTEN

(Phosphatase ja tensin homologi) geeni on tavallista, että on ehdotettu vaikuttavan HR DNA korjaukseen. PTEN antagonisoi PI3K /AKT selviytymisreittiin sen fosfolipidi 3-fosfataasiaktiivisuus, joka puolestaan ​​säätelee proliferaatiota, migraatiota, ja apoptoosin. Täydellinen menetys

PTEN

stimuloi myös voimakkaasti vanhenemista vasteen, joka toimii ylimääräisenä mekanismi tuumorisuppressiogeeneksi. Vanheneminen on ehdotettu toimia kasvaimen vastaisen mekanismin vasteena DNA-vauriolle indusoimalla peruuttamaton kasvun pysähtymisen ja rajoittamalla replikatiivisen solujen elinikää [12]. Samanlainen BRCA1 /2-viallinen kasvainsoluja,

PTEN

-null PCa solujen on raportoitu olevan herkkiä PARPi.

Tässä tutkimuksessa selvitimme vastaus voimakas PARP-inhibiittori, rucaparib yksin tai yhdessä säteilyn paneelissa Eturauhassyövän solulinjoissa. Tuloksemme tukevat tehokkuutta rucaparib tehokkaana PARPi varten sädeherkistävä PCa soluja, tehokkaimmin kun niitä käytetään vähän annoksesta hinnat soluissa että satama

TMPRSS2-ERG

geeni fuusio tai ovat

PTEN

vajausta.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinjat PC3, LNCaP, DU145, ja VCAP saatiin ATCC (Manassas, VA); C4-2 on kuvattu aiemmin [13]. Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, paitsi DU145 (DMEM) ja Vcap (modifioitu DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals), L-glutamiinia (Invitrogen), ja 100 yksikköä /ml penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Kantaliuoksia rucaparib edellyttäen, Pfizer, tehtiin DMSO: hon (Sigma Aldrich).

transfektion jälkeen solut siirrostettiin -80% konfluenssiin antibioottia elatusaineessa.

TMPRSS2-ERG

fuusio III (yleisin) isoformi [14] jalomielinen lahjoitus Dr. Michael Ittmann transfektoitiin lipofektamiinia 2000, jota seurasi valinta käyttäen neomysiiniresistenssin 1 mg /ml G418: aa (Invitrogen). Transfektion tehokkuus varmistettiin Western-blottauksella (kuvio. S1A).

Säteily hoito

Ionisoiva säteily annettiin käyttämällä tavanomaista cesium-137 χ-säteilytysuunin (JL Shepherd Associates, San Fernando, CA), annoksella nopeudella 146 cGy /min [15]. Annosnopeuden kokeet suoritettiin muuttamalla asentoa levyjen tai käyttämällä vaimenninta. IR-192 säteilylähteen, joka lähettää β-hiukkasia, palveluksessa tilaustyönä valmistettu solu säteilyttäjällä, jossa laitteen suunnittelu kuvatun [16].

Analyysit Colony Formation ja Vanheneminen

pesäkemuodostusta, 500 solua /60 mm: n astia (tai 750 solua /60 mm lautasen LNCaP) levytettiin päivää ennen käsittelyä. Rucaparib annettiin osoitettuina annoksina jatkuvasti. Kahden viikon kuluttua hoidon säteilyä tai /ja rucaparib, solut värjättiin 0,1% kristalliviolettia, ja solujen pesäkkeitä 50 solut tekee alfa kuva-analysaattorilla (Alpha Innotech Corp). Vanheneminen Määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [17]. Sen jälkeen kun kuusi tai kaksitoista päivää, solut kiinnitettiin ja prosenttiosuus β-galaktosidaasi-positiivisten solujen määritettiin laskemalla ≥five eri alojen (-70 solua /näyte).

Immunofluoresenssikoe

Soluja pinnoitettu coverslip 35 mm kulttuurin ruokia. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin 2,0% paraformaldehydillä 20 min ajan huoneenlämpötilassa, pestiin 3 x 5 min fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssa 10 min, ja blokattiin 3 % FBS PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Triton X-100: ssa 1 tunti. Peitinlasit Sitten immunovärjättiin käyttämällä vasta-aineita χ-H2AX (Millipore), 53BP1 (Abcam), tai Rad51 (Santa Cruz Biotechnology), jota seurasi fluoresoivasti konjugoidun (Invitrogen) sekundäärinen vasta-aine, kuten on kuvattu [17]. Kvantifiointi perustui tietoihin havaittiin ≥70 soluista.

