Krooninen sairaus

tiivistelmä

YAP on keskeinen osa Hippo signalointireitin ja on keskeisessä asemassa kehitettäessä ja etenemiseen useita syöpätyyppejä, mukaan lukien munasarjasyöpä. Kuitenkin vaikutukset YAP on munasarjasyövän kehittämiseen

in vivo

ja sen loppupään efektoreja jää epävarmaksi. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että vahva YAP ilmentyminen liittyy huono munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. Erityisesti, me osoittivat ensimmäistä kertaa, että korkeat YAP ilmentymistasot korreloivat positiivisesti TEAD4 geenin ilmentymisen, ja niiden co-ilmentyminen oli ennustetyövälineenä markkeri huono munasarjasyöpä selviytymisen. Hyperactivation of YAP muta- viidellä estävä fosforylaatiopaikat (YAP-5SA) kasvoi munasarjasyövän solujen lisääntymistä, vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä, solujen vaeltamiseen ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Sitä vastoin ilmaus määräävän negatiivisen YAP mutantti päinvastaiseksi nämä fenotyypit munasarjasyöpäsoluja sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme ehdotti, että YAP aiheuttamat näitä vaikutuksia edistämällä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon. Siten YAP edistää munasarjasyövän solujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Edelleen korkea YAP ja TEAD4 ilme on ennustetyövälineenä markkeri munasarjasyöpä etenemisen ja potentiaalinen kohde munasarjasyövän hoitoon.

Citation: Xia Y, Chang T, Wang Y, Liu Y, Li W, Li M, et ai. (2014) YAP Edistää munasarjasyöpäsolu kasvaimen kehittymisen ja on osoitus huono ennuste for munasarjasyöpä Potilaat. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10,1371 /journal.pone.0091770

Editor: Hongmei Wang, Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia, Kiina

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 14 helmikuu 2014; Julkaistu: 12 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Xia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (81172473), National Basic Research Program of China (2011CB944504, 2012CB944403), ja tieteellinen perustutkimus rahoitus Zhejiangin yliopistossa (2011QN81001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpiä (EOCs) muodostavat enemmistön pahanlaatuisia munasarjojen kasvaimia aikuisilla naisilla ja on pahin ennuste keskuudessa naisten syöpien perustuu niiden 5 vuoden eloonjäämisluvut. Nämä potilaat esiintyy usein epäspesifisiä lantion tai vatsan oireita. Perinteiset hoidot sisältävät yleensä leikkaus, platina ja Taxol-pohjainen kemoterapioissa, ja sädehoito. Koska ei ole erityisiä oireita ja tehokkaita seulontamenetelmiä, potilaat ovat usein diagnosoitu, kun on edennyt pitkälle ja niiden ennuste on jopa huonompi kuin muiden syöpien.

Hippo reitti on äskettäin löydetty signaalitransduktioreitin. Ydin komponentit Hippo koulutusjakson, kuten MST1 /2, lati, SÄV1, ja YAP, ovat hyvin konservoituneita hedelmistä lentää (

Drosophila

) nisäkkäille [1] – [6]. MST1 /2 aktivoituminen johtaa fosforylaatioon ja aktivointi suorien substraattien LATS1 /2. Aktivoitu LATS1 /2 puolestaan ​​fosforyloivat ja estävät YAP ja TAZ transkriptio koaktivaattoria [7], [8]. YAP edistää solujen lisääntymistä, inhiboi solujen apoptoosia, ja edistää myös epidermaalisen-mesenkymaalitransitioon (EMT) [9] – [12]. YAP liittyy läheisesti tuumorigeneesiä kriittinen transkription koaktivaattori, että Hippo kautta.

useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien ErbB4, RUNX2, TEAD perheenjäseniä, ja p73, on havaittu olevan YAP alavirran kohdegeenejä [ ,,,0],13] – [16]. Koska se ei ole DNA: ta sitova domeeni, YAP sitoutuu C-terminaalisen alueen TEAD sääntelemiseksi alavirran geenien ”transkription ja translaation. Zhao

et al

tunnistettu TEAD perheen transkriptiotekijöiden kuin tehokkain YAP tavoitteet ja TEAD perheenjäsenet olivat tärkeitä kasvua edistävää toimintaa YAP [14], [17] – [21].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että YAP oli hyvin ilmaistu ihmisen munasarjasyövän kudosten ja että korkea YAP aktiivisuus edistänyt leviämisen ja selviytymisen viljeltyjen munasarjasyöpäsoluja [9], [22]. Kuitenkin rooli YAP munasarjasyövän kehittämiseen

in vivo

ja yhdistyksen YAP /TEAD munasarjasyövän elossaololuku ei ole tutkittu perusteellisesti.

