Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kolmiulotteinen (3D) kasvainsoluviljelmiä kasvatettu laminiinin rikastu soluväliaineen ( lrECM) pidetään heijastaa ihmisen kasvaimissa realistisempi verrattuna soluihin, joita kasvatetaan yksikerroksisina muovi. Täällä systemaattisesti tutkittu vaikutusta ECM fenotyyppiin, geenien ilmentyminen, EGFR-signalointireitin sekä EGFR esto yleisesti käytetyissä peräsuolen syöpä (CRC) solulinjat. LrECM on-top (3D) luviljelymäärityksistä suoritettiin CRC solulinjojen SW-480, HT-29, DLD-1, LOVO, CACO-2, COLO-205 ja COLO-206F. Morfologia lrECM viljeltyjen CRC solulinjoissa määritettiin vaihekontrasti ja konfokaali laserkeilauksen fluoresenssimikroskopiaan. Solujen lisääntymistä tutkittiin MTT: llä, invasiivisia kapasiteetti solulinjoista määritettiin käyttäen Matrigel päällystettyjä Boyden kammioita, ja muuttavien aktiivisuus määritettiin käyttämällä aita määrityksessä. Differential geeniekspressio analysoidaan transkription tasolla Agilent array alustalla. EGFR estyi käyttämällä erityistä pienmolekyylisalpaaja- AG1478. Erityinen pallonen kasvun malli havaittiin kaikki tutkitut CRC solulinjoissa. DLD-1, HT-29 ja SW-480 ja Caco-2-nähtiin selvää kiinteä kasvain solujen muodostumista, kun taas LOVO, COLO-205 ja COLO-206F leimasi muodostamalla rypäleen kaltaisia ​​rakenteita. Vaikka esiintyminen pallomaista morfologiaa ei korreloinut muuttunut vaeltavia, invasiivisia tai proliferatiivinen kapasiteetti CRC solulinjat, geenin ilmentyminen oli selvästi muuttunut soluja kasvatettiin lrECM verrattuna 2D kulttuureissa. Mielenkiintoista on, että KRAS villityypin solulinjoilla, EGFR oli vähemmän tehokas lrECM (3D) viljelmiä verrattuna 2D soluviljelmissä. Siten verrataan sekä 2D- että 3D-soluviljelymalleissa, meidän tiedot tukevat vaikutuksen ECM syövän kasvua. Verrattuna perinteisiin 2D solu kulttuurin lrECM (3D) soluviljelymalli tarjoaa mahdollisuuden tutkia pysyvä CRC solulinjojen enemmän fysiologisissa olosuhteissa, eli yhteydessä molekyyli terapeuttisen tavoitteet ja niiden farmakologinen esto.

Citation: Luca AC, Mersch S, Deenen R, Schmidt S, Messner I Schäfer KL, et al. (2013) vaikutus 3D microenvironment on Fenotyyppikuvaus, Gene Expression, ja EGFR esto peräsuolen syövän Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e59689. doi: 10,1371 /journal.pone.0059689

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 29., 2012 Hyväksytty: 17 helmikuu 2013; Julkaistu: 26 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Luca et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ osittain tuettu avustuksia Forschungskommission lääketieteellisen tiedekunnan, University Düsseldorf (41/09 AK ja 24/10 KLS), Rudolf Bartling-Stiftung (II /98-NHS) ja avustusta Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 728) ja NRW tutkijakoulu ”BioStruct” (molemmat RPP). rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pysyvä syöpäsolun linjat voidaan tarjota lähes rajaton tarjonta solujen melko samanlainen genotyyppien ja fenotyyppien [1] ja ovat käytännössä ainoa vaihtoehto mekaaniset tutkimukset ihmisen syöpäsolujen valvotuissa olosuhteissa [2], [3]. Näin ollen ihmisen syövän solulinjat on laajalti käytetty

in vitro

malleja ihmisen syövän. Esimerkkinä onnistuneesta ja hyvin huomattava sovellusalue on löytö, kehittäminen ja testaaminen syöpälääkkeiden [3]. Kuitenkin, riippuen tieteellinen kysymys on myös selviä rajoituksia muutosten tutkimiseen syöpäsoluihin, jotka liittyvät syövän etenemisessä koska useimmat pysyvä syöpä solulinjat on perustettu kehittyneitä syöpiä edenneessä genotyyppien [1]. Kuitenkin yksi tärkeimmistä ongelmista rajoittavat arvo syöpäsolulinjoissa mallina ihmisen syövän johtuu yleisin tapa kulttuuriin solulinjojen

in vitro

, ts homotyyppisessä yksikerroksista muoville alustoille (2D ). Kun taas primaarisyöpien ja etäpesäkkeet ovat monimutkaisia ​​heterotypic kolmiulotteisia rakenteita upotettu erillisiä elinspesifiseen mikroympäristöihin, se on hyvin tiedossa, että solut, joita viljellään klassista 2D viljelmiä irti monia tunnusmerkkejä niiden

in vivo

kollegansa [ ,,,0],4]. Lisäksi tärkeitä solun toimintoja, kuten lisääntymistä ja erilaistumista voidaan keinotekoisesti muutettu [5].