TILASTOANALYYSI

synergiaa analyysiä, soluja käsiteltiin rucaparib ja säteilytys, yksin tai yhdistelminä suhteessa verran suhde niiden mediaani -vaikutuksen annoksia, jokaisen annoksen kussakin kokeessa päällystetty kolmena kappaleena ja kussakin kokeessa suoritettiin kolme kertaa. Vuorovaikutusta kahden hoidon klonogeenisten solujen eloonjääminen ja vanhenemista määritykset sitten määritetään perustuen isobolographic menetelmä Chou ja Talalay, kuten aiemmin on kuvattu [18], [19]. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista ANOVA ja tilastollisen merkittävyyden osoitettu p 0,05.

Western Blot analyysit

Solut hajotettiin ja niille immunoblottauksella, kuten on kuvattu [17], [ ,,,0],20] ja koetettiin vasta-aineita V5 tunniste (Thermo Scientific), havaitsemiseksi

TMPRSS2-ERG

fuusio III geeniä ja β-aktiini (Sigma Aldrich) latauskontrollina.

tulokset

Tehostettu herkkyys Eturauhassyövän Cell Lines säteily kun Yhdistettynä Rucaparib

Ionisoiva säteily ja DNA: ta vaurioittavien aineiden merkittävästi indusoi PARP-1 ja tasot PARP ovat korkeampia kasvaimissa [9], [10 ], näin ollen, PARPi voidaan käyttää herkistämään DNA-vahingoittamatta kemo- tai radio-hoitoa. Kliininen onnistuminen PARPi on kohortin potilaista [21], joka sisälsi jonkin verran PCA kysytään kiinnostusta tutkia mahdollisuutta käyttää rucaparib (CO-338; aiemmalta nimeltään AG014699 ja PF-01367338) kuin säteilyherkiste. Rucaparib, ensimmäinen PARPi, joka on kehitetty [22], [23], ja se on tällä hetkellä testattu kliinisissä kokeissa ei ole –previously käytetty PCa soluja. Tutkimalla sen pitkäaikainen vaikutus solujen eloonjäämiseen osoitti annos-vaste säteilyn ja rucaparib eri PCa soluja (Fig. 1A). Vcap ja LNCaP (rucaparib pitoisuus: 0,25, 0,5, ja 0,75 uM) osoitti suurimman herkkyyden kohti rucaparib, jonka jälkeen PC3 ja C4-2-soluja. Yhdessä 1,5 Gy χ-säteilytys, LNCaP, osoitti suurinta herkkyyttä niin alhaiseksi kuin 0,75 uM rucaparib (Fig. 1 B). Synergy laskelmat isobologram- analyysi (katso materiaalit ja menetelmät) suoritettiin neljälle säteilyannoksia, jotka vaihtelevat 1-5 Gy yhdistettynä rucaparib (konsentraatioalue 0,6-3,12 uM). Saat PC3, jonka pitoisuus on rucaparib niin alhainen kuin 1,25 uM havaittiin merkittävä lasku pesäkkeen numero voimakas säteilylle herkäksi vaikutus. DU145 solut olivat vähiten herkkiä säteilylle ja rucaparib, yksin ja yhdessä, joilla on rajoitettu vaikutus saadaan vain suurimmalla annoksilla. VCAP soluja, mutta samalla ne oli samanlainen vaste säteilylle DU145, että yhdessä rucaparib osoitti synergistisen vuorovaikutuksen (Fig. 1 B ja kuviossa. S2A). Yhdistelmä-indeksi paljasti vahvin synergiaa (CI 0,2) LNCaP-soluissa säteilyn ja rucaparib yhdistelmä, jossa annoksia säteilyä niinkin alhainen kuin 0,5 Gy ja 0,25 uM rucaparib ole tehokkaita. PC3-solut osoittivat kohtalaista synergiaa (CI = 0,7) Seuraavat 4 Gy säteilyä ja 2,5 uM rucaparib, kun taas C4-2 solut osoittivat additiivinen vaikutus (CI = 0,9) (Fig. 1 B ja kuviossa. S2).