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että jatkuva YAP aktivointi indusoi lisääntynyt munasarjasyövän solujen lisääntymistä, vastustuskykyä sisplatiinin aiheuttamaa solujen apoptoosin, kontakti-inhibition menetys, lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja ankkurista riippumaton kasvu sekä

in vitro

ja

in vivo

. Yhdenmukainen nämä tulokset, Huomasimme myös, että korkea YAP ilmentyminen liittyy huono munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. Edelleen TEAD perheenjäsenet olivat myös ilmaistaan ​​munasarjasyövän kudoksissa. Mielenkiintoista, YAP ilmentyminen korreloi positiivisesti TEAD4 ilme ja niiden koekspressoimalla läheisesti liittyy huono munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että YAP on keskeinen munasarjasyövän onkogeenin ja että YAP /TEAD4 co-ekspressio voi olla ennustaja huonoon ennusteeseen ihmisen munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

nude hiiret ksenografteissa ja

in vivo

hoitoja

nude hiiret saatiin Center of Experimental Animals, Zhejiangin yliopistossa.

hiiriä käsiteltiin mukaisesti NIH opas hoito ja käyttö Laboratory Animals, hyväksymä eettinen komitea Zhejiangin yliopistossa. Hiiriä pidettiin lämpötilaltaan ohjattu huoneen kunnon pimeys-valo syklit, syötetään säännöllistä ruokavaliota, ja ylläpidetään edelleen hoidossa laboratorion Animal Unit, Zhejiangin yliopisto, Kiina. Munasarjasyöpäsolulinjassa-istutetaan hiirten examinined päivittäin, ja tapettiin käyttämällä CO2-inhalaatiolla menetelmällä ennen uhrataan. Tutkia vaikutuksia YAP aktiivisuus kasvaimia

in vivo

, stabiilit solulinjat, jotka ekspressoivat YAP-5SA tai vallitsevaa negatiivista YAP viljeltiin ja käyttää indusoimaan kasvaimia istuttamalla 2 x 10

6 solua 100 ul: ssa PBS: ää ihonalaisesti oikeaan vatsan kyljet 4-6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia karvattomia hiiriä. Sen määrittämiseksi, onko YAP on vaikutus Chemo-vastus, A2780CP YAP-5SA-ACk solujen ja kontrollisolujen (2 x 10

6 solua per hiiri kussakin ryhmässä) oli erikseen siirrostettiin (s.c.) nude-hiiriin. Sen jälkeen kasvaimet kasvoivat noin 5 mm halkaisijaltaan, 3,5 mg /kehon paino (kg) /päivä CDDP annettiin (i.p.) että nude-hiiriin kerran viikossa 4 viikon ajan. Kasvaimen kokoa (sekä pituus- että poikkisuunnassa leveydet) mitattiin mittaharpilla.

Tissue array ja IHC-analyysi

Formaliinifiksoidusta ja parafiiniin upotettuja munasarjasyöpä kudoksen array saatiin US Biomax, Inc . (Rockville, MD). Kudos microarray oli immunohistokemiallisesti värjättynä YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 fosforyloitu-YAP (# 4911S, Cell Signaling), TEAD1 (5178-1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, Lifespan Biosciences), TEAD3 (LS -C30406, Käyttöikä Biosciences), ja TEAD4 (ab97460, Abcam). Lisäksi 45 ihmisen munasarjasyöpä yksilöille potilaiden seurantaan ovat patologian osaston, Xijing sairaalan neljännen Military Medical University. Munasarjasyöpä näytteen käytöstä ja tutkimussuunnitelma hyväksyttiin eettisen komitean Xijing Hospital ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Kaikki lopullinen pistemäärä kunkin näytteen (negatiivinen tai positiivinen) pisteytettiin itsenäisesti kaksi patologit ja arvioi lisäämällä pistemäärät voimakkuus ja laajuus värjäystä. Värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), tai 2 (voimakas). Laajuus värjäytyminen pisteytettiin perustuu prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja: 0 (negatiivinen), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), ja 3 (61% -100%). Kukin tapaus lopulta pidetään negatiivisena, jos lopullinen tilanne oli 0 (negatiivinen) tai 1 (heikko positiivinen) ja positiivinen, jos lopputulos oli 2-3 (+) tai 4-5 (voimakas positiivinen).

