Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

nipistämässä vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC) on tappava kunnossa saavilla potilailla androgeenien puute hoitoa eturauhassyöpään (PC). Huolimatta lukuisista tutkimukset osoittavat ilmentymisen HIF1α proteiinin normoksia PC solulinjoissa, rooli tämän normoxic HIF1α ilmaisua Chemo-vastus ja muuttoliikettä ei ole tutkittu aikaisemmin. Koska mikään menetelmä on tällä hetkellä saatavilla, mitkä kasvaimia edetä CRPC, rooli HIF1α PC ja sen mahdollisia ennustamiseksi kehittämiseksi CRPC tutkittiin myös.

Methods

Vaikutus HIF1α proteiini pudotus on chemo-kestävyys ja kulkeutumista PC3-solujen arvioitiin solujen laskenta ja TranswellTM määrityksissä, vastaavasti. Käännös tehokkuutta HIF1α mRNA määritettiin PC-soluissa käyttäen HIF1α 5’UTR-lusiferaarikonstrukti. Kliiniset tulokset korreloivat jälkeen värjäys 100 eturauhasen kasvaimista HIF1α ilme.

Tulokset

CRPC kaltainen solulinjoissa (PC3 ja DU145) ilmaisivat enemmän HIF1α proteiinia kuin androgen herkkä solulinja ( LNCaP). Maahanmuuttoluku ja Chemo-vastus olivat suuremmat PC3-soluissa ja molemmat pieneni, kun HIF1α ilmentyminen väheni. Lisääntynyt kääntäminen HIF1α mRNA voi olla vastuussa HIF1α yli-ilmentymisen PC3-soluissa. Potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat HIF1α oli merkittävästi vähentynyt etäpesäke elinaika ja potilailla, jotka olivat androgeenipuutteen terapia oli laskenut CRPC elinaika on Kaplan-Meier-analyysi. On monimuuttujamenetelmin HIF1α oli itsenäinen riskitekijä etenemiseen metastaattisen PC (Riskisuhde (HR) 9,8, p = 0,017) ja kehittäminen CRPC (HR 10,0, p = 0,021) potilailla androgeenipuutteen hoito. Erityisesti kasvaimia, jotka eivät ilmentäneet HIF1α ei etäispesäkkeitä tai kehittää CRPC.

Johtopäätökset

HIF1α on omiaan edistämään etäpesäkkeiden ja Chemo-vastus CRPC ja kohdennettu vähentäminen HIF1α voi parantaa kykyä vastata of CRPCs kemoterapiaa. Expression of HIF1α voi olla hyödyllinen seulontavälineenä kehittämiseen CRPC.

Citation: Ranasinghe WKB, Xiao L, Kovac S, Chang M, Michiels C, Bolton D, et al. (2013) The Role of Hypoksia-indusoituva tekijä 1α määritettäessä ominaisuudet nipistämässä hylkivät eturauhasen syöpiä. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10,1371 /journal.pone.0054251

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2012; Hyväksytty: 10 joulukuu 2012; Julkaistu: 16 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Ranasinghe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 454322 (GSB), 566555 (GSB, AS) ja 628390 (AS, OP, GSB) National Health ja Medical Research Council of Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on toiseksi yleisin syöpä miehillä maailmassa ja edelleen aiheuttavat merkittävän tautitaakan ja kasvava maailmanlaajuinen terveydenhuollon ongelma. Kuitenkin meidän mekanismien ymmärtämistä, joka edistää PC on edelleen rajallinen [1]. Androgeenit ja androgeenireseptorin (AR) ovat tärkeitä säätelijöitä stimulaation ja selviytymistä eturauhasen syöpäsoluja. Androgeenien puute hoitoa (ADT) on hoidon kulmakivi metastaattisen ja paikallisesti edennyt eturauhassyöpä. Kuitenkin ADT lopulta ei pysty ylläpitämään eturauhassyöpää tukahduttaminen on osa miehistä, joilla tämä ehto.

