Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sulfatide on glykosfingolipidikertymäsairaus tiedetään olevan vuorovaikutuksessa useiden solunulkoisen matriksin proteiinien, kuten tenaskiini-C, joka on yli-ilmentynyt useissa syöpätyyppejä mukaan lukien paksusuolen. Ottaen huomioon vähäistä menestystä kemoterapian kolorektaalisyövässä ja korkea myrkyllisyys doksorubisiinia (DOX), joka on sulfatide sisältävä liposomi (SCL) kapselointi lähestymistapa otettiin voittaa nämä esteet. Tässä tutkimuksessa arvioitiin in vitro sytotoksisuutta, biologinen jakautuminen, terapeuttinen teho ja systeeminen toksisuus in vivo sulfatide sisältävien liposomaalinen doksorubisiini (SCL-DOX) käyttäen ihmisen koolonadenokarsinoomasolulinjalla HT-29 vierassiirrettä kuin kokeellisessa mallissa. In vitro, SCL-DOX osoitettiin joutuvan ytimet ja näytetään pitkäaikainen säilyttäminen verrattuna vapaan DOX. Käyttää tätä nanodrug jakelujärjestelmä antaa DOX hoitoon kasvaimen kantavien hiirten tuotti paljon parantunut terapeuttinen teho tuumorin kasvun tukahduttaminen ja laajennettu selviytymistä toisin kuin vapaan lääkkeen. Lisäksi hoito kasvaimen kantavien hiirten kanssa SCL-DOX johti alhaisempiin DOX imeytymistä pääasiallinen sivustoja myrkyllisyyden vapaan lääkkeen, eli sydämen ja ihon sekä vähemmän myelosuppressiota ja vähentynyt kardiotoksisuuden. Tällaisia ​​luonnollisia lipidejä ohjattu nanodrug jakelujärjestelmät voivat edustaa uutta strategiaa kehittää tehokkaita syövän vastaisia ​​kemoterapeuttisten kohdistaminen kasvaimeen microenvironment sekä primaarikasvaimen ja micrometastases.

Citation: Lin J, Yu Y, Shigdar S, Fang DZ Du JR, Wei MQ, et al. (2012) Enhanced Kasvaintenvastainen Tehoa ja alennetulla systeeminen toksisuus Sulfatide sisältävien Nanoliposomal Doksorubisiini vuonna ksenograftimallia paksusuolisyövän. PLoS ONE 7 (11): e49277. doi: 10,1371 /journal.pone.0049277

Editor: Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, Belgia

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 08 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Health ja Medical Research Council (# 479505); Australia Intian strateginen Research Fund, (ST01-0013). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1], [2], jopa 25%: lla potilaista, joilla oli etäpesäkkeitä. Huolimatta kirurgian ja kemoterapia, monet näistä potilaista lopulta kuolevat metastaattisen sairauksiin. Adjuvantti hoitoja, kuten sädehoito ja kemoterapia, on suunniteltu kohdentamaan jäljellä syöpäsoluja. Vaiheessa III potilaalla on peräsuolen syöpä, kemoterapia edelleen tärkein hoito strategia [3]. Kuitenkin menestys näiden hoitojen rajoittaa syntyminen hoidon vastustuskykyisten syöpäsoluja sekä annosta rajoittavat toksisuudet [4]. Viime vuosikymmeninä nanomittakaavan terapeuttisia järjestelmiä on tullut uusia hoitomuodot syövän torjuntaa [4]. Nanohiukkasten formulaatiot perinteisen vapaan syöpälääkkeiden voi olla parantunut farmakokinetiikka ja biologinen jakautuminen profiilit, parantaa tuumorin vastaista tehokkuutta, sekä vähennetään myrkyllisyys terveitä kudoksia.

Liposomalia huumeet olivat ensimmäinen hyväksytty ja laajalti käytetty niin nanolääketieteen hoitoon syövät [5], [6]. Liposomit ovat mikroskooppisia fosfolipidivesikkelejä kanssa kaksikerroksisten kalvo rakenne. Prekliiniset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että farmakokineettiset profiilit, sekä kohdentaminen erityispiirteet, Liposomien voidaan ohjata ja muunnettu vähentämään sivuvaikutuksia kapseloitujen lääkkeiden ja parantaa niiden tehokkuutta [7], [8], [9].