Cell linjat

Kaikki solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt alun perin ostettu ATCC: ltä. Kaikki soluviljelyaine oli Invitrogen-yhtiöstä. SKOV-3-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, jossa oli 10% FBS: ää. A2780-soluja kasvatettiin DMEM-korkean glukoosin väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniliuosta. OVCAR3 soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jossa oli 0,01 mg /ml insuliinia ja 15% FBS: ää. OVCAR8 soluja kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jossa oli 10% FBS: ää. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 10 yksikköä /ml penisilliiniä ja 10 ng /ml streptomysiiniä. Stabiileja solulinjoja kasvatettiin elatusaineessa ja valitaan käyttämällä eri pitoisuuksia puromysiinin.

Soluproliferaatiomääritys

Kunkin ehdon edellä on kuvattu, soluja viljeltiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla levyillä 2000-soluja /hyvin. Solukasvu määritettiin mittaamalla absorbanssi levylukijalla (Bio-Rad) viljelyn jälkeen 24 tuntia. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kullekin hoitoon.

Western Blot-analyysi

Solu-uutteet, jotka sisältävät 30 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore Corp., Bedford, MA ). Sen jälkeen, kun koettimena primaarisilla vasta-aineilla, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-kytkettyä anti-kani-vasta-aineita (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) ja sitten pestiin. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttämällä Enhanced Chemiluminescence Detection Kit (Amersham). Ensisijainen vasta-aineet olivat: YAP (# 4912), S127 fosforyloitu-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), pilkottiin kaspaasi-3 (# 9664), β-aktiini (# AC40), E-kadheriinin (# 3195) , Slug (# 3195), ja Snail (# 3895) Cell Signaling. TEAD1 (5178-1) vasta-aine oli peräisin Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) ja TEAD3 (LS-C30406) vasta-aineet olivat peräisin Lifespan Biosciences. TEAD4 (ab97460) vasta-aine oli peräisin Abcam.

Flat pesäke ja pehmeä agar pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksissä

Solut maljattiin kolmena rinnakkaisena 6-kuoppalevyillä 14 päivän tasainen pesäkemuodostusta . Pehmeää agar määrityksessä, 2000 solut maljattiin täydelliseen alustaan ​​plus 0,6% agar kolmena rinnakkaisena 6-kuoppaisille levyille. Väliaine korvattiin 48 tunnin välein ja näkyvä pesäkkeet laskettiin valomikroskoopilla jälkeen 21 päivää.

Scratch-määritys

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa estää proliferaatiota . 12 tunnin kuluttua solut naarmuuntunut käyttäen 200 ui pipetin kärjen. Sitten kuvat 10 naarmuja solulinjaa kohden hankittiin 0 h, 12 h, ja 24 h.

apoptoosimäärityksessä

Soluja viljeltiin väliaineessa, jossa oli eri pitoisuuksia sisplatiinia 48 tunnin ajan. Sitten solut kerättiin kanssa apoptoosin havaitseminen kit (BD Biosciences, 559763) virtaussytometrialla ja Western blot -analyysiin.

In vitro

ja

in vivo

metastaattisen malli ja bioluminescent kuvantaminen

24 kuopan transwell levyn (8-um huokoskoko, Corning, USA) käytettiin määrittämään migraation ja invasiivisia kykyä kunkin solulinjan. Sillä siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä, 5 x 10

4-soluja ympättiin yläkammiossa joka oli vuorattu ei-päällystetty kalvo. Alakammioissa olivat kaikki lisättiin 500 ul viljelyalustaan ​​20% FBS. Keskiarvot kolminkertaisina määrityksiä kullekin koetilalle määritettiin.

in vivo

etäpesäkkeiden määrityksiä, HO8910 PM-YAP △ C stabiili soluissa, jotka on infektoitu lusiferase reportteriplasmidi ja ruiskutetaan häntälaskimoiden of 4 viikkoa naisten nollahiiriä. Kahden viikon kuluttua eläimet kuvattiin viikoittain eläimen kuvantamisen kone käyttämällä tehostettua charge coupled device (CCD) kamera järjestelmä. Sillä

in vivo

bioluminesenssin kuvantamiseen, hiiret nukutettiin käyttäen 1-2% isofluoraanilla /ilman seoksen ja injektoidaan yhdellä (ip) annoksella 100 mg /kg lusiferiini (Promega, WI) ja bioluminenssi havaittiin jossa IVIS 100 Imaging System (Xenogen).

lisäksi bioluminisenssimääri- kuvantamisen, hiiret toteutetaan 60 päivän kuluttua munasarjasyöpäsolu-injektio tutkimiseksi istuttamisen jälkeen elin etäpesäkkeitä.

tilastollinen analyysi

45 potilaalla on täydellinen immunohistokemiallista ja tulos data, tautikohtaisia ​​5 vuoden pysyvyys arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin ryhmien välillä käyttäen log-rank testejä. Korrelaatioanalyysin täydensi Chi-square testi. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan tuloksia jokaisen mitatun muuttujan valvonnan tulosten. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä. Kaikki analyysit tehtiin käyttäen SPSS (versio 11.0).