nipistämässä vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC) on tappava muoto PC, joka voi edetä ja etäispesäkkeitä nopeasti. Kehitykseen CRPC, yli 84%: lla potilaista on etäpesäkkeitä [2]. Harvat biomarkkereita ennustamiseen CRPC on kuvattu [3], [4], ja tällä hetkellä ei ole olemassa yleismaailmallista yksimielisyyttä tunnistamaan ne potilaat, joilla PC edetä CRPC. Lisäksi mekanismit johtaa kehittymistä ja etenemistä CRPC yhä puutteellisia osittain siksi rajallisesta saatavuudesta solulinjoista, joita tiiviisti mallintaa CRPC. Kaksi laajalti käytetty PC solulinjojen PC3 ja DU145 ei pidetä täysin edustava CRPC soluja, koska niitä ei ole eristettiin eturauhasen syöpiä, jotka oli uusiutunut jälkeen androgeenideprivaatio hoidon, ja koska ne ilmentävät pieni [5], jos mitään AR [6], kun taas AR usein yliekspressoitu CRPC kasvaimia. Kuitenkin koska PC3 ja DU145 solujen näyttää joitakin perustavaa laatua ominaisuuksien CRPC kasvain lukien korkea muuttoliike (etäpesäke), androgen-itsenäisyyttä ja kemoterapian resistenssin samanlainen CRPC LNCaP C4-2 [7], ja myös samanlaisia ​​molekyylien ominaisuudet mukaan lukien ehtyminen /mutaation mitokondrion DNA: ta, joka on korreloitu invasiivisuus ja lääkeresistenssin [8], nämä kaksi solulinjaa ovat usein kutsutaan CRPC soluihin [9], [10], [11].

Hypoksia on vähentää normaalin konsentraation kudoksen hapen, jota esiintyy monien sairauksien kuten syövän. Niukkahappiseen microenvironment sisällä eturauhanen on oletettu olevan vastuussa edistämisestä toissijaisen geneettisiä muutoksia ja angiogeeninen stimulaatio, mikä johtaa aggressiivisempi solun fenotyyppiin ja pahanlaatuisten etenemisen [12]. Kyky solujen sopeutua hypoksia riippuu joukko hypoksian indusoituvan transkriptiotekijöiden (HIFs), jotka koostuvat sääntelyn alfa (HIF1α) ja konstitutiivinen beetaosan (HIF1β). HIFs sitoutuvat ydin 5′-RCGTG-3 ’kohde promoottorit ja aiheuttaa yli 200 toiminnallisesti erilaisia ​​geenejä, jotka osallistuvat solun eloonjäämisen [13]. Synteesi HIF1α kautta tapahtuvaa hapen riippumattomien mekanismien mutta sen hajoaminen on hapen vaikutuksesta ja siihen propyylihydroksylaasia, asparaginyyli hydroksylaasin, Von Hippel-Lindaun proteiinin ja proteasomaalisten järjestelmän [13].

Vaikka HIF1α on yli ilmaistaan useissa ihmisen syövissä [14], [15], rooli HIF1α syövän etenemistä on epäselvä. Korkeat pitoisuudet HIF1α munuaisten ja rintasyövän solulinjat osoitettiin lisäävän syöpäsolujen selviytymistä, kun taas munasarjasyövän korkea HIF pitoisuuksia osaltaan lisännyt apoptoosin [13]. Dai ja työtoverit kertoi, että akuutin hypoksian lisääntynyt HIF1α ilmaisun ja motiliteettia ja invasiivisen kapasiteettia kolmesta PC solulinjojen [16]. Vaikka lukuisat tutkimukset osoittavat läsnäolo HIF1α ilmaisun normoksia, ja raportti, joka HIF1α signalointi yliaktiivista normoxic kastraatio kestävä LNCaP C4-2 soluja verrattuna vanhempien LNCaP [17], rooli normoxic HIF1α ilmaisu on ei hyvin dokumentoitu, ja sen vuoksi perustana nykyiseen tutkimukseen.

Vastaavasti huolimatta korkeasta HIF1α ilmentyminen PC kudoksissa [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], sen yhdessä ennuste on epäselvä [25], [24], [26], [27]. Kuitenkin konsensus on, että HIF1α ylössäädellään eturauhastuumoreissa [28], [24] ja on voimakas kasvaimen aiheuttama kilpenä oksidatiivisen stressin tai tuhoutuminen androgeenideprivaatio, kemoterapiaa tai sädehoitoa sytotoksisuuden [29]. Tällä hetkellä ei ole tutkimuksissa on raportoitu suhteita HIF1α ilmaisun ja kehittämiseen CRPC. Siksi pyrimme tutkia roolia HIF1α sääntelyn CRPC ja analysoida sen mahdollisia biomarkkerina ennustamiseen kehittämiseen CRPC.