Yhteistä normaalien ja pahanlaatuisten epiteelisolujen on, että ne ovat fysiologisesti tiiviissä yhteydessä solunulkoiseen matriisiin (ECM) . ECM, joka koostuu kuitu- proteiinien ja glykosaminoglykaanit, ympäröi epiteelisolujen niiden solunulkoisessa tilassa ja muodostaa niiden tyvikalvon. ECM tarjoaa paitsi fyysistä voimaa järjestetty epiteelisolujen [6], [7], mutta myös tärkeä avain biokemiallisia rakenteita ja signaalit napaisuuden ja kasvua [7], [8]. Yksinkertainen järjestelmä

in vitro

ECM mallinnus on liuennutta tyvikalvon valmiste uutetaan Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) hiiri sarkooma, kasvain runsaasti soluväliaineen proteiinit, jotka käsittävät laminiini, kollageeni IV hepariinisulfaattia proteoglykaanien ja entaktiini /nidogen [9] – [18]. Koska sen molekyyli- koostumus, erityisesti sen korkea laminiini sisältöä, se pidetään sopiva korvike tyvikalvon. Jos epiteelisoluja viljellään tämän laminiinin-rikas soluväliaineen (lrECM), ne kasvavat kolmiulotteisia rakenteita [15], [16], [19]. Uranuurtajana jota Bissell ryhmä ja muut – pääosin tehty ensisijaisesti rintojen soluja ja rintasyövän solulinjoissa – osoittivat dramaattisia morfologisia ja biokemiallisia eroja, normaalin ja pahanlaatuisia soluja kasvatettiin 2D muovi- alustoille ja 3D lrECM vastaavasti [6], [20 ], [21]. From kliininen kannalta on tärkeää huomata, että lrECM (3D) kulttuuri – mallina lähempänä

in vivo

tilanteessa – voivat johtaa erilaisiin vastauksiin molekyyli hoitoja, kuten viime aikoina osoittanut rintasyövän solujen linjat [22], [23], [24]. Yllättäen lrECM (3D) viljelmiä edelleen harvoin käytetään kokeissa syöpäsolulinjoissa ja vain muutamia tutkimuksia analysoidaan systemaattisesti vaikutuksia lrECM kulttuurien pysyvää solulinjoilla tarjoaa perustietoa näissä malleissa. Toistaiseksi näitä järjestelmällinen analyysit lrECM kulttuurien keskittyi lähinnä fenotyyppinen karakterisointi rintasyövän solulinjat kasvatettiin alla lrECM 3D

vs.

2D olosuhteissa.

Täällä laajensimme toiminnallinen ymmärrystä vaikutusten ero lrECM (3D)

vs.

2D kasvuolosuhteita koolonkarsinoomasoluissa. Olemme systemaattisesti tutkittu vaikutusta lrECM solun fenotyyppiin ja geeniekspressiomalleja yleisesti käytetyissä peräsuolen syöpä (CRC) solulinjat. Tuloksemme osoittavat, että CRC solulinjat osoittavat selvästi morfologisia sferoidiviljelmiä tyyppejä kun viljellään lrECM. Vaikka pallojakaantuminen morfologia CRC linjat eivät korreloineet muuttunut muuttavia, invasiivisia tai proliferatiivisen solun kapasiteettia, solulinjoja kasvatettiin lrECM (3D) olosuhteet näytteillä

sinänsä

heikentynyt leviämisen verrattuna hallita 2D kulttuureissa. Lisäksi geenien ilmentyminen oli selvästi muuttunut CRC solulinjoissa viljeltynä lrECM /3D olosuhteissa. Lisäksi teho farmakologinen EGFR esto heikentynyt CRC-soluja kasvatettiin lrECM verrattuna 2D kulttuureissa. Siten 3D microenvironment on suuri vaikutus solujen fenotyyppiin ja farmakologinen herkkyys CRC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