Olemme hiljattain kehittäneet uuden kantajaliposomista joka koostuu kahdesta lipidien todettu ihmisillä, sulfatide ja 1,2-dioleoyl-

sn

-glysero-3-fosfoetanoliamiini (DOPE) [12 ], [13]. Fysiologisessa pH: ssa, DOPE stabiloi sulfatide sisältävien liposomien (SCL) kautta inhiboivia vaikutuksia liposomifuusio, kuin sisällyttäminen sulfatide osaksi DOPE rakkulat huomattavasti parantaa liposomien stabiilisuutta on muodostettu, vaikka plasman läsnä ollessa, mikä johtuu oletettavasti nesteytystä negatiivisesti varautuneen sulfaatti head-ryhmä glykosfingolipidiin [10]. Olemme myös osoittaneet, että vuorovaikutus sulfatide ja tenaskiini välittää sitoutumisen SCL ECM ja endosyyttisten otto liposomien tuumorisoluihin ainakin in vitro [10], [11].

Tavoiteltu toimitus syöpälääkkeiden kasvaimeen microenvironment on lupaavalta terapiaan metastaattisen kolorektaalisyövän. Tenaskiini-C, suuri soluväliaineen hexabracchion glykoproteiini, ilmentyy suuresti mikroympäristössä useimpien kiinteiden kasvainten, mukaan lukien paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, mutta on poissa tai vähentää merkittävästi useimmissa aikuisen kudoksissa [14]. Meidän sulfatide sisältävä kantajaliposomista järjestelmä siten edustaa uutta luokan luonnon lipidejä ohjattu solunsisäinen jakelujärjestelmä kohdistettu kasvaimeen microenvironment. Tutkimaan tällaisen uuden suunnan kehittämiseen tehokkaamman syöpälääkkeiden kemoterapeuttisia, on tärkeää ymmärtää in vivo käyttäytyminen nanocarrier, koska ainutlaatuinen jakelu säätelevät ominaisuudet nanocarrier voi muuttaa terapeuttista tehoa sekä muuta toksisuutta profiili kapseloidun lääkeaineen. Tässä tutkimuksessa käytämme hiiren ksenograftimallia Ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman (HT-29), joka on tunnettu ilmaista Tenaskiini-C [15], [16] ja laajalti käytetty kemoterapiaa huumeiden, doksorubisiini (DOX), mallina hyötykuorma tutkia biologista jakautumista antituumorivaikutuksen tehoa ja toksisuutta sulfatide sisältävien kantajaliposomista järjestelmä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Deakinin yliopisto eläinten hyvinvointi komitea on hyväksynyt kaikki eläinten protokollia käytetään tässä tutkimuksessa.

Cell Culture

ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjaa HT-29 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). McCoyn 5A (muutettu) väliaine ostettiin Invitrogen ™ (Australia). Naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Hyclone (Kanada). Trypsiini ostettiin Invitrogen ™ (Australia). Kudosviljelykolveissa hankittiin BD Falcon ™ (Australia). Lasipohja astiat hankittiin MatTek Corporation (Ashalnd, MA, USA). HT-29-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (50 U /ml), ja streptomysiinillä (50 ug /ml), kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa.

valmistaminen SCL-DOX

Liposomit valmistettiin aikaisemmin julkaistu menetelmä, jossa joitakin muutoksia [10]. Lyhyesti, DOPE unilamellaarivesikkeleitä joka sisälsi 30% (moolisuhde) sulfatide valmisteltiin nesteytys menetelmällä seuraa polykarbonaattimembraanisuoda- puristamiseen. DOPE (13,35 mM) ja sulfatide (6 mM, Avanti Polar Lipids, Inc.) liuotettiin seokseen, jossa oli kloroformia ja metanolia (02:01, v /v), ja lipidin seos, joka koostuu DOPE /sulfatide (3: 7, mol /mol), siirrettiin lasiputkiin. Sitten näytteet vähennetään minimiin tilavuuteen typpivirrassa, ja säilytettiin vakuumissa 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa täysin haihdutetaan orgaaninen liuotin. Ohut lipidifilmit hydratoitiin lisäämällä 1 ml 250 mM ammoniumsulfaattia (pH 8,5). Näytteet asetettiin sitten jää-vesihauteessa ja sonikoitiin typen alla 2,5 min 50% amplitudi käyttäen sonikaattoria (Sonics Materials, Inc). Seuraavat sonikoimalla, liposomit muodostettiin kautta ekstruusion kautta polykarbonaatti kalvoja (Avanti Polar Lipids, Inc.) ja peräkkäisen huokoskoko on 400 nm 14 kertaa, 200 nm 14 kertaa ja 100 nm 19 kertaa huoneenlämpötilassa. Perustaa trans-kaksikerroksinen ammoniumsulfaattigradientilla, suulakepuristettu liposomit dialysoitiin 250-kertainen tilavuus 10% sakkaroosia 25 mM Trizma, pH 8,5 4 ° C: ssa 24 tuntia. Ulkoinen puskuri vaihdettiin kolmesti dialyysin aikana. Dialyysin jälkeen liposomien, DOX, 10% sakkaroosia, jonka lopullinen pitoisuus on 5 mg /ml, lisättiin liposomien lääkeaineen-to-lipidi-suhde 0.3:1 (w /w), minkä jälkeen inkuboimalla vesihauteessa 60 ° C: ssa 1 h. Ei-kapseloitu DOX poistettiin kokoekskluusiokromatografialla käyttäen Sephadex G-50 kolonniin. Pitoisuus fosfolipidit (DOPE) liposomeihin määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Rakkulan koon ja zeta-potentiaali SCL mitattiin Zetasizer Nano ZS Particle Characterization System Malvern? Instruments (Malvern, UK). DOX ladataan SCL kvantitoitiin käyttäen fluoresenssidetektoria High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Kromatografinen instrumentointi käytettiin perustuu aiemmin julkaistu menetelmä muutamin muutoksin [18], [19]. Lyhyesti, HPLC-järjestelmä (Milford, MA, USA) käytettiin tässä tutkimuksessa koostuu Waters e2695 erottaminen moduuli ja Waters 2475 Multi λ Fluoresenssi Detector. Viritys- ja emissioaallonpituudet asetettiin 470 nm ja 585 nm, vastaavasti. Kromatografinen erotus suoritettiin käyttäen Nova-Pak® C18-pylvästä (3,9 x 150 mm i.d., 4 um, Waters, USA), jossa on Nova-Pak® C18 esikolonni (3,9 x 20 mm i.d., 4 um, Waters, USA). Seosta, jossa oli metanolia ja 10 mM fosfaattipuskuria (pH = 3,0) käytettiin liikkuvana faasina. Virtausnopeutta käytetään määrityksessä oli 1 ml /min ja kolonnin pidettiin 40 ± 5 ° C: ssa koko kromatografisen prosessin.