Materiaalit ja menetelmät

In vitro -tutkimuksissa

Soluviljely.

kolmen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (PC3, DU145 ja LNCaP) tässä tutkimuksessa käytetyt oli anteliaasti lahjoittanut A /prof. Ian Davis, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, ja oli ostettu ATCC 2009. Solulinjat viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Mulgrave, Australia) täydennettynä 8% FBS ja 100 U /ml penisilliiniä. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa, jossa 95% ilmaa ja 5% CO

2. Hypoksian käsitelty soluja viljeltiin samalla tavoin kuin valvontaa, paitsi että kaasu- faasi sisälsi 94% typpeä (N

2), 5% CO

2 ja 1% O

2, jossa happipitoisuus seurataan ja säädetään automaattisesti sähköisen hapen ohjain (ProOx Model 110, Biospherix, Redfield, NY).

Western blot-analyysi.

Solut pestiin kerran jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ( PBS) ja lyysattiin 0,1-0,2 ml pre-keitettyä natriumdodekyylisulfaattia (SDS) lyysipuskuria. Proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin Hybond-C Extra nitroselluloosamembraanille (GE Healthcare, Rydalmere, Australia). HIF1α proteiini havaittiin monoklonaalisella hiiren anti-humaani HIF1α-vasta-ainetta (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Australia), jota seurasi sekundaarinen vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoitu vasta-aine (1:5000, Bio-Rad). Latauskontrollina, blotteja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua kanin anti-GAPDH-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Kaistoja visualisoida LAS 3000 Image Reader (Fujifilm, Brookvale, Australia), ja ECL Advance Western blotting Detection Kit (GE Healthcare). Densitometrinen analyysi proteiinivyöhykkeet suoritettiin MultiGauge ohjelmisto (Fujifilm).

Proliferaatiomääritys.

mittauksessa pohjapinta proliferaatiotasoja, 2 x 10

5-soluja viljeltiin 6 hyvin petri-astia kasvatusväliaineeseen täydennetty FBS. Solut pestiin PBS: llä 24 tuntia ja viljeltiin vielä 48 tunnin ajan seerumivapaassa väliaineessa. Solut, jotka saivat hoitoa maljattiin kuten edellä, ja alusta poistettiin 24 tunnin kuluttua ja täydennetty FBS-vapaa tiedonvälitys ennen käsittelyä vetyperoksidilla (H

2O

2), kobolttikloridia, 5-fluorourasiili (5-FU) tai hypoksian (1% O

2) 48 tuntia. Solut laskettiin käyttämällä automatisoitua solulaskijalla (Countess®, Invitrogen).

Migration /invaasion määritykset (Transwell Assay) B

Eturauhassyöpä-soluja ympättiin tiheydellä 2 x 10

5 solua 250 ui kuoppaa kohden seerumittomassa elatusaineessa ylempään kammioon polyeteenitereftalaatin suodatinmembraanit päällystetty fibronektiinilla. Yläkammiot insertoitiin kudosviljelmän kuoppiin ja 750 ul: ssa seerumitonta viljelyalusta lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu yön yli 37 ° C: ssa, ei-muuttavien solujen pinnalla ylemmän kalvon poistettiin vanupuikolla, ja soluja, jotka olivat vaeltaneet kalvon huokosten läpi ja tunkeutuu alapuolen kalvo kiinnitettiin 90% metanolilla ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Määrällinen arviointi, määrä värjätään, vaeltavien solujen sitten laskettiin mikroskoopilla. Viisi pienitehoisia kenttää per suodatin laskettiin kolmessa erässä kolmen itsenäisen kokeen.

Stable HIF1α kaataa PC3-soluissa.

koodaavat plasmidit ihmisen HIF1α shRNA (Mission® kloonausnumerot TRCN0000003810 ja TRCN0000010819, jotka koodaavat hiusneula-tyypin siRNA) ja negatiivinen kontrolli plasmidin (SHC002) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Solut transfektoitiin joko HIF1α shRNA plasmidiin tai negatiivinen kontrolli plasmidin käyttäen Neon® transfektiomenetelmä (Invitrogen). Lyhyesti, 1 x 10

6-solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, ja pelletoitiin ennen suspendoimalla uudelleen 100 ul: Neon uudelleensuspendointipuskuriin. HIF1α tai ohjaus shRNA plasmidin (5 ug) lisättiin ja sekoitettiin hyvin sisään solususpensio ennen transfektiota. Transfektoidut solut siirrostettiin täydelliseen kasvualustaan, ja valitaan 1,0 ug /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich) ja 7 päivää ennen seuraavaa määrityksissä. Pudotus on HIF1α proteiinin osoitettiin Western-blottauksella, ja mittaamalla sen loppupään tuote, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), entsyymi-immunologinen määritys (ELISA).