LOVO saatiin European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Iso-Britannia), COLO-205 American Type Culture Collection (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Saksa), CACO-2, COLO-206F, DLD-1, HT-29 ja SW-480 Saksan Resource Centre for Biological Material (DSMZ, Braunschweig, Saksa). Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin vakiona kudosviljelmän olosuhteissa RPMI 1640+ GlutaMAX ™ -I (Gibco /Invitrogen, Darmstadt, Saksa), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco /Invitrogen,). Soluja viljeltiin joko kudosviljelymuoviin (2D) (Greiner bio-one, Frickenhausen, Saksa) tai 3D sisällä kasvutekijän vähensi laminiini- rikas soluväliaineen (lrECM 3D) on-top viljelmät istuttamalla soluja päälle ohut geeli Engelbreth-Holm-parvi tuumoriekstraktin (BioCoat Matrigel tyvikalvon, kasvutekijä vähentää, BD Biosciences, Heidelberg, Saksa). Solut maljattiin Matrigel on-top määritys tiheydellä 1,8 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille. Kuulat viljeltiin 7 päivää ennen toipumassa Matrigel. Sillä morfologia tutkimuksia, palloja viljeltiin jopa 10 päivää. Väliaine vaihdettiin joka toinen päivä 3D kulttuureissa. 3D-aloilla otettiin talteen Matrigel tyvikalvon poistamalla väliaine Matrigel soluviljelmästä ja inkuboitiin 400 ul /kuoppa dispaasi (BD Biosciences, Heidelberg, Saksa), esikuumennettiin 37 ° C: ssa, 2 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Aktivointi dispaasia lopetettiin 10 mM EDTA: 1 x PBS: ssä. Kuulat sentrifugoitiin ja pestiin 1 x PBS: llä. 2D viljellyt solut myös pestiin PBS: llä ja raaputettiin kulttuurin lautasen. Proteiinien eristämiseksi 3D palloja otettiin talteen matrigeelin inkuboimalla 5 mM EDTA PBS: ssa 30 minuuttia jäillä seurasi kolme pesuvaihetta PBS: llä.

KRAS ja BRAF Mutaatioanalyysi

Standard syklisekvensointireagenssipakkausta suoritettiin (uudelleen) arvioi

KRAS

ja

BRAF

mutaatiostatus paksusuolen sinoomasolulinjoja (taulukko 1). Eksonit 2, 3 ja 4

KRAS

analysoitiin käyttäen seuraavia oligonukleotidialukkeita: 5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ’ja 5′-AAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′ ja eksoni 2, 5’-GGATTCCTACAGGAAGCAAGT-3 ’ja 5 ’-GGCAAATACACAAAGAAAGC-3’ varten eksoni 3 ja 5’AGACACAAAACAGGCTCAGGA-3 ’ja 5’AAGAAGCAATGCCCTCTCAA-3’ eksonille 4.

BRAF

monistamisen eksoni 15 suoritettiin käyttäen forward-aluketta 5 ’ – TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ’ja käänteisaluketta 5’AGCCTCAATTCTTACCATCCA-3’. Kun taas käänteinen alukkeita käytettiin DNA-sekvenssin analyysi

KRAS

eksonin 2 ja 4, eteenpäin alukkeita käytettiin

KRAS

eksoni 3 ja BRAF eksoni 15, vastaavasti [25].

STR Analysis

STR sormenjälkien analyysiä DNA eristettiin käyttäen Qiagen Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistaa opetusta. Genominen DNA (1 ng) monistettiin käyttäen genRES® MPX-2 ja genRES® MPX-3 multiplex PCR järjestelmät (Serac GmbH, Bad Homburg, Saksa) tuottaa 9 ja 12 eri STR markkerisekvenssit. PCR-tuotteet analysoitiin ABI 310 kapillaarisen sekvensseri ja allelotyped jonka ”GENOTYPER V3.1” ohjelmisto (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [26].

elinkykyyn, Proliferation ja apoptoosi Analyysit

Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille. Kun taas solut levitettiin suoraan kudokseen Muovilaattojen 2D kulttuureissa, 3D viljelmiä valmistettiin maljaamalla solut on ohut kerros Matrigel. Inkubointiajan jälkeen 48 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma-Aldrich, Hampuri, Saksa) lisättiin median 4 h ennen kiinnityksen yön MTT lopettamisen, joka sisälsi 10% SDS: ää, 5% 1-butanolia ja 0,01 M HCI: a. Vähentäminen MTT formatsaani mitattiin 540 nm: ssä käyttäen Tecan auringonnousu kauko (TECAN ryhmä Ltd., Maennedorf, Itävalta).