Analyysi Sytotoksisuus

vaikutus vapaan DOX tai SCL-DOX on HT-29-sytotoksisuus määritettiin käyttäen MTT-solujen lisääntymisen määrityksessä [20], [21]. HT-29-solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn 100 ui McCoyn 5A-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Vapaa DOX-liuosta ja SCL-DOX, lisättiin kuhunkin kuoppaan 24 h maljaamisen jälkeen (lopullinen konsentraatio 0-100 ug /ml). Sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen VICTOR TM X5 Multilabel HTS Plate Reader (PerkinElmer Life ja Analytical Sciences). Sytotoksisuus ilmaistiin prosentteina kontrollista soluja. Esto pitoisuus 50% (IC

50), määritellään annokseksi agenttien että esti 50% solujen kasvun, oli interpoloitu kasvukäyrät SPSS 13.0 [18], [19]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolmesti.

konfokaalimikroskopia Analyysi otto solun sisään ja säilyttäminen SCL-DOX

HT-29-solut (1 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 35 mm: n lasin pohja ruokia ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Sitten väliaine korvattiin täydellä elatusaineeseen, joka sisälsi 2 ug /ml vapaata DOX tai SCL-DOX. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kuvattiin solun sisäänoton tutkimuksia. Sillä retentiot-tutkimuksia varten solut laitettiin ensin 2 ug /ml vapaata DOX tai SCL-DOX kokonaan soluviljelyalustassa 24 tuntia ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä. Soluja inkuboitiin sitten tuoreella soluviljelyalustaan ​​ja sarjaan kuvattiin 1 h, 2 h, 4 h, ja 24 h käyttäen Fluoview FV10i fluoresenssin laserskannaus konfokaalimikroskopialla (Olympus, Japani).

Analyysi Farmakokinetiikka in vivo

Sprague-Dawley (SD) rottia (200-250 g) pidettiin joka kylmä- huoneen (25 ± 1 ° C), jossa on 12 tunnin valo-pimeä sykli. Rotille syötettiin

mieltymyksen

tavallisella ruokavaliota, mutta olivat paastolla yön yli ennen vapaan DOX tai SCL-DOX annon. Kaikki toimenpiteet, joissa eläinkokeiden oli hyväksynyt Deakinin yliopisto eläinten hyvinvointia käsittelevät.

Tutkiakseen farmakokinetiikkaa (PK) ominaisuuksia SCL-DOX in vivo, terve SD-rotat injektoitiin suonensisäisesti vapaa DOX tai SCL-DOX kautta häntälaskimoon kerta-annos 5 mg DOX /kg. Veri otettiin sarjana talteen samasta eläimestä hepariinilla putket hännästä 2 min, 0,5 h, 2 h, 6 h, 24 h ja 48 h. Keräämisen jälkeen näytteet sentrifugoitiin 3000 x

g

4 ° C: ssa 10 min erottamiseksi plasmasta. Määrittää DOX plasmassa, 495 ui metanolia ja 405 ui fosfaattipuskuria lisättiin sitten 100 ui plasmaa, vorteksoitiin 1 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin 21000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti siirrettiin toiseen putkeen, minkä jälkeen lisättiin 2 ui perkloorihappoa (35%, v /v). Näytteitä vorteksoitiin 1 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin 21000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, minkä jälkeen mittaus DOX pitoisuus käyttäen HPLC.