Translation tehokkuutta.

sen määrittämiseksi, onko 5’UTR HIF1α mRNA on jokin rooli HIF1α yli-ilmentymisen eturauhasen solujen toimittaja plasmidi, jossa koko 5’UTR ja 238 bp HIF1α promoottorin sekvenssi kloonattiin ylävirtaan

Firefly

lusiferaasia koodaavat sekvenssit pGL4.10 reportteriplasmidilla. Reportteri-konstrukti transfektoitiin LNCaP ja PC3-soluissa ja tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus vetämänä HIF1-UTR toimittaja vektori ja

Renilla

lusiferaasi (pTK-Renillaa ohjaus toimittaja vektori) määritettiin seuraavan 24 tunnin inkubaation jälkeen. Kokonais-mRNA uutettiin transfektoiduista soluista ja määrää lusiferaasin mRNA määritettiin käyttäen Real Time PCR. Lusiferaasin mRNA solujen transfektoitiin tyhjällä pGL4 vektoria käytettiin pohjapinta ohjaus. Käännös tehokkuus laskettiin jakamalla

Firefly

lusiferaasiaktiivisuutta (verrannollinen lusiferaasiproteiinin), jonka pitoisuus on

Firefly

lusiferaasin mRNA. Tämä suhde edelleen korjattiin transfektion tehokkuutta ottamalla huomioon

Renilla

lusiferaasiaktiivisuutta.

Kliiniset tulokset tutkimukset

Human kudosnäytteitä.

arviointi assosiaatiot HIF1α ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin, 100 ihmisen eturauhasen kasvaimia potilailta, jotka olivat säädetyt tietoisen kirjallisen suostumuksen kerättiin seuraavat eturauhasen tai höyläysleikkaus eturauhasen (TURP) meidän laitoksen vuosien 2000 ja 2011. Kaikki näytteet on saatu Victorian Syöpä Biopankkiverkosto ja tai laitos Anatominen patologian Austin Hospital, Victoria, Australia. Hyväksynnän käyttää biologisten näytteiden ja de-yksilöidyn potilaan tiedot tässä tutkimuksessa saatiin Austin Health Tutkijavoimavarojen eettisen komitean.

immunohistokemia.

parafinoidut kudosleikkeet de-vahattu in histolene ja sammutettua laskiessa etanolikonsentraatiot. Objektilasit huuhdeltiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa /Tween 20: tä (TBST) ja antigeenejä haettiin kuumentamalla sitruunahappo (pH 6,0) mikroaaltouunissa 2 minuuttia Keskikorkealle ja 13 minuuttia miedolla alhainen. Dioja annettiin jäähtyä ja endogeenisen peroksi- näytteissä blokattiin käsittelemällä 3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan pimeässä. Objektilasit pestiin vedellä, joka oli tasapainotettu TBST-puskurissa, estettiin Ultravision (Thermo Fisher Scientific) 10 minuutin ajan ja värjättiin HIF1α käyttäen HIF1α polyklonaalista vasta-ainetta (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 4 ° C: ssa yön yli . Sen jälkeen kun vasta-aineen inkuboinnin, kalvot käsiteltiin HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (Dako) pimeässä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Objektilasit pestiin TBST seuraavien 5 minuutin inkubaation 3,3′-diaminobentsidiini (DAB) kromogeenilla (1 tippa /ml substraattipuskuria, Dako) suorittaa värin kehittymiseen. Lopuksi, diat vasta- värjättiin hematoksyliinillä 1 minuutti, pestään juoksevalla vedellä ja Scottin vesijohtovesi 1 minuutin jokaisen, kuivattu ja kansi liukastui. Tutkijat ovat sokeita asemaan yksittäisten näytteiden, ja kasvaimet jaettiin mukaan läsnä tai poissa HIF1α sijaan voimakas tai heikko värjäytyminen vähentää välistä tarkkailijan vaihtelu.

Tulokset.

Distant etäpesäkkeet määriteltiin poikkeavuuksia dokumentoitu luu-scan tai tietokonetomografia. CRPC määriteltiin 2 peräkkäistä nousee eturauhasen-antigeenin (PSA) päässä PSA pohjalukema. Aika kehittämiseen etäpesäkkeiden mitattiin leikkauksen, kun taas aika kehittämiseen CRPC, Chemo-resistenssi ja PC-spesifisiä syöttämällä mitattiin alusta androgeenien puute. Pre interventiotutkimuksella PSA määriteltiin PSA välittömästi ennen saamisen kudosnäyte, ja T3 ja T4 lavastus määriteltiin paikallisesti edenneen eturauhassyövän kuin vuonna 2002 Yhdysvaltojen yhteisen komission syövän pysähdyspaikan järjestelmä [30].