leviämisen kasvatettujen solujen 2D- tai 3D-viljelyolosuhteet kvantifioitiin 5-bromi 2-deoxyuracil (BrdU) sisällyttäminen käyttäen 5-bromi-20-deoksi-uridiini Labeling ja Detection Kit I (Roche) noudattamalla valmistajan ohjeita. Inkubointiajan jälkeen 48 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 väliaine poistettiin ja soluja inkuboitiin vielä 1 h 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 BrdU: lla merkintöjä media. 3D-aloilla otettiin talteen Matrigel inkuboimalla 5 mM EDTA: lla PBS: ssä 30 minuutin ajan. Solut pestiin kaksi kertaa 1 x PBS: llä ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 400 rpm. Talteen sferoidit päällystettiin lasilevyille ja kuivattiin yön yli huoneenlämpötilassa. Tumat vastavärjättiin 40,6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Jopa 200 solut laskettiin viidestä eri aloilla kohti valmistelu käyttäen Axio Scope fluoresenssimikroskooppia (Zeiss, Jena, Saksa). Lukumäärä lisääntyvien solujen laskettiin prosenttiosuutena kokonaismäärästä DAPI-positiivisten solujen määrä kenttää kohden (kolme satunnaisesti valittua kenttää per peitelasi). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin suhde määrää DAPI-positiivisten solujen kanssa hajanainen ytimiä, tunnettu morfologinen tunnusmerkki apoptoosin, ja kaikki DAPI-positiivisia soluja.

Aita Assay (Migration Assay)

muuttoliike määrityksiä 7,5 × 10

3-solut maljattiin 16 mm aita (Aix Scientifics®, Aachen Saksa). Soluja viljeltiin RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää konfluenssiin asti on saavutettu ja aita poistettiin. Soluja kasvatettiin neljä päivää, sitten kiinnitettiin 10% formaldehydillä ja värjättiin Mayerin haemalaun värjäysliuosta. Halkaisijat värjättyä yksisoluiset kerrokset arvioitiin mm käyttämällä Versa Doc Imaging System (BioRad, Munich, Saksa). Erottaa soluproliferaation ja solujen vaeltaminen, pre-kokeet suoritettiin elatusaineissa on täydennetty 1% FBS: ää tai 10% FBS: ää.

Invasion Pitoisuus

Invasion määritys suoritettiin käyttäen BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences) ohjeiden valmistajan. Kalvot kiinnitettiin lasilevyille ja värjättiin kristallivioletilla. Soluja tietyllä keskialueella kalvon laskettiin.

lääkehoito ja proliferaatiomääritystä

EGF-reseptorin estyi tyrosiinikinaasin estäjä tyrfostiini AG1478 (Sigma Aldrich). Solut maljattiin tiheydellä 6 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja käsitelty AG1478 lopullisessa pitoisuudessa 20 uM, 10 uM, 5 uM, 2,5 uM, 1 uM tai 0,1 uM 48 tunnin ja 96 tunnin 2D- ja 3D-soluviljelmissä. DMSO /metanolia ekvimolaarinen pitoisuuksina AG1478 pitoisuudet toimi auton ohjaus. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia lääkekäsittelyn jälkeen solujen lisääntyminen mitattiin suorittamalla MTT-määrityksiä yllä kuvatulla tavalla.

Kokonais-RNA uuttaminen ja cDNA-synteesi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden. RNA laimennettiin 50-80 ul nukleaasia vapaa ja steriiliä vettä. RNA-pitoisuus mitattiin spectrophometrically 260 nm ja RNA laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. CDNA-synteesiä varten, käänteistranskriptio (RT) suoritettiin lopputilavuudessa 20 ui käyttäen 1:10 laimennettua oligo (dT) aluketta (Invitrogen), 2 ug RNA: ta, ja 4 U transcriptor käänteistranskriptaasin kanssa 5 x RT-puskuria (Roche , Mannheim, Saksa).

Real Time PCR

pohja- ja mukaan alukkeet suunniteltiin käyttämällä Universal ProbeLibrary Assay Design Center (ProbeFinder versio 2.45, Roche Applied Science). Alukkeet kaikki syntetisoitiin MWG-Biotech, Ebersberg, Saksa (taulukko S1). cDNA laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 1 ng /ul. PCR, 2 ui cDNA-templaattia (tai vesi negatiivisena kontrollina) sekoitettiin 12,5 ul Fast Start Taq Man Probe Master mix (Roche), 0,25 ui kutakin eteen- ja taaksepäin aluketta (20 uM kutakin) ja 0,25 ui koetinta (Universal ProbeLibrary Set ihmisen, Roche). Kaikki näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena. Normalisoida ilmentymisen kohdegeenien, käytimme glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) sisäisenä viitteenä geenin. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qPCR) suoritettiin DyadDisciple Chromo 4 (BioRad) käyttäen seuraavia olosuhteita: 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä, joista kukin käsittää denaturaatio 15 sekuntia 95 ° C: ssa, jäähdytys ja laajennus 1 min 60 ° C: ssa. Geenien ilmentyminen kvantifioitiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä [27].