Kasvaimen implantaatio, hoito ja arviointi

ksenograftikasvaimissa perustettiin 6 viikon ikäisten BALB /c-Foxn1

nu hiirillä, jotka oli ostettu eläin Resources Centre (Perth, Australia). Kaikki eläinkokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti institutionaalisten Animal Welfare komitean Deakinin yliopisto. Hiiriä pidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa TECNIPLAST Sealsafe ™ Yksilöllisesti Ventilated Häkit (Buguggiate, Italia) klo (25 ± 1 ° C) ja 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä jakso. Niitä ruokittiin

mieltymyksen

tavallisella ruokavaliota.

HT-29-solujen käytetty ksenograftikasvaimissa valmistettiin trypsinoimalla. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen pitoisuutena 3 x 10

7 solua /ml PBS: ssä, joka sitten istutettiin ihonalaisesti (s. C.) Oikeaan kylkeen hiirten. Kasvaimen koko arvioitiin käyttäen digitaalinen työntömitta joka toinen päivä istutuksen jälkeen ja arvioitu kasvaintaakkaa (mm

3) laskettiin pituus x leveys

2/2 (

V

=

lw

2/2), jossa pituus ja leveys ovat pisin ja lyhin akseli millimetreinä [22].

kasvain oton tutkimuksessa hiirille kasvaimia on ~150 mm

3 oli käsiteltiin vapaan DOX tai SCL-DOX (5 mg /kg DOX tai vastaava) kautta häntälaskimoon injektion. Kaksikymmentäneljä tuntia injektion jälkeen hiiret tapettiin injektoimalla Lethabarb R (100 mg /kg) ja kasvaimia käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. DOX pitoisuus kudoksessa määritettiin käyttäen HPLC: tä.

terapeuttinen kokeita, hiiriä käsiteltiin kun ksenograftikasvaimissa saavutti 35 mm

3. Hiiret saivat injektiona suolaliuosta, vapaa DOX (5 mg /kg), SCL-DOX (5 mg /kg DOX) tai tyhjä SCL häntälaskimon kautta kahdesti viikossa 3 viikkoa. Kasvaimen kasvua seurattiin mittaamalla tuumorin halkaisija joka toinen päivä paksuus ja eläinten painot seurattiin samanaikaisesti. Päätepiste Tutkimuksen määriteltiin kasvaimen kuormitus saavuttaa 1700 mm

3.

Analyysi systeeminen myrkyllisyys

Arvioidaan yleisiä myrkyllisyyttä vapaan DOX ja SCL-DOX, veri kerättiin kun hiiret terapeuttista kokeiden tapettiin. Verisolujen laskennat ja troponiiniarvo analysoitiin eläinlääkärin patologian laboratorio (Gribbles Veterinary Pathology, Clayton, Victoria, Australia). Veritahrat saatiin kullekin eläimelle saamiseksi suhteellisen valkosolujen määrän mukailtu fonio menetelmä verihiutaleiden laskenta [25], [26], vähäisin muutoksin. Objektilasit värjättiin Giesma ja alueen verisivelyvalmisteita valittiin jossa punasolut abutted toisiaan, mutta eivät ole päällekkäisiä, jossa peräkkäisen kentän päättäneet poistaa bias. Kokonaismäärä valkosolujen kohti 1500 punasolujen laskettiin (n = 3 kunkin kuvan) ja verrataan kunkin ryhmän.

Data Analysis

Kaikki tulokset esitetään keinot ja keskivirhe (keskiarvo ± SE). Farmakokineettiset parametrit laskettiin keskimääräiset pitoisuudet plasmassa käyttäen farmakokineettistä ohjelmistoa DAS 2.0 ohjelmisto (Matemaattinen Pharmacology Professional komitean Kiina, Shanghai, Kiina). Erot keskiarvojen eri ryhmiä määritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttäen SPSS 13.0 ohjelman. Merkitys pidettiin arvoissa

p

0,05.

Tulokset

karakterisointi SCL

halkaisija SCL sisällyttämällä DOX todettiin vaihtelevan sisällä 92,3 ± 1,3 nm (keskiarvo ± SE, n = 10), jossa polydispersiivisyydestä (PDI) 0,15 ± 0,01 (keskiarvo ± SE). Aloitusnopeudella painosuhde DOX on DOPE of 0.3:1, SCL oli keskimäärin DOX loukkuun tehokkuutta 94,11 ± 2,27% (keskiarvo ± S.E). Zeta-potentiaali arvo SCL oli -26,38 ± 2,20 mV (keskiarvo ± S.E.). DOX DOPE painosuhde jälkeen DOX kapselointia SCL oli 0.5:1.