A, säteily ja rucaparib annosvaste PC3, C4-2, DU145, VCAP ja LNCaP perustettiin klonogeeniset solujen selviytymistä määrityksissä. Vasemmanpuoleiset paneelit osoittavat vastetta säteilylle, ne oikeudesta rucaparib. B, synergistinen vaikutus yhdistelmän säteilyn ja rucaparib siitä klonogeeniset eloonjäämiseen LNCaP, PC3, C4-2, ja VCAP solut, joissa CI 1 edustaa synergiaa ja CI 1 antagonistinen vuorovaikutus kaksi hoitoja. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

Rucaparib ja säteily Pakotettava Vanheneminen PTEN-puutteellinen ja TMPRSS2-ERG Fusion ilmentävien solujen

Vanheneminen tiedetään edustavan tärkeä vastaus sekä säteilyn ja PARPi että vaikutukset soluproliferaatioon ja lopulta klonogeeniset selviytymistä. Käsitellyt solut osoittivat ominaisuus merkkiaineita vanhenemisen kuuden päivän jälkeen. Näitä olivat litistetty solun morfologia kertyminen SA-β-galaktosidaasi-positiivisia soluja (kuvio. S3A).

PTEN

null PC3, LNCaP ja C4-2 solulinjat osoittivat säteilyn ja PARPi annoksesta riippuva nousu SA-β-galaktosidaasi-positiivisten solujen hoitoon joko säteilyllä tai rucaparib (Fig. 2A ja 2B) . LNCaP oli eniten senescent solujen seuraavista joko yksin tai yhdistelmähoitoa. Sitä vastoin DU145 soluja, joilla on villin tyypin

PTEN

alleeli näytti lähes senescent soluja edes korkeimmalla käytetyillä annoksilla. Yhdistelmä indeksi vanhenemista SA-β-galaktosidaasi värjäys osoitti kohtalaisen voimakas synergia (CI = 0,5-0,7) PC3, LNCaP ja C4-2 solut (Fig. 2C ja kuvio. S2). Vanheneminen ominaisuudet pysyivät yllä vähintään kahdentoista päivän kasvoi hieman määrä β-galaktosidaasi-positiivisia soluja (Fig. 2D ja kuvio. S3B). Nämä tiedot osoittavat, että vanhenemista edistää vähentynyt selviytymisen

PTEN

vajausta soluille ja että laajuus vanhenemisen korreloi klonogeenisten selviytymisen.

Suhteellinen β- galaktosidaasi-positiivisten solujen määritettiin seuraavat säteilyä (A ) ja rucaparib (B), hoito

PTEN

vajausta LNCaP, C4-2, ja PC3-soluissa. Prosenttiosuus β-galaktosidaasi-positiivisten solujen määritettiin laskemalla ≥five eri alojen (-70 solua /näyte). C, Synergy analyysit vanhenemista LNCaP, PC3, ja C4-2 solujen yhdistelmähoitoa. Katso kuvat. S2 ja 3 varten β-galaktosidaasin värjäys ja lisäksi synergiaa analyysejä. D, Prosenttiosuus β-galaktosidaasin positiivisia C4-2 solut määritettiin 12 päivän kuluttua hoidon säteilyn ± rucaparib. E, vanhempien ja

TMPRSS2-ERG

fuusio geenin ilmentäviä PC3-solut kvantifioitiin SA-β-galaktosidaasi-värjäys 6 päivää seuraavan 4 Gy säteilyä, 2,5 uM rucaparib, ja DNA-PKcs: n estäjä NU7441 (500 nM ), yksinään tai yhdistelmänä. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

VCAP soluja, jotka satama

TMPRSS2-ERG

-fuusiogeenin, osti senescent solut sädehoidon ja PARPi (Fig. S4 ). Nämä solut ovat riippuvaisia ​​fuusio geeni, siis tutkii vanhenemista seuraavat knock-down on

TMPRSS2-ERG

ollut informatiivinen. Siksi käytimme PC3-solut ilmentävät samaa isoformin,

TMPRSS2-ERG fuusio III

edelleen vanhenemista kokeita. PC3-solut ilmentävät

TMPRSS2-ERG

oli lisääntynyt määrä SA-β-galaktosidaasi-positiivisten solujen sädehoidon (Fig. S4). Vaikutus

TMPRSS2-ERG

ilmentyminen oli verrattavissa siihen, mitä saatiin PC3-soluissa säteilytetään, kun läsnä on DNA-PKcs: n estäjä NU7441 (p = 0,0002), kun taas NU7441 yksinään ei aiheuttanut vanhenemista joko solulinjassa . Rucaparib hoito yhdistettynä säteilyn merkitsevästi (p 0,0001) lisäsi senescent solujen