immunoblottauksella

Solut homogenisoitiin proteiinin lyysipuskuria PB1 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% Nonident P40 (Sigma), johon oli lisätty yksi tabletti fosfataasin estäjä Cocktail Tabletit ja PhosSTOP fosfataasilla Inhibitor Cocktail (molemmat Roche). liukoiset proteiinit erotettiin sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja 12000 rpm: ssä. Näytteet, jotka sisälsivät 40 ug selkeytetty proteiinia lysaatit kaistaa kohti erotettiin elektroforeettisesti SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. kalvot tutkittiin monoklonaalisella kanin anti-EGF-reseptori-vasta-ainetta (klooni C74B9, Cell Signaling, Denver, MA, USA) yli yön 4 ° C: ssa. Sillä havaitseminen AKT1 monoklonaalinen kanin anti-fosfo AKT1 (Ser473) vasta-aineella (klooni 193H12; Cell Signaling) ja monoklonaalisia kanin anti-AKT1 vasta-aineella (klooni C73H10; Cell Signaling) käytettiin. MAPK p44 /42 havaittiin käyttäen monoklonaalista kaniinin anti-fosfo p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) vasta-aine (klooni 20G11; Cell Signaling) ja monoklonaalisia kanin anti-p44 /42 MAPK-aineella (klooni 137F5, Cell Signaling). Havaitseminen MEK1 /2 suoritettiin käyttäen polyklonaalista kanin anti-fosfo MEK1 /2 (Ser217 /221) vasta-ainetta (Cell Signaling) ja monoklonaalisia kanin anti-MEK1 /2-vasta-aine (klooni 47E6, Cell Signaling). Ei-fosfo (aktiivinen) β-kateniinin (Ser33 /37 /Thr41) käytimme monoklonaalinen kanin vasta-aine klooni D13A1 (Cell Signaling) ja koko β-kateniinin monoklonaalinen kanin vasta-aine klooni D10A8 (Cell Signaling). Beeta-aktiini havaittiin käyttäen monoklonaalista hiiren anti-β-aktiini-vasta-ainetta (klooni AC-15, Sigma). Toissijainen anti-kani-vasta-ainetta (Cell Signaling) tai anti-hiiri-vasta-ainetta (Sigma) on liitetty piparjuuriperoksidaasiin inkuboitiin 90 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja havaitaan käyttämällä immuuni-Star ™ Western C ™ Kit (BioRad) käyttäen Versa Doc Imaging System (BioRad).

konfokaali Immunofluoresenssimikroskopia

Keräyspaperi palloset päällystettiin lasilevyille, kuivattiin yön yli huoneen lämpötilassa ja varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Dioja rehydratoitiin 1 x PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä metanoli /asetoni (01:01) 20 minuutin ajan -20 ° C: ssa, jota seuraa kaksi pesua vaiheiden 1 x PBS: ssä kunkin 5 minuuttia. Esto suoritettiin immunofluoresenssi- puskurissa, joka sisälsi 4% naudan seerumin albumiinia ja 0,05% saponiinia PBS: ssä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Värjäys suoritettiin PBS: ssä, joka sisälsi 1% BSA: ta ja 0,05% saponiinia yön yli 4 ° C: ssa. Hiiren monoklonaalinen anti-EpCAM-vasta-aineen BerEp4 (Dako, Hampuri, Saksa) käytettiin konsentraatiossa 2 ug /ml. MOPC (Sigma) toimi isotyyppikontrolli ja inkuboitiin pitoisuudella 2 ug /ml. Seuraavaksi näytteet pestiin kolme kertaa 1 x PBS: llä. Sekundaarinen vasta-aine, Alexa Fluor® 488 vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Invitrogen), inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa konsentraatiossa 10 ug /ml, mitä seurasi kaksi pesua vaiheet kunkin 5 minuuttia. Solut vastavärjättiin 0,1 ug /ml DAPI (Sigma) 1 x PBS: ssa 4 minuutin ajan, pestiin kaksi kertaa PBS: llä, ja asennettu VECTASHIELD® liuosta (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Kuvat saatiin käyttäen LSM510-Meta -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss, Jena, Saksa) varustettu 40 × /1,3 upottamalla tavoite ja viritysaallonpituuksia 364 nm ja 488 nm. Konfokaaliset kuvista ovat yksittäisiä optisia dioja 0,5 mikrometriä paksuus.

luokittelu Pallot

Aiemmassa työskentely Bissell ryhmä [2] osoitettiin, että pysyvä rintasyöpä solulinjoja viljeltiin standardoitua lrECM on-top määrityksen kehittämä tämän ryhmän muodostivat pallosia, joka oli tyypilliset kasvua kuvioita kuten paljasti faasikontrastimikroskopiassa tai CLSM. Rakeiden morfologia oli luokiteltu neljään eri havaittavissa ryhmää kuvatulla Kenny

et al.