Tulokset

YAP merkittävästi yliaktiivista ihmisen munasarjasyövän kudosten ja korkea YAP ilmaisun ennustaa huono potilaan ennusteeseen

tutkimiseksi jos YAP oli yläreguloituja ihmisen munasarjasyövän, koko ja fosforyloidun YAP (pYAP) havaittiin immunohistokemiallinen (IHC) ja objektilasit arvioitiin perustuvat soluliman ja ydinvoiman YAP värjäys tasoilla. Nämä IHC osat luokiteltiin joilla on joko negatiivinen, matala tai korkea värjäys. Kontrollina, 10 normaalin munasarjan kudosleikkeet immunohistokemiallisesti värjättiin YAP. Kuitenkin YAP ilmentymistä ei havaittu näissä kohdissa (kuva 1A).

V: immunohistokemia tulokset YAP ja pYAP ilmentymistä normaaleissa ihmisen munasarjan kudosten ja neljä alatyyppiä munasarjasyöpä kudosta. Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä. Suurennukset 40 x ja 100 x näkyvät. Asteikko bar = 100 uM kaikille paneelit. B: Kaplan-Meier-analyysi assosiaatioita YAP ilme, lokalisointi, ja fosforylaatio ja munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. P-arvot ovat log-rank testejä.

YAP ilmaisun ja solunosasijaintia vaihtelivat eri kasvaimen tyypit (kuvio 1A). Ydinvoiman YAP tasot havaittiin 22,64%: n 106 munasarjakasvain analysoidut näytteet, jotka sisälsivät 9 metastaattinen munasarjasyöpä näytteitä, kun taas pYAP havaittiin 11,88% kasvaimen näytteistä. 24 näytettä vahvojen YAP IHC signaaleja, 13 olivat myös vahvasti positiivisia pYAP. Niistä neljä päätyyppiä munasarjojen syöpiä, YAP oli vahvasti ilmaistu serous ja endomet- cancinoma näytettä (86,67%, N = 15).

Voit selvittää YAP ja pYAP jakaumat liittyi munasarjasyöpä elossaololuku, YAP ja pYAP lokalisointi ja ekspressiotasoja arvioitiin 45 munasarjasyövän patologinen kohdat. Näitä tuloksia käytettiin Kaplan-Meier-analyysi arvioida tautikohtaisia ​​selviytymistä. Sekä sytoplasminen YAP (cYAP) ja pYAP yksinään ei ole liittynyt huonoon ennusteeseen ihmisen munasarjasyöpä. Kuitenkin, kun yhteensä YAP ekspressiotasoja otettiin huomioon, nämä liittyivät merkittävästi huonoon ennusteeseen (kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, korkeat YAP ekspressiotasot sijaan sen subsellulaarisista jakaumat olivat yhteydessä munasarjasyöpään elossaololuku.

YAP edistää munasarjasyövän solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen

Lisäksi ihmisen munasarjasyöpä näytteitä, me määritettiin myös endogeeninen YAP ilmentyminen 11 viljellyissä munasarjasyövän solulinjoissa. Western blotting tulokset osoittivat, että YAP oli hyvin ilmaistu useimmissa näistä solulinjoista, ja heikoin ilmentymistä A2780-soluissa ja korkein ekspression OVCAR8 soluissa (kuvio 2A). Siten nämä kaksi solulinjaa käytettiin seuraavissa kokeissa.

: Western-blottaus tuloksia endogeenisen YAP ilmentymistä 11 munasarjasyövän solulinjoissa. B: Kaavio keskeiset toiminnalliset rakenteellisia domeeneja ja fosforylaatiopaikat ihmisen YAP (täyspitkä ja C-terminaali poistetaan, YAP-ACk, lomakkeet). C: Western blot tulokset ilmentymisen FLAG-merkitty YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk in vakaa solulinjoissa. D: kasvukäyrät soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti YAP-5SA (ylempi paneeli) ja YAP-5SA-ACk (alempi paneeli) ja niiden valvonta-soluihin 7 päivän viljelyjakson aikana. E: Images ja määrälliset tulokset litteä levy pesäkemuodostusta määrityksiä. Solut, jotka ilmensivät YAP-5SA tai YAP-5SA-ACk ja niiden valvonta-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä 2 viikkoa. F: Kuvat ja määrälliset tulokset pesäkkeitä kasvatettiin pehmeässä agarissa. Solut, jotka ilmensivät YAP-5SA tai YAP-5SA-ACk ja niiden valvonta-solut ympättiin pehmeässä agarissa 3 viikkoa. G: Kuvat ja määrälliset tulokset vierassiirrännäisille kasvatettu nude-hiirissä. Hiiret injektoitiin subkutaanisti YAP-5SA ilmentävät ja kontrollisoluja. Jokainen piste on keskiarvo 3 kokeen. Virhe pylväät edustavat S.D. ’S; n = 5. Tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna kontrollina määritetty Studentin t-testi on merkitty * (P 0,05) tai ** (P 0,01).