TMPRSS2-ERG

ilmentävillä PC3-solut, jotka jälleen korreloi PC3-solujen saaneet sädehoitoa, rucaparib, ja NU7441, (p = 0,0009) (Fig. 2E). NU7441 käsittely ei aiheuttanut vanhenemista PC3-soluissa, jotka ekspressoivat

TMPRSS2-ERG

fuusio sädehoidon, yksin tai yhdessä rucaparib. Nämä tulokset osoittavat, että DNA-PKcs toiminta on kriittinen vanhenemista, kuten lisääntynyt määrä senescent solujen

TMPRSS2-ERG

ilmentävillä soluilla tai kun DNA- PKcs estyy.

Rucaparib Lisäykset Pysyvyys Säteilyn aiheuttaman DNA Damage Foci

vieressä tutki tehokkuuden hoitojen liittyi niiden kyky aiheuttaa DNA-vaurioita. χH2AX ja p53BP1 vahvistetaan korvikkeita mittaamiseksi ionisoivan säteilyn aiheuttaman pesäkkeitä (IRIF) [24]. Säteilytys syntyy lisääntynyt määrä χH2AX pesäkkeestä 3 ja 6 h, joka oli huomattavasti vähentynyt 24 h, osoittaa korjaamiseen DNA-vaurioita (Fig. 3A). Sitä vastoin, kun soluja on säteilytetty läsnä rucaparib, χH2AX pesäkkeitä jatkui 24 tuntia. Lisäksi polttopistettä p53BP1, toinen perustettiin merkkiaine DSB, oli näkyvämpi 24 tunnin säteilytyksen jälkeen, jossa yhdistetyn hoidon rucaparib tuloksena on lisääntynyt määrä pesäkkeitä (Fig. 3B). Rad51 on keskeinen osa HR; sen ilmentymistä ei vaikuta

PTEN

asema, sopusoinnussa tuoreessa raportissa [25]. Kuitenkin yhdistelmä rucaparib ja säteilyn osoittivat pysyviä Rad51 pesäkkeitä 24 h (Fig. 3C), mikä osoittaa, että yhdistelmä on tehokas aiheuttamalla pysyviä DNA-vaurioita käsitellyistä soluista.

χH2AX (A) ja 53BP1 (B) pesäkkeitä määritettiin immunofluoresecence mikroskoopilla 24 tunnin seuraavista yhdistetyn sädehoidolle ja rucaparib PC3 ja LNCaP-soluja (vasen paneeli), jossa ajasta riippuva kinetiikka esitetään (oikea paneeli). C, Rad51 pesäkkeet visualisoitiin ja mitattujen PC3-soluissa vastaavasti 24 tunnin jälkeen hoidon. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

LDR lisäävästi DNA Damage ja alennetulla Cell Survival

Säteilyn annetaan klinikalla joko ulkoinen beam sädehoitoa (EBRT ) tai brachytherapy. Säteily hoitoon PCa mukaan brakyhoidoksi tyypillisesti käytetään annosnopeudet 70 cGy /h verrattuna 200-300 cGy /min, joita käytetään yleisesti EBRT varten

in vitro

säteilyn tutkimukset ihmisen syövän solulinjoista perinteisiin irradiators. Tutkia tehokkuuden pienempi annos-hinnat, C4-2 ja PC3 solut altistettiin annosnopeudet on 56-690 cGy /min, saavuttaa yhteensä annos 5Gy. Mitä pidempi valotusaika suoraan korreloi laajempi DNA-vaurioita, mikä vähentää pesäkkeet (Fig. 4A) ja lisää χH2AX ja 53BP1 pesäkkeet (Fig. 5A ja 6A). Pienin annosnopeus (56 cGy /min) lisäsivät χH2AX pesäkkeitä merkitsevästi (p 0,0002) verrattuna perinteiseen annosnopeuden (146 cGy /min). Lisäämällä rucaparib merkitsevästi (p 0,0001) aiheuttama DNA-vaurioita mitattuna lisääntynyt määrä χH2AX pesäkkeitä (kuvio. 5B). Lisäksi oli merkittävästi (p 0,0001) lisääntyneisiin p53BP1 pesäkkeitä jälkeen yhdistelmähoidon (Fig. 6B). Pienin annosnopeus säteilyn (56 cGy /min) indusoi merkittävästi enemmän 53BP1 IRIF (p = 0,004 0,0007 varten C4-2 ja PC3-solut) kuin korkeimman annosnopeuden (690 cGy /min).