Statistical analyysi.

tilastollinen analyysi suoritettiin ohjauksessa tilastollisen neuvontapalvelu, University of Melbourne, Australia. Pearsonin khiin neliö analyysi ja Fisherin testit suoritettiin käyttäen kahta-by-kaksi taulukkoa (Gleason, HIF1α positiivisuus, kasvain vaiheessa ja potilaiden lukumäärä alkoi androgeenien puute hoitoa) on SigmaStat ohjelmisto (Jandel Scientific, San Rafael, CA) ja testata assosiaatio potilaan ominaisuuksien ja HIF1α ilme. Yhden ja usean analyysi suoritettiin käyttäen Coxin regressiomalleja kaikkiin muuttujiin. Jotta päästäisiin eroon ei-lähentyminen Coxin regressiomallin analysoitaessa varten HIF1α positiivisuus ja Gleason (koska ei ollut kannalta: HIF1α negatiivisen ryhmän ja alhaisen Gleason tulokset), nämä yhden ja usean analyysi laskettiin Coxin regression Firth n rangaistaan ​​suurimman uskottavuuden menetelmää käyttäen R ohjelmistoa, (R pohjan tilastollinen tietojenkäsittely versio 2.14.0). Survival laskettiin kullekin tuloksen käyttämällä Kaplan-Meier -käyrät log rank -testi SPSS tilastopaketilla (IBM SPSS version 17). Diagnostinen testi arviointien kanssa herkkyys ja analyysi suoritettiin käyttäen MedCalc tilasto-ohjelmalla (MedCalc Software, Belgia https://www.medcalc.org/).

In vitro

Tiedot esitetään keinona ± SEM. Tilastollinen merkitys yhden vertailua normaalijakaumaa tietojen määritettiin Studentin t-testiä tai tiedot, jotka eivät normaalisti jaettu Mann-Whitneyn rank sum testi. Monimuuttujille yksisuuntainen ANOVA, jonka jälkeen Bonferroni korjaus tehtiin. Kaikki tilastot analysoitiin ohjelman SigmaStat (Jandel Scientific).

Tulokset

HIF1α Expression korreloi maahanmuuttoluku PC Solut

HIF1α proteiinin ilmentyminen analysoitiin androgeeni herkkien (LNCaP) ja androgeenista tunteeton (PC3 ja DU145) CRPC kaltaisia ​​soluja. Basal HIF1α ilmentymistä normoksia oli korkeampi 12 ± 6-kertainen ja 10 ± 4-kertaiseksi vastaavasti CRPC kaltaiset solulinjat PC3 ja DU145 verrattuna androgen-herkkien LNCaP-soluja (kuvio 1A). Mielenkiintoista havainto, että pohjapinta kasvu LNCaP-solujen seerumittomissa olosuhteissa oli paljon suurempi kuin PC3-soluja, jotka ilmentävät enemmän HIF1α, osoittaa, että lisääntynyt ilmentyminen HIF1α ei välttämättä johda suurempaan proliferaatioon (kuvio 1 B). Tutkitaan metastaattista potentiaalia PC solulinjojen, kulkeutumista CRPC solulinjojen PC3 ja DU145 verrattiin androgen-herkkien LNCaP käyttäen Transwell määritystä. Havainto, että migraatio PC3 ja DU145 soluissa oli 177 ± 6% ja 215 ± 17% arvosta varten LNCaP-soluja (100%) (kuvio 1 C) osoitti, että yliekspressio HIF1α liittyy lisääntynyt maahanmuutto.

A) Basal HIF1α proteiinin pitoisuuksia ihmisen PC solulinjoissa LNCaP, DU145 ja PC3 alle happiolosuhteissa analysoitiin Western blot. (B) Lisääntyminen määritettiin solulaskennalla jälkeen 24 ja 48 tuntia. (C) Migration /invaasio hinnat mitattiin TranswellTM määrityksiä 24 tuntia. Arvot (A) ja (C) ilmaistaan ​​kertainen kasvu verrattuna LNCaP-solut, kun taas arvot (B) ilmaistaan ​​prosentteina ajan 0-arvo. Kaikki arvot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä hoitoja. (D) eloonjäämislukuja PC soluja altistetaan sytotoksisille olosuhteissa. Selviytymisen PC3-solujen (joissa on korkeampi pohjapinta HIF1α proteiinia), kun ne altistetaan oksidatiivista stressiä vetyperoksidin (H

2O

2) tai chemotoxicity 5-fluorourasiilin (5-FU) verrattiin eloonjäämisen LNCaP soluja (joka on alempi HIF1α ilme). Eloonjäänti arvioitiin laskemalla solujen määrä 24 tunnin kuluttua. Arvot on ilmaistu prosentteina käsittelemättömään kontrolliin ja ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä hoitoja. # P 0,05 versus käsitelty LNCaP.