Tutkiakseen roolin for YAP munasarjasyövän solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden, me syntyy A2780 ja OVCAR8 stabiileja solulinjoja, jotka yli-ilmentynyt konstitutiivisesti aktiivinen YAP (YAP viisi LATS1 /2 fosforylaatiokohdan mutaatiot, YAP-5SA) ja hallitseva negatiivinen YAP (YAP-5SA kanssa C- terminaali transaktivaatiodomeenin poistetaan, YAP-5SA-ACk, kuvio 2B-C). Solujen kasvukäyrät osoitti, että YAP-5SA ilmentävien solujen oli suurempi proliferatiivinen aktiivisuus kuin kontrollit (kuvio 2D, yläpaneeli). Sen sijaan YAP-5SA-ACk ilmentävien OVCAR8 soluilla oli vähentynyt proliferaatio nopeudella suhteessa kontrolliin soluja (kuvio 2D, alapaneeli).

Seuraavaksi tutkimme jos YAP toiminta vaikuttaa solujen transformaatio ja muuttoliike munasarjasyöpäsoluja käyttämällä levy pesäkemuodostusta. Nämä tulokset osoittivat, että konstitutiivisesti aktiivinen YAP-5SA edistänyt klooni muodostumista, mutta hallitseva negatiivinen YAP-5SA-ACk tukahdutetaan klooni muodostumiseen (kuvio 2E). Lisäksi, käytimme pehmeä agar sen määrittämiseksi kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun, toinen indikaattori tumourigenicity. Kuten kuviossa 2F, YAP aktiivisuus korreloi positiivisesti munasarjasyöpäsoluja siirtomaa kykyä muodostaa pehmeässä agarissa.

YAP edistää munasarjasyöpäsoluja lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen

in vivo

Aiemmat tutkimukset eivät tutkia, YAP voisi parantaa kasvaimen kehittymisen

in vivo

. Niinpä injektoidaan subkutaanisesti YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen, samoin kuin niiden ohjaus soluja, tulee 4 viikon ikäisiä nude-hiirissä. 3 viikon kuluttua, kasvaimet, jotka ovat peräisin YAP-5SA stabiili soluissa olivat merkittävästi suurempia kuin kontrolleihin (kuvio 2G). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​meidän

in vitro

määrityksissä.

YAP lisää munasarjasyövän solulinjoissa sietävät Sisplatiini ja Taxol

Sisplatiini ja taksolin ovat ensisijainen syöpälääkkeiden käytetään munasarjasyövän hoitoon. Niinpä pyrittiin määrittämään jos YAP toiminta vaikuttaa munasarjasyövän solujen herkkyys Cisplatin ja Taxol. Kuten kuviossa 3A on esitetty, YAP-5SA ilmentävät solut olivat enemmän resistenttejä sekä näiden lääkkeiden kuin oli kontrollisolut eri annoksilla. Sen sijaan, YAP-5SA-ACk ilmentävät solut olivat herkempiä molemmat lääkkeet kuin oli kontrollisoluihin. Apoptoottisten solujen markkereita pilkotaan PARP ja pilkottiin kaspaasi 3 havaittiin A2780 kontrollisoluissa jälkeen sisplatiini hoidon annoksesta riippuvalla tavalla (0-100 uM). Kuitenkin lisääntynyt ilmaisuja näiden apoptoosin merkkiaineiden ollut yhtä suurta vastaavalla tavalla käsitelty YAP-5SA ilmentävien solujen (kuvio 3B).

V: elinkelpoisuus YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen hoidon jälkeen paklitakselia tai CDDP arvioituna MTT: llä. B: Western blotting tulokset apoptoosin markkereita halkaistut kaspaasi 3 ja PARP YAP-5SA ilmentävien ja ohjaus solujen käsittelyn jälkeen ilmoitetun annoksilla CDDP 48 tuntia. C: Virtaussytometria tulokset apoptoosin A2780CP solujen kanssa tai ilman YAP-5SA-ACk transfektio ja käsittelyn jälkeen eri annoksilla CDDP: ssa 48 tuntia. D: Western blotting tulokset halkaistut kaspaasi 3 ja PARP YAP-5SA-ACk ilmentävien ja ohjaus solujen käsittelyn jälkeen ilmoitetun annoksilla CDDP 48 tuntia. F-G: Kuvat ja määrälliset tulokset

in vivo

tuumorigeenistä kapasiteettia A2780CP solujen kanssa tai ilman YAP-5SA-ACk ilme. Nude-hiiriin injektoitiin CDDP kautta kaudaalilaskimoon kerran viikossa neljän viikon ajan tuumoriksenografteja saavutti halkaisija on 5 mm. H: IHC tulokset leviämisen merkki Ki67 päälle osoitettuun kasvainkudossektioista. Asteikko bar = 100 uM.