[2]: ”Round”, ”massa”, ”rypäleen kaltainen” ja ”säteittäisen”. The ’round ”tyyppi muodostaa pesäkkeitä päälle geelien ominaista ytimet, joita järjestetään säännöllisesti ympäri keskustaa siirtomaa. The ’massa’ tyyppi solulinjoja muodostavat pesäkkeitä, jotka voivat myös olla pyöreä pesäke hahmotellaan upon faasikontrastimikroskopiaa, mutta on täynnä keskuksia ja sekavaa ytimeksi. The ’rypäleen kaltainen ”palloset näy löysä solu-solu yhteyksiä tyypillinen rypäleen kaltainen morfologia. ”Stellate” sferoidit leimasi invasiivisen ilmiasuun stellate ulokkeet tunkeutuvat geeli [2]. Käytimme tätä järjestelmää luokitella CRC solulinjan pallosia.

Gene Expression analyysit: Agilent Array Analyysit

Yhteensä RNA valmisteet analysoitiin RNA eheys Agilent 2100 Bioanalyzer. Kaikki näytteet tässä tutkimuksessa osoitti yhteistä korkealaatuinen RNA Integrity Numbers (RINS) 10. RNA kvantitoitiin fotometriset Nanodrop mittauksen. Synteesi cDNA ja myöhemmin fluoresenssileimayhdistei- cRNA suoritettiin valmistajan protokollan (One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis, Low Input Nopea Amp Labeling, Vers. 6.5; Agilent Technologies). Lyhyesti, 100 ng kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: n, jonka jälkeen

in vitro

transkription ja sisällyttämällä Cy3 leimattuja nukleotideja syntetisoituneeseen cRNA. Sen jälkeen pirstoutuminen, leimattu cRNA hybridisoitiin Agilent Human 8 × 60 K High Density oligonukleotidigeenisirumenetelmää. Tiedot analyysit tehtiin kanssa GeneSpring GX -ohjelma (Vers. 10.5; Agilent Technologies). Signaalin voimakkuus jakaumat poikki näytteet normalisoitiin quantile normalisointi. Lähtötiedot esikäsittelykoneiden päätettiin perustason siirtymistä mediaani kaikista näytteistä. Sen jälkeen ryhmittymä näytteiden mukaan viljelyolosuhdetta (lrECM 3D

vs.

2D kulttuuri, 24

vs.

25 näytettä, vastaavasti) tietyn transkriptin jouduttiin ilmaistava vähintään 75% näytteistä jonkin kahden tai molemmissa ryhmissä on analysoitava tarkemmin. Havaittavissa geenien ilmentyminen yli taustan oli siten ominaista ”Present” lippuja mukaan GeneSpring standardin asetukset Agilent mikrosiruja. Differential geenin ilmentyminen oli tilastollisesti määritettiin Mann-Whitney-U-testillä. Tuloksena

P

-arvot korjattiin useita testaus mukaan Benjamini-Hochberg. Tekstitystiedostojen osoittaa korjatun

P

corr-arvo alle 0,05 pidettiin parhaillaan ilmentyvät eri. Hierarkkinen cluster analyysit joko suoritettiin näytteillä tai transkriptien vastaavasti käyttäen Manhattan etäisyys mittareita ja täydellinen sidos.

Tilastot

Kaikki kokeet tehtiin itsenäisesti kolmena rinnakkaisena, ellei toisin mainita. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD, ellei toisin mainita. Korrelaatio sferoidi morfologian ja solulinjaa lähde (primaarikasvaimen

vs.

Etäpesäke) määritettiin käyttämällä Fisherin testiä (prisma 5, Graph pad Software, Inc. La Jolla, CA, USA). Erot solujen elinkelpoisuus mitattiin väriaineen absorbanssi 540 nm: ssä, solujen lisääntymisen, apoptoosin ja geenin ilmentyminen mitattiin RT-PCR: llä analysoitiin käyttämällä joko parillista t-testiä tai nonparametric kaksisuuntainen Mann-Whitney-U-testillä.

P

-arvo vähemmän kuin 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä. IC

50-arvot laskettiin Prism 5 (Graph pad Software, Inc.).