Solunsisäinen ja kerääntyvä SCL-DOX HT-29 Cells

Hyödyntämällä luonnollisia fluoresenssiominaisuus DOX , solujen ja kerääntyvä vapaan DOX tai SCL-DOX tutkittiin laserskannauksella konfokaalimikroskopia. HT-29-soluja inkuboitiin 2 ug /ml DOX tai SCL-DOX 24 tuntia. Pesun jälkeen ottoa solun sisään eri formulaatioiden DOX tutkittiin. Kuten kuviossa S1 (matala suurennos) ja kuvio 1 (korkea suurennos), sekä vapaa DOX ja SCL-DOX oli otettu mukaan peräsuolen adenokarsinooma soluissa ja oli kasaantuminen DOX tumassa molemmissa ryhmissä (kuvio 1), vaikkakin soluja käsiteltiin vapaa DOX osoitti hieman vahvempi punaisen fluoresenssin (DOX) kuin niillä, joita hoidettiin SCL-DOX 24 tunnin kuluttua inkubaation. Mielenkiintoista, säilyttäminen SCL-DOX HT-29-solujen oli parempi kuin ilmaiseksi DOX. Kuten kuviossa S2A (matala suurennos) ja kuviossa 2A (korkea suurennos), jota seurasi pesu PBS: llä ja inkubointia tuoreessa mediassa 4 h, DOX fluoresenssi vapaa DOX ryhmä vähentynyt merkittävästi. Lisäksi solut käsiteltiin vapaa DOX näytti vähentyneen punaisen fluoresenssin 24 tuntia pesun jälkeen. Kääntäen, punainen fluoresenssi SCL-DOX oli vakaampi verrattuna vapaan DOX ryhmä. Jopa 24 h pesun jälkeen, DOX fluoresenssi voitiin helposti havaita ytimet käsiteltyjen solujen SCL-DOX (kuvio S2B ja kuvio 2B). Tehostettua säilyttäminen SCL-DOX in vitro viittaa siihen, että SCL formulaatio DOX ehkä on paremmat hoidon tehokkuutta in vivo.

HT-29-soluja inkuboitiin 2 ug /ml vapaata DOX tai vastaavan SCL-DOX 24 h. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, solut kuvattiin konfokaalisella fluoresenssimikroskoopilla. (A) Soluja käsiteltiin vapaa DOX. (B) Soluja käsiteltiin SLC-DOX. Red: fluoresenssia DOX; sininen: tumat värjättiin Hoechst 33342. Mittaviivat: 10 um.

HT-29-soluja inkuboitiin ensin 2 ug /ml vapaata DOX tai vastaavan SCL-DOX 24 tuntia. Kahden pesun jälkeen PBS: llä poistaa lääkkeet, soluja viljeltiin tuore täyteen elatusaineeseen, jota seuraa kuvantamislaite jaksoittain 1 h, 2 h, 4 h ja 24 h käyttäen fluoresenssia konfokaalimikroskopialla. (A) Soluja käsiteltiin vapaa DOX. (B) Soluja käsiteltiin SLC-DOX. Red: fluoresenssia DOX; sininen: ytimet Hoechstilla 33342. Mittaviivat: 10 pm.

In vitro Sytotoksisuus

Tutkia in vitro sytotoksisuutta, HT-29-soluja altistettiin eri pitoisuuksia vapaata DOX tai SCL-DOX 48 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Kuten on esitetty taulukossa 1, IC

50 DOX: HT-29-soluissa oli 1,74 ± 0,10 ug /ml, kun taas IC

50 SCL-DOX oli 2,77 ± 0,06. Näin ollen, in vitro olosuhteissa, joissa solut altistettiin vakio pitoisuus aineiden koko määrityksen ajan, vapaa DOX oli myrkyllisempiä kuin SCL-DOX. Tyhjä SCL eivät osoittaneet vaikutuksia solujen eloonjäämistä (tuloksia ei esitetty).