, klonogeeninen selviytymisen määritykset tehtiin PC3 (vasen paneeli) ja C4-2-solut (oikea paneeli) eri annoksesta hinnat ± 1,25 uM rucaparib. B, C4-2 solut altistettiin eri annosmäärät säteilyn peräisin Ir-192 lähde ± 2,5 uM rucaparib. Kaikkiaan säteilyannos 5 Gy (vasen paneeli) ja 10 Gy (oikea paneeli) on annettu; Siksi valotushetkellä erosivat eri annoksesta hinnat käytetty. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

, konfokaali immuunivärjäykseen χH2AX pesäkkeitä, enumarated PC3 ja C4-2 soluissa säteilyä osoitetussa annosnopeuksilla. B, kvantitointi annoksesta riippuvaa muodostumista γH2AX pesäkkeitä. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

, konfokaali immunovärjäyksen 53BP1 pesäkkeitä PC3 ja C4-2 soluissa säteilyä osoitetussa annosnopeuksilla. B, Graafinen esitys annosriippuvaista 53BP1 IRIF sukupolvi. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin LR-192 säteilylähde (kiinteä yhteensä annoksella 5 ja 10 Gy) ± rucaparib. Solut, jotka saivat pienimmät annosnopeuden (4,34 cGy /h), ne suoritetaan pisimpään, muodostuu vähemmän pesäkkeitä verrattuna altistuvat kohtalainen suurempiin annoksiin (26,8 cGy /h) säteilyn (Fig. 4B). Rucaparib huomattavasti vähentää pesäkkeiden muodostumisen jopa korkeimmalla LDR testattu annos (26,8 cGy /h), joka tarvitaan ~18 h saavuttamiseksi 5 Gy.

PARP Inhibition herkistää säteilylle TMPRSS2-ERG Fusion Gene ilmentävien solujen siinä määrin Samanlaisia DNA-PKcs esto in Vanhempien Solut

fuusio välillä

TMPRSS2

, androgeeni-säännelty onkogeeni, ja ETS transkriptiotekijä estrogeenisäädeltyjen geeni, ERG syntyy välimainosyksikkö poisto kromosomissa 21 tai vastavuoroinen translokaatio on läsnä -50% alkuvaiheen PCa [26]. VCAP solut, jotka ilmentävät

TMPRSS2-ERG

endogeenisesti oli radiosensitized mukaan rucaparib (Fig. 1 B ja kuviossa. S2A). Nämä solut ovat riippuvaisia ​​

TMPRSS2-ERG

kuin ne pysähtyvät lisääntyvät, kun se on tyhjentynyt siRNA (tuloksia ei ole esitetty). Siksi PC3-soluja transfektoitiin

TMPRSS2-ERG

fuusio III isoformin, yleisin PCa fuusio geeni. Sen vakaa ilmaisu ei ollut merkittävää vaikutusta radioherkkyyttä, arvioitu klonogeeniset eloonjäämisen määritykset (Fig. S1B) ja χH2AX ja 53BP1 pesäkkeitä. Kuitenkin, kun sitä annettiin yhdessä rucaparib, pesäkkeiden määrä väheni merkittävästi (p = 0,0105) (Fig. 7B). Tämä vaikutus oli verrattavissa siihen, mitä saatiin PC3: lla käsiteltyjen solujen DNA-PKcs estäjä NU7441. Rucaparib yhdistelmä edelleen radiosensitized näiden solujen (p = 0,0005), siinä määrin verrattavissa soluihin, jotka ekspressoivat

TMPRSS2-ERG

fuusiogeenin käsiteltiin rucaparib (Fig. 7A). Lisääntynyt määrä 53BP1 ja χH2AX pesäkkeet olivat nähtävissä jo pienimmällä annosnopeus, mikä myös osoittaa, että rucaparib on voimakas säteilyherkiste PCA soluja, jotka satama fuusio geenin (Fig. 7C).