Virtaussytometria tulokset osoittivat, että aiemmin raportoitu sisplatiini-resistenttejä munasarjasyövän solulinja (A2780CP) oli todellakin resistentti sisplatiinihoitoon pienillä annoksilla (10-40 uM). Kuitenkin YAP-5SA-ACk ilmentymisen näissä soluissa aiheutti lisääntymisen solujen apoptoosin sisplatiinin jälkeen hoitoa kaikilla tutkituilla annoksilla (kuvio 3C-D). Lisäksi YAP-5SA-ACk ilmentävien A2780CP solut osoittivat huomattavasti lisääntyneen ilmentymisen pilkotun PARP ja kaspaasi 3 kuin teki kontrollisolut jälkeen sisplatiinihoitoon (kuvio 3E).

Voit selvittää YAP siirrettävä lääkeresistenssin munasarjasyöpäsoluja

in vivo

, me injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin kanssa A2780CP soluja, jotka pysyvästi ilmensivät YAP-5SA-ACk ja ohjaus soluja. 1 viikon kuluttua solujen injektion, hiiriä hoidettiin sisplatiinilla mukaan caudal turhaan injektio kolmen päivän välein. Kasvainten koot mitattiin 5 viikkoa sen jälkeen, kun munasarjasyöpäsolujen injektioita. Verrattuna kontrolleihin, kasvaimia, jotka olivat peräisin YAP-5SA-ACk ilmentävät solut olivat pienempiä kuin ne, jotka johdetaan ohjaus soluista (kuvio 3F-G). Solujen lisääntyminen markkeri Ki67 ilme oli heikompi YAP-5SA-ACk ilmentäviä soluja kuin verrokeilla soluissa (kuvio 3H).

YAP parantaa muuttoliikettä ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua munasarjasyöpäsoluja

seuraavaksi tutkittiin vaikutukset YAP aktiivisuus munasarjasyövän solujen vaeltamiseen. Molemmissa tyhjästä määrityksissä (kuvio 4A) ja transwell määritykset (kuvio 4B), YAP-5SA ilmentävien solujen siirtynyt nopeammin, kun taas YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen siirtynyt hitaammin kuin kontrolli solut.

. Haavan paranemista määritys muuttoa YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen viljelyn jälkeen 12 ja 24 tuntia. Asteikko bar = 100 uM kaikille paneelit. B. TranswellTM määritykset muuttoa YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen. **, P 0,01. C. Bioluminesenssi kuvantamisen jotka osoittavat keuhkometastaasitestissä valvonta- ja YAP-5SA-ACk ilmentävien HO8910PM solut sen jälkeen, kun ne ruiskutetaan häntälaskimoiden nude-hiirten. D. HE ja IHC värjäys keuhkometastaasitestissä sivustoja esitetään C. E-F: Kuvat ja tilastollinen analyysi tulokset maksan etäpesäke mukaan kaudaalilaskimoon pistetään HO8910 PM soluja. G: HE ja YAP IHC tulokset maksan etäpesäke sivustoja esitetään EH Western blot tulokset EMT merkki ilmaisuja viljellyissä YAP-5SA ja YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen ja

in vivo

ksenografteissa johdettu näistä soluista.

lisäksi teimme

in vivo

kokeiluja testata YAP aktiivisuutta tarvitaan munasarjasyöpä etäpesäke. Loimme YAP-5SA-ΔC- ja lusiferaasi-ilmentävien stabiilien solulinjojen avulla HO8910-PM-solut, ihmisen munasarjasyövän solulinja, joilla on korkea metastaattinen kapasiteetti, ja injektoitiin nämä solut nude-hiiriin kautta häntälaskimoiden (5 x 10