Suurempi HIF1α Expression korreloi Lisääntynyt Cell Survival

Yksi ominaisuuksista CRPC on sen kestävyys kemo- ja radio-terapia. Tutkia, onko HIF1α vastaa elonjäämisetua of CRPC kaltaisia ​​soluja

in vitro

, solujen eloonjäämistä käsittelyn jälkeen PC3 tai LNCaP kahdella sytostaattien, H

2O

2 (lähde oksidatiivisen stressin) ja 5-fluorourasiilin (5-FU, kemoterapeuttinen lääke) mitattiin. Soluproliferaatiomäärityksiä (kuvio 1 D) paljasti, että eloonjäämisaste on 60 ± 14% ja 42 ± 8% PC3-solujen käsittelyn jälkeen 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU vastaavasti, olivat merkittävästi suurempia kuin vastaava eloonjäämislukuja 17 ± 4% ja 3 ± 1,6% androgeeni-herkkien LNCaP.

HIF1α knockdown Vähentää Cell Survival ja muutto PC3 Cells

Sen varmistamiseksi, että elonjäämisetua ja migraatio PC3-solujen johtui enemmän HIF1α proteiinin ilmentymistä, ilmaus HIF1α PC3-soluissa, joka pudotettiin käyttäen shRNA vektoreita. Transfektio PC3-soluja vektorilla, joka ekspressoi HIF1α shRNA vähensi HIF1α proteiinin ekspressio 12 ± 3% klooni 1 ja 16 ± 3% kloonissa 2 verrattuna villin tyypin PC3-soluja (100%) (kuvio 2A). VEGF, alavirran tuote HIF1α, oli myös vähentynyt HIF1α pudotus kloonit, vahvistetaan vähennys HIF1α aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty). Havainto, että ei ollut eroa pohjapinta leviämisen nopeus välillä HIF1α shRNA ilmentäviä PC3-soluissa ja PC3-solut transfektoitu salatun ohjaus vektori on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että ei ollut korrelaatiota suurempaa HIF1α ilmaisun ja proliferaationopeus (kuvio 1 B). Sen jälkeen H

2O

2 hoitoa vain 22,5 ± 3%: n HIF1α pudotus PC3-soluja (shRNA klooni 1) säilynyt verrattuna 58,5 ± 10% eloonjääneitä muokatussa kontrollivektorille transfektoiduissa PC3-soluissa (kuvio 2B). Samoin 5-FU vähensi solujen eloonjäämistä 27 ± 2% HIF1α pudotus solujen, verrattuna 62 ± 9% solujen selviytymistä PC3-soluissa, jotka on transfektoitu salattu kontrollivektorilla. Ei ollut merkittävää muutosta ilmentymisen HIF1α hoidon jälkeen PC3-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus shRNA 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU verrattuna käsittelemättömiin PC3-soluja (kuvio 2C). Oli kuitenkin 2,3 ± 0,2-kertaisesti ja 6,6 ± 1-kertainen nousu ilmentymisen HIF1α hoidon jälkeen PC3-solujen kanssa 1% O

2 tai 300 uM CoCl

2, vastaavasti (kuvio 2C). Kuten kuviossa 2A perusilmennystä HIF1α in HIF1α shRNA ilmentävät PC3-soluja ei ole havaittavissa, ja siksi ei ole mahdollista määrittää hoidon vaikutusta 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU HIF1α shRNA ilmentäviä PC3 klooneja.