Tulokset

CRC Solulinjat näytteille kaksi eri morfologinen Sferoidiviljelmiä Tyypit kun viljellään lrECM

Ensimmäinen, testasimme onko CRC solulinjojen kasvaa lrECM näyttää tietyllä morfologia, joka voidaan luokitella neljään ryhmään kuvattu Kenny

et al

[2]. Käyttäen on-top määrityksessä kaikki tutkitut CRC solulinjat muodostettiin kasvain pallosia kahden päivän kuluessa. Kolmen päivää palloset kehittänyt erityisen morfologia, joka oli replikoituvaan vähintään kymmenessä riippumattomassa kokeessa. Vaikka sferoidit olivat hitaasti koko kasvaa, tämä morfologia oli stabiili jopa 10 päivää viljelyn. Pidemmät havainto kokeet eivät tehneet. Näistä solulinjoista, kolme erilaista kasvutavat havainnoitiin faasikontrastimikroskopiaan (Kuva 1A): ”Round”, ”massan” ja ”rypäleiden-like”. Erityisesti CACO-2 luokiteltiin ”pyöreä”, HT-29, DLD-1, ja SW-480 kuin ”massa” ja LOVO, COLO-206F ja COLO-205 ”rypäleiden kuten”.

A) kasvumorfologiaan CRC solulinjojen viljellään 2D (yläpaneeli) ja lrECM 3D-top määritysolosuhteissa (alempi kuva). Solut viljeltiin 3D kunnossa joko näyttää pyöreä (CACO-2), massa (DLD-1, HT-29, SW-480) tai rypäleen kaltainen morfologia (COLO 205, COLO-206F, LOVO) faasikontrastissa kuvia. Mittaviivat: 100 pm. B) Konfokaaliset laserkeilauksen fluoresenssimikroskopiaan kuvia CRC pallosia. Sferoidit kasvatettiin lrECM 3D mikroympäristöihin seitsemän päivää. Jälkeen eristäminen, kalvomainen EpCAM-proteiinin (vihreä) värjättiin käyttämällä Alexa Fluor® 488 vuohen anti-hiiri-IgG. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittaviivat 10 pm.

lisätä erotuskykyä ja morfologinen ulkonäkö eri 3D pallosia, suoritimme konfokaalimikroskopia Solujen lokalisoinnin epiteelisolujen adheesiomolekyyli EpCAM ja nukleiini- värjäys DAPI (kuva 1B). Niinpä Caco-2-pallosia selvästi näkyvissä sekavaa ytimet ja yleinen kompakti rakenne siirtomaa keskusten ne näyttivät tiheään täynnä, on siis se luokitellaan ”massa”. Kaikissa muissa solulinjoissa konfokaali kuvantamisen validoitu niiden alkuperäisen luokittelun faasikontrastimikroskopiassa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että solulinjat hyvin erilaista 2D morfologit (ts COLO-205 ja LOVO) näytteillä samanlainen morfologioita vuonna lrECM ja

päinvastoin

.

Sferoidiviljelmiä Morfologia ei korreloi muuttavien, Invasive tai lisääntymiskyvyn CRC solulinjojen

kun olemme määritelleet kaksi erilaista pallomainen morfologiat lrECM viljeltyjen CRC solulinjat, eli ”massa” tai ”rypäleiden kaltainen”, olimme kiinnostuneita jos tämä havainto liittyi eri cellular ominaisuuksia kannalta muuttunut pahanlaatuinen potentiaalia. Tässä yhteydessä on huomionarvoista, että kaikki tutkitut CRC solulinjoissa ”rypäleiden kaltainen” morfologia johdettu metastaattinen soluista, kun taas kaikki CRC solulinjoissa ”massa” sferoidiviljelmiä morfologia vakiinnutettiin primaarikasvaimen kudoksesta (Fisherin tarkka testi, p = 0,028) (taulukko 1).

ensin solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Mitään merkittäviä eroja solujen elinkelpoisuuden solujen välillä ”massa” fenotyyppi verrattuna soluihin ”rypäleen kaltainen” fenotyyppi tuli ilmeiseksi. Mielenkiintoista, kun verrataan elinkelpoisuutta, leviämisen ja apoptoosin kasvavien solujen kaksiulotteisesti kudosviljelymuoviin (2D) kanssa lrECM 3D-top määrityksen, löysimme merkittävä lasku solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymistä alle lrECM 3D olosuhteissa (kuvio 2A ja B ). Sitä vastoin mitään eroa tuli selväksi, kun määrällisesti apoptoottisia soluja 2D- ja lrECM 3D kulttuuri järjestelmät (kuva 2 C).