6 solua /hiiri). Kahden viikon kuluttua injektion, hiiret kuvattiin etäpesäkkeiden käyttäen eläimen kuvantamisjärjestelmä. Kuten on esitetty kuviossa 4C-D, nämä ksenografteissa johdettu YAP-5SA-ACk-ilmentävät solut olivat pienempiä kuin ne, jotka on johdettu kontrollisoluihin. IHC tulokset osoittivat, että ksenografteista olivat positiivisia CA125 ja YAP, jotka vahvistivat alkunsa injektoidusta munasarjasyöpä soluja. Huomattavasti, istuttamisen jälkeen etäpesäkkeitä havaittiin maksa kaikki 10 hiirtä, joihin injektoitiin kontrolli HO8910 soluja, mutta vain 2 10 hiiriä, joihin injektoitiin YAP-5SA-ACk-ilmentäviä soluja (kuvio 4E). Lisäksi YAP-5SA-ACk ilmentävien solujen muodostuu huomattavasti vähemmän etäpesäkenystyröiden (YAP-positiivinen) kuin kontrolli solujen maksa ruiskutetaan hiirten (kuvio 4F-G). Nämä tulokset viittaavat siihen, vähentynyt YAP toiminta hidastuu munasarjasyöpäsoluja etäpesäkkeiden

in vivo

.

epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ajatellaan olevan tärkeä prosessi aikana hankinta nämä ominaisuudet vaaditaan kasvaimen etäpesäke. Sekä viljellyt munasarjasyöpäsoluja ja niitä on eristetty

in vivo

, YAP-5SA edistää ilmentymistä EMT markkerin Snail ja esti ekspression epiteelin markkerin E-kadheriinin. Kuitenkin YAP-5SA-ACk oli vastakkaiset vaikutukset (kuvio 4H).

korkea ydin- YAP ja TAED4 arvot liittyvät huono ihmisen munasarjasyövän ennuste

YAP ei ole DNA: ta sitovan verkkotunnuksen. Se toimii transkription koaktivaattoria sitomalla TEAD perheen transkriptiotekijöiden (TEAD1-4). Kuitenkin, se ei ole tutkittu, jos TEADs mitään merkitystä munasarjasyövän ennustetta. Näin ollen tutkimme TEAD1-4 ilmentymistä ihmisen munasarjasyövän näytteitä. Ilmaisut on 4 alatyyppejä TEAD proteiinit tutkittiin yksittäin munasarjasyöpäsolu kudos microarray IHC (kuvio 5A). Korrelaatioanalyysin tulokset osoittivat, että YAP ja pYAP positiivisesti korreloi TEAD1-4 ilmaisun, ja ne parhaiten korreloi TEAD4 ilmentymistä (kuvio 5B) .an yhdistys analyysillä käyttäen 45 munasarjasyöpä potilaan näytteet tehtiin jota sijoittui Kaplan-Meier-eloonjäämisennusteet . Nämä tulokset osoittivat, että YAP ilmentyminen korreloi positiivisesti TEAD4 ilmentymistä (kuvio 5C, P = 0,0284).

. IHC-tulokset TEADs ilmentymistä ihmisen munasarjasyövän kudoksiin. Asteikko bar = 100 uM. B. Yhdistykset välillä YAP /pYAP ilmaisuja ja TEAD ilmaisuja munasarjasyöpäsolu kudoksen array. C. Yhdistykset välillä YAP ja TEAD4 ilmaisuja 45 munasarjasyövän näytteet paremmuusjärjestykseen Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet. D. YAP ja TEAD4 co-ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen ihmisen munasarjasyöpä. Korkea TEAD ilmaisu vs. alhainen TEAD4 lauseke (vasemmalla), korkea YAP ilme yhdistettynä korkeaan TEAD4 ilme verrattuna muihin ryhmiin (keskellä), korkea YAP ilme ja korkea TEAD4 ilme yhdistettynä korkeaan β-Catanin verrattuna muihin ryhmiin (oikealla).

Tutkimme lisäksi TEAD4 yksin saattaa liittyä munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. Kaplan-Meier ja vertailuja tautikohtaisia ​​selviytymisen osoitti, että korkea TEAD4 värjäytymisen intensiteetti oli yhteydessä huonoon elossaololuku (kuvio 5D, vasen paneeli). Selviytymisen potilaiden sekä korkea YAP ja korkea TEAD4 ilmentyminen oli merkittävästi huonompi kuin muissa luokissa (kuvio 5D, keskimmäinen paneeli; P = 0,002). Lisäksi Kaplan-Meier-estimaatti yhdistettyjen korkean YAP /TEAD4 ja EMT merkki β-Catanin ilme oli myös tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5D, oikea paneeli). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että YAP ja TEAD4 oli kaksi merkittävää itsenäistä markkereita köyhien potilaiden selviytymisen ja niiden yhteenlaskettu arviointi voisi olla vahva itsenäinen ennustaja tautikohtaisia ​​elossaololuku munasarjasyöpä potilaille.