Parannettu Farmakokinetiikka SCL in Healthy SD rotilla

farmakokinetiikkaa sekä vapaan DOX ja SCL- DOX tutkittiin terveillä miespuolisilla SD-rottia. Seerumin puhdistuma kinetiikka vapaan DOX ja SCL-DOX verrattiin kuten on esitetty taulukossa 2. Tutkimuksessamme mismäisillä DOX kapseloidaan SCL-DOX (1,39 l /h /kg) oli merkitsevästi alhaisempi kuin DOX-liuosta ( 2,68 l /h /kg,

p

0,01), mikä viittaa erisuuruisia puhdistumaan SCL-DOX verrattuna vapaan lääkeaineen. Lisäksi alue plasman pitoisuus-aika käyrät tutkimusjakson aikana (AUC

0-48 h) DOX toimitetaan kautta SCL oli 2,37 kertaa suurempi kuin vapaa DOX (

p

0,01) . Niinpä DOX voisi näyttää merkittävästi vähentynyt puhdistuma sekä tehostettua hyötyosuus, kun sitä annetaan vangita SCL.

bioleviäminen ja kasvaimeen edut SCL-DOX

Tutkimukset vertaamalla kertyminen vapaa DOX tai SCL-DOX kasvaimissa ja elimissä tehtiin BALB /c-nude-hiirissä HT-29 -tuumoriksenografti malli. Eläimet injektoitiin i.v. yhdellä annoksella vapaata DOX tai SCL-DOX (5 mg /kg) ja ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa DOX pitoisuus munuaisissa kahden hoitoryhmän 24 tuntia annon jälkeen. Keuhkoihin ja maksaan osoittivat korkeampia DOX kerääntymistä (4,74-kertainen ja 12,94-kertaiseksi) ja SCL-DOX käsittely (kuvio 3A), ja perna, suuri elin retikuloendoteliaalijärjestelmän, osoitti 17-kertainen DOX kertymisestä SCL-DOX hoitoon. Kuitenkin SCL-DOX hoito kahdessa pääelimet jotka näyttävät annosta rajoittavat toksisuudet DOX kliinisesti, eli ihon ja sydämen, vähensi DOX kertyminen 59,0% (0,039 ± 0,001 ng /g versus 0,066 ± 0,003 ng /g) ja 77,4% (0,956 ± 0,073 ug /g verrattuna 1,235 ± 0,083 ng /g) verrattuna vapaaseen DOX, vastaavasti (kuvio 3A ja 2B). Lisäksi SCL kapselointi merkittävästi parannettu DOX kertymistä (1,3-kertainen; 0,060 ± 0,005 ng /g versus 0,047 ± 0,003 ng /g) ksenograftissa kasvain verrattuna vapaaseen DOX (kuva 3D), selvästi vahvistetaan tehostetun kasvaimensisäisenä DOX toimituksen SCL -DOX in vivo.

Nude-hiiret, joilla on ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän HT-29-ksenografteissa käsiteltiin 5 mg /kg vapaata DOX tai SCL-DOX iv Hiiret lopetettiin 24 tuntia myöhemmin. Elimet ja kudokset otettiin talteen, pestään, punnitaan, ja DOX uutettiin ja määrällisesti. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.E. (N = 5~6). *,

P

0,05 verrattuna vapaan DOX; **,

P

0,01 verrattuna vapaan DOX.

Tehostettu terapeuttinen teho SCL-DOX

Arvioimme antituumorivaikutuksen SCL-DOX käyttäen BALB /c-nude-hiirissä HT-29 -tuumoriksenografti malli. Kun kasvain oli kasvanut noin 35 mm

3, me jaetaan eläimet satunnaisesti neljään ryhmään (n = 5~10) minimoimiseksi ero painon ja kasvaimen koko ryhmien kesken. Seuraavat hoitoja annettiin i.v. kahdesti viikossa 3 viikon ajan: (

i

) suolaliuos; (

ii

) tyhjä SCL; (

iii

) vapaa DOX (5 mg /kg) ja (

iv

) SCL-DOX (5 mg /kg). Kehon paino eläinten ja kasvaimen kokoa sitten seurata, kunnes koko kontrolliryhmän kasvaimen eläinten lopussa olevassa tutkimuksessa. Kuten esitetään kuviossa 4, ja kontrolliryhmien hiirten sai suolaliuosta tai tyhjä SCL, hoito ei ole mitään tehoa, ja keskimääräinen kasvaimen kokoa lopussa tutkimuksen olivat 1129,03 ± 55,06 mm

3, ja 1188,63 ± 137,54 mm

3, vastaavasti (keskiarvo ± SE, n = 5~6). SCL-DOX hoitoryhmässä osoittautui teholtaan, joiden lopullinen keskimääräinen kasvaimen kuorma 586,52 ± 29,63 mm

3, verrattuna 809,13 ± 43,75 mm

3 vapaan DOX ryhmä. Näin ollen, verrattuna suolaliuosta tai vapaa DOX hoidon tehoa SCL-DOX tukahduttaa kasvaimen kasvua annoksella 5 mg /kg paransi merkittävästi ~1.9-kertaiseksi ja ~1.4-kertaiseksi.

hiirillä, joilla on HT-29-ksenografteissa injektoitiin iv suolaliuoksella, 5 mg /kg vapaata DOX, SCL-DOX tai tyhjiä SCL kahdesti viikossa 3 viikon ajan kuten, päivästä lähtien, jolloin kasvaimen tilavuuden saavutti ~35 mm

3. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe (N = 5~6). *,

P

0,05 verrattuna suolaliuos; **,

P

0,01 verrattuna suolaliuos; #,

P

0,05 verrattuna vapaan DOX; ,

P

0,01 verrattuna tyhjä SCL; ,

P

0,001 verrattuna tyhjä SCL.