(A) HIF1α pitoisuudet pienenivät 2 erillisessä klooneja PC3-solujen seuraavista stabiili ilmentyminen HIF1α shRNA arvioimana Western blot. Arvot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä koetta ja ne ilmaistaan ​​prosentteina villityypin PC3-soluissa. *, P 0,05 verrattuna villityypin PC3-soluissa. (B) selviytyminen PC3-solujen altistumisen jälkeen oksidatiivista stressiä (vetyperoksidia (H

2O

2)) tai chemotoxicity (5-fluorourasiilin (5-FU) 24 tuntia pienensi HIF1α pudotus verrattuna salattu kontrollivektorilla transfektoidut PC3-solut. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM vähintään kolme erillistä koetta ja ne ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömän sekoitetun kontrollivektorilla transfektoidut PC3-soluissa. #, P 0,05 vs. kontrolli. (C) HIF1α proteiinin ilmentymistä PC3-solut transfektoitu ohjaus shRNA käsittelyn jälkeen 1% O

2, 300 uM CoCl

2, 100 uM H

2O

2, ja 15 uM 5-FU. Solulysaatteja elektroforeesissa SDS -polyacrylamide geelit ja blotattiin HIF1α vasta-aineen. GAPDH ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. Western-blotit Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmea erillistä koetta. Band tiheydet määritettiin densitometrisellä analyysi HIF1α /GAPDH ja ne esitetään suhteessa arvoa käsittelemättömän soluja. tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM; * p 0,05 vs. käsittelemätön PC3-soluissa. (D) Valuuttojen muuttoliikkeen /miehityksen HIF1α knockdown PC3-solut vähenivät verrattuna salattu kontrollivektorille transfektoidut PC3-solujen arvioimana Transwell määrityksessä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä koetta ja ne ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömän sekoitetun kontrollivektorilla transfektoidut PC3-soluja. *, P 0,05 vs. kontrolli. (E) induktio HIF1α LNCaP-soluissa hypoksia (tumman harmaat tolpat) tai kobolttikloridia (vaaleanharmaa palkit) elonjäämisetua altistumisen jälkeen oksidatiivista stressiä H

2O

2 tai chemotoxicity 5-FU 24 tuntia verrattuna ohjata LNCaP-soluja (mustat palkit). Arvot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä hoitoja ja ne ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien LNCaP-ohjaus. # P 0,05 versus käsitelty LNCaP. *, P 0,05 versus LNCaP käsiteltiin 1% O

2 ja 5-FU. (F) HIF1α proteiinin ilmentymistä LNCaP käsiteltiin 1% O

2 ja 300 uM CoCl

2 yhdessä joko 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU. Solulysaatit eroteltiin elektroforeesilla SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja blotattiin HIF1α vasta-aineella. GAPDH ilmaisua käytettiin latauskontrollina. Western-blotit Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmea erillistä koetta. Band tiheydet määritettiin densitometrisellä analyysi HIF1α /GAPDH ja esitellään suhteessa arvo normoxic solujen käynnissä saman kohtelun. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM; * P 0,05 vs. käsittelemätön kontrolli, 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU käsiteltyjen LNCaP.

Aiemmin 1,8 kertaa suurempi maahanmuuttoluku havaittiin PC3-soluissa verrattuna androgen-herkkien LNCaP. Sen määrittämiseksi, onko tämä ero oli välittämä HIF1α, kulkeutumista HIF1α Knockdown ja kontrollivektorille transfektoidut-PC3-soluissa verrattiin. Knockdovvn HIF1α ilmentymisen RNA-interferenssi laski PC3 siirtyminen 37 ± 10% (klooni 1) ja 14 ± 7% (klooni 2), verrattuna kontrolliryhmään vektori transfektoidaan-PC3-soluja (100%) (kuvio 2D).

induktio HIF1α LNCaP solut Lisäykset Cell Survival

onko induktio HIF1α ilmentymistä androgen-herkkien LNCaP-solut voivat lisätä selviytymisen hoidon jälkeen sytostaattien, HIF1α ilmentyminen indusoitiin käyttämällä joko hypoksian (1 % O

2) tai hypoksia jäljittelevää kobolttikloridia (kuvio 2E). Inkubointi LNCaP joko 100 uM H

2O

2 tai 15 uM 5-FU vähensi selviytymisen 17 ± 4% ja 26 ± 2%: lla verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (100%). Kuitenkin eloonjäämisluvut läsnäollessa 100gM H

2O

2 seuraava hoito LNCaP joko 1% O

2 tai kobolttikloridia kasvoi 40 ± 8% ja 49 ± 11%: lla. Selviytyminen (113 ± 23%) ja LNCaP käsiteltiin 300 uM CoCl

2 yhdistettynä 15 uM 5-FU oli huomattavasti korkeampi verrattuna eloonjäämisen (54 ± 10%) havaittiin LNCaP käsiteltiin 1% O

2 yhdistettynä 15 uM 5-FU. Kiinnostavaa kyllä, 300 uM CoCl

2 yhdessä 15 uM 5-FU indusoi hieman korkeampi 3,3 ± 0,5-kertainen HIF1α ilmentymisen LNCaP-soluissa verrattuna 2,1 ± 0,4-kertainen lisäys indusoi 1% O

2 yhdistettynä 15 uM 5-FU, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 2F).