Keskustelu

YAP on pidetty mahdollisena onkogeenin eri subsellulaarisista lokalisaation säätelee sen alkupään geenien Hippo kautta. Lisääntynyt YAP ilmaisun ja ydinvoiman lokalisointi on havaittu useita ihmisen syövissä, mukaan lukien maksa, paksusuoli, munasarja, ja keuhkojen syövät [23] – [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että YAP proteiinin tasot olivat korkeita useita munasarjasyövän solulinjoissa. Vielä tärkeämpää on, YAP oli hyvin ilmaistu munasarjasyövän näytteissä, mutta ei normaalissa munasarjakudoksen, joka ehdotti, että YAP ilmentyminen liittyy suoraan munasarjasyöpään kehittämiseen tai etenemiseen.

Aikaisemmat tutkimukset ehdotti myös, että YAP voisi toimia onkogeenilla munasarjasyövän [31]. Kuitenkaan mikään näistä tutkimuksista tutkittiin mahdollisia yhdistysten välillä YAP /TEAD ekspressiotasot ja munasarjasyöpä potilaiden selviytymistä. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että korkeat YAP ilmentyminen munasarjakasvaimia liittyi lyhyempi tautikohtaisiin eloonjäämisen munasarjasyöpä potilaille, ja että alhainen YAP ilmentymistä ovarioiden liittyi pidemmän tautikohtaisiin selviytymisen näille potilaille. Lisäksi löysimme ensimmäistä kertaa, että TEAD4 suora sitomiskumppanin YAP, myös tiiviisti potilaan selviytymistä. Yhteistyössä ilmentäminen YAP ja TEAD4 munasarjasyövän kudoksissa oli vieläkin dramaattisesti yhteydessä huonoon potilaan selviytymistä. Näin ollen, korkea YAP /TEAD4 tasoja voisi olla ennustaja määrittämiseksi munasarjasyöpä maligniteetti tasoilla ja arvioimiseksi ennustetta näillä potilailla.

Ensisijainen munasarjan epiteelin syövät hoidetaan yleensä platina-pohjainen lääkkeet, kuten sisplatiini yhdistettynä taksoli. Näitä lääkkeitä annetaan joko suonensisäisesti tai vatsaonteloon. Apoptoottista ja antiapoptooppinen signaalit ovat kaksi aspektia cell cross-talk välillä solujen eloonjäämistä ja solukuoleman polkuja, jotka määrittävät kohtalot solujen vastineensa eksogeenisen olosuhteisiin. Kasvainten, lääkeaineen indusoiman apoptoosin säätelevät ei ainoastaan ​​upregulation apoptoottisten tekijöiden tai tuumorisuppressorien, mutta myös modulaatio solujen eloonjäämistä tekijöistä. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että ylä- ja alas-säätely YAP toiminta voisi moduloida leviämisen, pesäkkeiden muodostumisen ja muuttoliike valmiudet ja vastus kemoterapia-aineiden munasarjasyövän solulinjoissa. Konstitutiivisesti aktiivinen YAP mutantti lisäsi vastustuskykyä lääkkeen aiheuttama apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, kun taas hallitsevalla negatiivisella YAP palautettu lääke herkkyyttä Cisplatin kestävä munasarjasyöpäsoluja.

Tarkat mekanismit, joilla YAP lisää lääkeresistenssin jää epäselväksi . Useat tutkimukset keskittyivät PI3K /Akt koulutusjakson kemiallis-resistenssi munasarjojen syöpien ja osoittivat, että sisplatiinia voisi upregulate p53 ja aiheuttavat apoptoosia näissä syöpäsoluissa ilmentymisen jälkeen hallitsevan negatiivisia AKT, joka ehdotti, että sisplatiini välittämä p53 säätelyä vastustivat AKT. PI3K /AKT-reitin voi myös osallistua YAP välittämän lääkeresistenssi, koska se on selvästi osoitettu, että YAP oli mukana rajat puhua PI3K polkuja ja helpottanut AKT aktivointi muissa solutyypeissä [32], [33]. Aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että hyperactivation että PI3K koulutusjakso käynnistettiin munasarjasyövän kehitys hiirimalleissa. Vuorovaikutus näiden kahden reitin on edelleen tutkittu munasarjasyöpäsoluja.

On oletettu, että syöpäsolut menettävät epiteelin ominaisuudet ja hankkia tietyt mesenkymaaliset ominaisuuksia, jotka edistävät solun ulkopuolelle invaasiota ja etäpesäkkeiden käytettäessä EMT- kuten prosessi. Epiteelin markkereita, jotka alassäädetty tämän siirtymäkauden aikana kuuluvat E-kadheriinin, sytokeratiineja, ZO-1 ja muut. Hippo signalointireitin komponentteja tarvitaan E-kadheriinin riippuvaisen kontakti lisäkasvun estäminen.