, klonogeeninen -eloonjäämiskoe PC3-soluissa 4 Gy säteily ± 2,5 uM rucaparib ja DNA-PKCS -estäjä NU7441 (500 nM; vasen paneeli). B, klonogeeninen selviytymisen määritykset PC3-soluissa ja johdannaiset ilmentävät TMPRSS2-ERG fuusio III eri annoksen hinnat ± 2,5 uM rucaparib. C, immuunivärjäytyminen χH2AX ja 53BP1 PC3-solut, jotka ekspressoivat fuusiogeeni sädehoidon ± rucaparib hoitoa 24 tuntia. Virhepalkit edustavat SD keskiarvon (n = 3).

Keskustelu

Rucaparib (CO-338, joka tunnettiin aiemmin nimellä AG014699 ja PF-01367338), joka on PARPi edustaa uutta luokkaa aineita on dokumentoitu antituumorivaikutuksia ihmisen solulinjoissa ja ksenografteissa sisältävät mutatoitunut tai epigeneettiseltä vaiennettu BRCA1 /2 [4], [27]. Ennen työ on osoittanut, että PARP-1 on vuorovaikutuksessa TRMPRSS2-ERG, joka tarjoaa näin mekanistinen perustelut käytön PARPi ETS geeni fuusio-positiivisten PCa [3]. Tässä näytämme ensimmäistä kertaa sen tehokkuutta säteily herkistävä paneelissa Eturauhassyövän solulinjojen, joissa maksimaalinen synergia saavutetaan pieniannoksisen-rate (LDR) pikemmin kuin tavanomaiset annoksen säteilyä. LDR käytetyt annokset tässä jäljittelevät työskentelevien kliinisessä käytännössä PCA brachythrepay [28]. Uskomme, että tämä havainto on tärkeä, koska brakyhoidoksi on tehokkaampi kuin EBRT PCA hoitoon, ja se voi käyttää molekyylitason mekanismeja, jotka edistävät tehostetun syöpäsolun radioherkkyyttä, tutkimuksessamme tehostetun vanhenemista. Itse asiassa kemiallinen inhibitio PARP-1-aktiivisuutta indusoi merkittävästi säteilylle herkäksi useita eksponentiaalisesti kasvavan kasvaimen solulinjojen 5-30 cGy annosalueella. LDR säteilylle herkäksi aktiivisesti jakamalla kasvainsolujen PARPi viittaa siihen, että ne voivat olla rooli tehostaa tuotteiden ultra-fraktioitua tai LDR hoito [29]. Meidän tutkimukset osoittavat, että rucaparib on erittäin voimakas PARPi että synergistisesti kliinisen säteilyannosten aikana saavutetun brakyhoidoksi. Sen käyttö rediosensitizer on tehokas, vaikka säteilyannos on paljon pienempi, tilanne kohdanneet radioaktiivinen ”siemenet” hajoamisen aikana pitkällisiä niitä käytetään PCA potilaille.

Rucaparib, ensimmäinen PARPi joka oli kehitetty ja testattu klinikalla (vuonna 2003 nimellä AG014699) [22], [23], on myös osoitettu olevan tehokas tuumoriksenografteja on rinta-, keuhko-, paksusuoli-, peräsuolen, ja haimasyövän [27], [30 ]. Samalla, sen on osoitettu olevan ei-toksinen hiirissä, jotka suorittaa vähintään yksi funktionaalinen kopio BRCA2-geenin. Tutkimuksemme on ensimmäinen suoritetaan rucaparib PCA. Vaikka emme ole harjoittanut samanlaisia ​​ksenografti tutkimukset, jotka perustuvat edellä mainittujen raporttien monipuolista kasvaintyypit, kaikki viittaa siihen, että nämä tulokset olisivat kääntää PCa ksenograftimalleja.

Rucaparib on tutkittu yhdessä eri kemoterapia-aineiden. Sen havaittiin olevan tehokas yhdessä platinaa rinta- ja munasarjasyövän ksenograftimalleissa [27], [31]. Tutkimuksemme on ensimmäinen tutkittava tehokkuutensa samanaikaisesti sädehoidon kanssa. Muut PARPi yhdessä säteilytys, raportoitiin aiheuttavan merkittävää kasvaimen kasvua viivästyminen keuhkosyövän