Seuraavaksi vertasimme eloonjäämislukuja kasvainta kantavien hiirten seuraavat neljä eri hoito-ohjelmia. Kuten kuviossa 5 on esitetty, keskimääräinen elossaoloaika neljän eri ryhmät olivat 26 päivää (suolaliuos), 33 päivää (vapaa DOX), 36 päivää (SCL-DOX) ja 32 päivää (tyhjä SCL), vastaavasti. Siten SCL-DOX hoito lisäsi keskipitkän käyttöikä 38,5% verrattuna suolaliuosta kontrolliryhmään, 12,5% verrattuna tyhjän SCL ryhmässä ja 9,1% verrattuna vapaan DOX ryhmä. Nämä kokeet osoittivat, että hallinto SCL-DOX 6 annosta kolmen viikon aikana ei ainoastaan ​​tuotti parempaa tuumorin kasvun estäminen vaan myös paransi selviytymisen ksenograftissa omaavilla eläimillä.

Kaplan-Meier selviytymisen käyrä osoittaa parantaminen elinikä ksenograftin kantavien hiirten hoidettu SCL-DOX (n = 9~10 ryhmää kohden). Hiiret käsiteltiin kuten kuviossa 3 ja tapettiin koko tutkimuksen ajan saavutettuaan Tutkimuksemme päätepistettä.

Alennettu systeeminen toksisuus SCL-DOX

DOX aiheuttama sydänlihassairaus on yksi avaimen annosta rajoittavaa toksisuutta lääkkeen [27]. Sydämen troponiiniarvo-T vapautuu DOX-vaurioitunut myosyyteistä [28], siis mittaus seerumin tämän proteiinin tarjoaa herkän arviointi varhaisen kardiotoksisuuden DOX. Menetelmää käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on cut-off kynnyksen 0,01 ug /l normaalialueella [29]. Kuten taulukosta-3, vapaan DOX hoito johti 75-kertainen troponiiniarvo seerumipitoisuuden kontrolleihin verrattuna, mikä vahvistaa tunnetun kardiotoksisuuden vapaan lääkkeen. Ei kuitenkaan seerumin troponiiniarvo havaittiin, että SCL-DOX hoitoryhmässä, joka jäi cut-off tasoa, kuten Kontrolliryhmiin osoittaa, että hoitoon ksenograftin kantavien hiirten 6 annosta SCL-DOX aikana 4 viikkoa oli minimaalinen kardiotoksisuuden. Sen tutkimiseksi, kapselointi DOX osaksi SCL ollut vaikutusta vakavuudesta luuydinsuppressiona (myelosuppressio), yleisin haittavaikutus DOX kemoterapiaa [27], tutkimme muutoksiin perifeerisissä valkosolumäärä. Kuten kuviossa 6 on esitetty, ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa kokonaismäärä valkosolujen välillä suolaliuoksella käsiteltyjen tai SCL-DOX-käsitellyissä ryhmissä. Lisäksi verrattuna käsitellyillä hiirillä vapaan DOX, saaneilla SCL-DOX oli 2,0-kertainen ja 3,3-kertainen määrä on lymfosyyttien ja monosyyttien, vastaavasti. Näin ollen tietomme osoittavat, että SCL-DOX on minimaalinen kardiotoksisuutta ja merkittävästi vähemmän myelosuppressiota.

HT-29-ksenografti-kantavia hiiriä käsiteltiin kuten on esitetty kuviossa 3. Veri kerättiin heti hiiret tapettiin saavuttaessaan päätepiste. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe (N = 3~5). *,

P

0,05 verrattuna suolaliuos; ***,

P

0,001 verrattuna suolaliuos; #,

P

0,05 verrattuna vapaan DOX; ##,

P

0,01 verrattuna vapaan DOX.