Soluja viljellään 2D- tai 3D-olosuhteissa. A) Solujen elinkelpoisuus mitattiin 48 tuntia myöhemmin käyttäen MTT-määritystä. Arvot edustavat keskiarvoa absorbanssi 540 nm ± SD kolmen rinnakkaisen. Valkoiset pylväät edustavat soluja viljeltiin muovia (2D); mustat palkit soluja viljelty lrECM (3D). Kaksisuuntainen

P

-arvot laskettiin Mann-Whitney-U-testiä (** tarkoittaa

P

-arvo 0,001; ns = ei merkitsevä). B) Solujen lisääntyminen kvantitoitiin prosenttiosuus lasketaan solujen BrdU ja kokonaismäärä DAPI-positiivisten solujen määrä kenttää kohden (vähintään kolme satunnaisesti valittua kenttää per peitelasi). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta rinnakkaista. Valkoiset pylväät edustavat soluja viljeltiin muovia (2D); mustat palkit soluja viljelty lrECM (3D). Kaksisuuntainen

P

-arvot laskettiin pariksi t-testi (* osoittaa

P

-arvo 0,05; ns = ei merkitsevä). C) prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin suhteena DAPI-positiivisten solujen kanssa, hajanainen ytimet ja kaikki DAPI-positiivisia soluja. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta replicates.White pylväät edustavat soluja viljeltiin muovia (2D); mustat palkit soluja viljelty lrECM (3D). Kaksisuuntainen

P

-arvot laskettiin pariksi t-testiä (ns = ei merkitsevä). D) siirtyminen CRC solulinjojen mittaamaan aidan määritystä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Valkoiset pylväät edustavat solulinjoja luokiteltu massa tyyppi; mustat palkit rypäleen kaltainen luokan.

Mukaan morfologiset tyyppisiä havaittu lrECM 3D kulttuureissa, selvitimme muuttavien ja invasiivisia kapasiteetti CRC solulinjoissa. Käyttämällä aita määritystä tutkia muuttoliikkeen ja Boyden kammion määritys päällystetty matrigeelin määrällisesti hyökkäystä, nämä kokeet eivät paljastaneet mitään ilmeisiä eroja muuttavia tai invasiivisen kapasiteettia, kun verrataan ”massa” ja ”rypäleiden kaltainen” CRC solulinjoja (kuvio 2D ja taulukko 2). Siten korrelaatio invasiivisuus ja morfologisia tyyppi tuli ei ole ilmeinen.

Gene Expression on muuttunut lrECM 3D ”On-top” Viljelty CRC Cells

Havainto, että CRC solulinjat ei ainoastaan ​​muodosta tyypillinen rakeita lrECM 3D vaan myös näytteille laski lisääntymistä lrECM, viittaa yleisesti eroa geeniekspressiotasot 2D- ja lrECM 3D kulttuureissa. Tunnistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien verrattaessa 2D- ja lrECM 3D viljellyt solut, tutkimme transcriptome solujen kasvuolosuhteita 2D- ja lrECM 3D-olosuhteissa käyttämällä Agilent Human 8 × 60 K High Density Oligonukleotidi Microarray alustalla. Näin ollen neljä toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin jossa SW-480, HT-29, DLD-1, LOVO, CACO-2, COLO-205 ja COLO-206F-soluja viljellään 2D- tai lrECM 3D olosuhteissa, vastaavasti. Kaikkiaan 49 näytettä 7 eri solulinjoista analysoitiin, 25 saadut 2D ja 24 lrECM 3D kulttuureista. Ensin suoritetaan hierarkkinen klusterianalyysin viljeltyjen solujen 2D- tai lrECM 3D-olosuhteissa. Kuten kuviossa 3A on esitetty, kukin solulinja osoitti tunnusomaisen transcriptome profiilia, joka on riippumaton soluviljelmän menetelmällä. Kuitenkin lukuun ottamatta HT-29 ja LOVO kussakin solulinjassa klusterin, 2D vs. lrECM 3D viljelyolosuhteet erottuivat selvästi, mikä osoittaa eri geenien 2D- ja lrECM 3D kulttuureissa. Myöhemmät analyysi paljasti, että 225-geenit ilmentyvät merkittävästi eri tasoilla, kun verrataan soluihin yllä 2D ja lrECM 3D-viljelmät (kuvio 3B). Pathway analyysin avulla GeneSpring GX 10.5 ohjelmisto tunnistaa 14 säädellään eri tavalla geenejä, joiden tiedetään olevan vuorovaikutuksessa toistensa kanssa.