in vivo

mallit [8], ja tehokkaiksi säteilyherkistimet sekä keuhko- ja PCa solulinjat [32]. Herkistyminen säteilylle ja alkyloivat aineet vahvistui DSB korjaus-vajaiden solujen [33], sopusoinnussa merkittävä herkkyys PARP eston BRCA-1 ja BRCA-2-puutosta tuumorisoluissa [6]. ABT-888 (veliparib) PARPi on äskettäin osoitettu parantavan vasteen PCa solujen ja kasvaimia säteilytyksen DU145 ja PC3-soluja [34]. Yhdistämällä ABT-888 6 Gy hidasti kasvaimen uusiutumista verrattuna kumpaakin annettaisiin erikseen ainoastaan ​​PC3 ksenograftikasvaimissa, kun taas DU145 kasvaimet jatkoivat kasvuaan. Samanlaisia ​​Tutkimustemme, PC3 mutta ei DU145 solut ja kasvaimia osoitettiin sisältävän runsaasti senescent soluilla pysyviä DNA-vaurioita pesäkkeitä [34]. Osoitamme, että rucaparib on tehokas lisä-

PTEN

vajausta solut mukaan lukien ne, jotka satama ETS geenifuusioissa. On selvää, teho PARPi voi riippua toimivaltaisen vanhenemista vastaus kertynyt DNA vaurioita, kuten silloin, kun

PTEN

on puutteellinen tai kun

TMPRSS2-ERG

ilmentyy. Tuoreessa tutkimuksessa on todettu, että rucaparib radiozensitization voi olla myös NF-KB riippuvainen [35]. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että

TMPRSS2-ERG

lisäksi

PTEN

puutos, voi herkistää ja PARPi, joka synergizes sädehoitoon.

Koska mutaatiot BRCA1 /2 jotka tarjoavat ”

synteettinen kuolleisuutta

” suhde PARPi ovat harvinaisia ​​PCA, on huomattavaa kiinnostusta määriteltäessä muihin molekyylitason merkkejä PARPi herkkyys. Todellakin, herkistyminen PARPi on hiljattain osoitettu olevan täydennetty estämällä DNA-vaurioita signalointi kautta ATM /Chk2 [36], [37] ja MRN monimutkainen kautta MRE11 [38]. Sen sijaan, estää NHEJ DNA korjata kautta p53BP1 [39], voidaan itse asiassa torjua hieno herkkyys PARPi aiheuttama BRCA1 puutos [40]. Toisaalta, p53 meidän PCa solussa paneeli ja tuoreessa raportissa [39] ei tehdä eroa, koska sekä p53 null (PC3) tai p53 taitavia (LNCaP, C4-2) solut reagoivat yhtä hyvin PARPi kuin säteilyherkiste. Vastaus oli varsin riippuvainen lähinnä pätevän senescent vasteen, joka oli poissa DU145 soluissa, joiden toiminnallinen

PTEN

alleeli ja katkaistun, toimimaton retinoblastooma tuumorisuppressoriproteiinia [41].

ETS geenifuusiot löytyy useimmissa PCa tapauksissa [26]. Ilmentyminen fuusiogeeni on vastuussa solujen proliferaation PCa solut, jotka ilmentävät

TMPRSS2-ERG

[42]. Hiiri prostates vailla

PTEN

näyttö parannettu kasvain genesis läsnäollessa yliekspressoitu ERG [43]. Tuore raportti osoitti, että fuusio geenin ilmentyminen muuttaa radio- ja kemoterapian herkkyyden röntgensäteilyn annetaan yhdessä paklitakselin [44]. Samanlainen BRCA1 /2 puutos, inhibiittorit PARP-1 parantaa siinä määrin, DNA-vaurion edistää aluksi yliekspressio fuusio- geenien [3]. Siksi eturauhaskasvainsoluissa kätkeminen ETS fuusiot, kuten

TMPRSS2-ERG

ovat alttiimpia vankka vaste PARPi, yksin yhdessä LDR. Toinen tutkimus on kuitenkin todettu, että

PTEN

poisto PCA soluissa ei välttämättä yhdistää menetys RAD51 toiminto [25], jossa herkkyys eri PARPi liittyessä sijaan kanssa vika MRE11 ilme. Olemme havainneet, että DNA-PKcs inhibitio

TMPRSS2-ERG (tuloksia ei ole esitetty) B on kriittinen rooli vanhenemista aktivointia. Merkillistä, DNA- PKcs ilmaisu on viime aikoina osoittanut ennustaa vastetta sädehoidon PCA [45].

Lisäksi sen rooli DNA-vaurioita ja korjaus, transkriptionaalisen rooli on myös johtuvan PARP-1 [3], viimeksi osoittaa, että se on tarpeen androgeenireseptorin toiminnon, erityisesti kastraatio kestävä malleja Eturauhassyövän [46].