Keskustelu

Tämä tutkimus on ensimmäinen arvioida kudosjakaumastaan ​​in vivo syövän vastaisia ​​toimia ja toksisuusprofiili SCL-DOX in vierassiirrännänmallissa hiirimallissa paksu- ja adenokarsinooma. Olemme osoittaneet useita tärkeitä kohtia: (a) SCL-DOX helposti tarttunut koolonkarsinoomasoluissa ja näytetään pitkäaikainen säilyttäminen; (B) kapselointi DOX SCL johti vähentynyt jakautuminen lääkkeen pääasiallinen sivustoja akuutin ja kroonisen toksisuuden vapaan DOX eli sydämen ja ihon sekä merkittävästi alentaa kardiotoksisuutta ja myelosuppression; (C) sulfatide sisältävät -liposomilääkeaineen näkyy parannettu terapeuttinen teho hiirimallissa ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman.

solunsisäinen otto SCL glioomasolut osoitettiin olevan seurausta endosyyttisissä oton liposomien aiemmissa toimi [11]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet solunsisäistä ottoa SCL-DOX ihmisen kolorektaalisen adenokarsinoomasolua, HT-29, käyttäen konfokaalimikroskopia. Tärkeää on, olemme osoittaneet, että kapseloidun kemoterapia lääke annettiin solunsisäisesti vaikutuskohtaan, ytimet, HT-29-solut (kuviot 1 ja 2). Lisäksi toimitetaan -liposomilääkeaineen pidätti kasvainsolut myös 24 h pesun jälkeen. Meidän in vitro sytotoksisuutta Tutkimuksessa verrattiin elinkelpoisuuden peräsuolen syöpäsolujen käsitelty SCL-DOX ja vapaa DOX käyttämällä MTT-määritystä ja osoittivat, että molemmat muodot omaavat selvän sytotoksisuuden. Mielenkiintoista on, että SCL-DOX on IC

50 59% korkeampi kuin vapaa DOX (taulukko 1). Tämä on sopusoinnussa havaintojen muille, että IC

50 vapaan ja liposomaalisen lääkeaineen, kun määritettiin in vitro, vaihtelee riippuen käytetyt solulinjat ja liposomien luonnetta. Esimerkiksi Wang et al. löydetty rotan eturauhassyövän solulinjaa MLLB2, IC

50 liposomiformulaationa oli huomattavasti pienempi kuin vapaa DOX [30]. Tutkimuksessa, resistenttien MCF-7 /ADR-solut, liposomaalinen DOX oli 30 kertaa pienempi IC

50 verrattuna vapaan DOX [31]. Kuitenkin muissa tutkimuksissa vapaa DOX näyttää korkeammat solunsisäiset otto ja näyttää suurempi sytotoksisuus kuin liposomaalisen DOX. Esimerkiksi vuonna maksasyövän solulinja, HepG2, vapaa DOX on osoitettu omaavan korkeamman sytotoksisuutta verrattuna DOX ladattu stealth liposomit [24]. Lisäksi, polyetyleeniglykoli (PEG) päällystettiin-liposomaalinen DOX on osoitettu olevan vähemmän toksisuutta kuin vapaa DOX on glioomasolulinjasta, U-87-soluja [10]. On tärkeää ymmärtää, että in vivo farmakokinetiikka on hyvin erilaiset liposomaalisen DOX ja vapaa DOX. Puoliintumisaika liposomaalisen DOX voi olla useita päiviä, kun vapaa DOX voidaan poistaa muutamassa minuutissa in vivo [32], [33], [34]. Soluviljelmässä ruokia, solut altistetaan jatkuvasti lääkeaineen pitoisuus koko määrityksen ajan, ja usein jopa ilmaiseksi DOX nopeammin kuin liposomimuodossa [35]. Lisäksi solut MTT määritykset ovat enimmäkseen viljellään yksikerrosviljelmiin, joilla on alueellinen organisaatio rajusti eroaa in vivo 3-ulotteinen kudos arkkitehtuuri [36]. Täten vertailu IC

50 välillä vapaan lääkeaineen ja nanohiukkasten-formulaation lääkeaineen in vitro antaa mittauksen sytotoksisuuden alle vakiopitoisuuden aikana valitun määrityksen aikana, ja siksi se ei voi tarjota luotettavan ennustaminen terapeuttinen teho in vivo [37]. Esillä olevassa tutkimuksessa, vaikka IC

50 SCL-DOX oli korkeampi kuin vapaan DOX HT-29-solujen in vitro, SCL formulaation on osoitettu olevan paljon parempi kasvaimen estävää vaikutusta yli vapaan DOX HT -29 kasvain nude-hiirissä (kuviot 4 ja 5).

Ruoansulatuskanavan kasvaimia tiedetään olevan suhteellisen resistenttejä kemoterapia-aineille. 80% käsittelemättömän paksusuolen kasvaimia, on kohonnut monilääkeresistenttien I (MDR I) geenin [38]. Vertailu farmakokinetiikan välillä vapaan DOX ja SCL-DOX terveillä SD-rottia näy merkittävää pienentynyt puhdistuma nopeus SCL-DOX verrattuna vapaan DOX (

p

0,01).