Lisääntynyt Käännös tehokkuus HIF1α mRNA vastaa HIF1α yliekspressio PC3 Solut

Vaikka sääntelyn käännöksen mukaan 5’UTR on tärkeä mekanismi posttranskriptionaalisen geeniekspression säätelyä, käännös tehokkuutta HIF1α mRNA eturauhasen soluissa ei ole raportoitu aikaisemmin. Kuten kuviossa 3A esitetään suhde

Firefly

on

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus transfektion jälkeen ja HIF1α 5’UTR-luc-reportterin ja pTK-Renillaa kontrollivektoreihin oli 20 ± 3-kertaiseksi ja 26 ± 3-kertaisesti LNCaP ja PC3-soluja, vastaavasti, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjä pGL4 vektori. Kuitenkin lusiferaasin mRNA: n ilmentyminen oli 33 ± 1,4-kertaisesti LNCaP ja 9 ± 2,1-kertaisesti PC3-soluissa verrattuna tyhjään pGL4 vektori-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3B). Edelleen käännös tehokkuutta HIF1α mRNA PC3-soluissa oli 2,9 ± 0,4 kertaa suurempi kuin LNCaP kun arvioitiin käyttämällä indeksiä Lusiferaasiaktiivisuuden /suhteellinen mRNA sisältöä (kuvio 3C).

(A)

Firefly

ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet eturauhassyövän soluissa transfektion HIF1α 5’UTR-lusiferaasi-konstrukti ja pTK-Renilla-ohjaus toimittaja vektorin määritettiin käyttämällä kahta lusiferaasianalyysissä. (B) Reaaliaikainen PCR (RT-PCR) analyysi lusiferaasin mRNA: n PC-soluissa, jotka on transfektoitu HIF1α 5’UTR-lusiferaasi-konstrukti. Transfektion jälkeen RNA eristettiin, ja lusiferaasin mRNA ilmaisun havaitsee reaaliaikaisen RT-PCR ja normalisoidaan 18S mRNA ilmaisu. (C) translationaalisen tehokkuuden edustaa suhdetta

Firefly Twitter /

Renilla

lusiferaasiaktiivisuuteen jaettuna suhteellinen lusiferaasin mRNA pitoisuus PC soluissa. Translationaalinen tehokkuus lusiferaasin mRNA vetämänä 5’UTR alueen HIF1α PC3-soluissa on suurempi kuin LNCaP. Arvot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolme erillistä koetta. *, P 0,05 versus käsitelty LNCaP.

HIF1α Protein Expression in Human Eturauhassyöpä Kasvaimet

Sata ihmisen PC näytteet jaettiin kahteen ryhmään niiden Gleason (≤ 7 (38) ja 7 (62), taulukko 1) ja HIF1α tila. Ilmentyminen HIF1α arvioitiin immunohistokemiallisesti (kuvio 4A). Kuva 4A (a) esittää positiivisen, ja kuvio 4A (b) negatiivisesti, HIF1α värjäytyminen kahdessa tyypillisessä kasvaimissa Gleason pisteet 9 (Inset laatikko, X20 view). Kuvio 4A (c) osoittaa positiivinen, ja kuvio 4A (d) osoittaa, negatiivinen (d), HIF1α värjäytymistä kaksi tyypillistä kasvaimissa Gleason viereen 6. Positiivinen värjäytyminen PC3-soluissa (kuvio 4A (e)) ja negatiivisen värjäyksen LNCaP soluja (kuvio 4A (f)) ja HIF1α taintumisen PC3-solut (kuvio 4A (g)) osoitti spesifisyys HIF1α vasta-ainetta. Lisäksi, HIF1α ilmaistiin kasvaimen koko lisääntynyt ekspressio pääasiassa eturauhasen rauhasten (nuolella kuviossa 4A (a)) ja imusolmukemetastaaseja (nuolella kuviossa 4A (h)). Vuonna positiivisissa näytteissä HIF1α ilmentyminen oli homogeeninen koko kasvaimen alueella.

(A) edustaja immunohistokemiallisesti tulokset osoittavat ilmentymisen HIF1α eturauhassyövässä yksilöiden ja solulinjoissa. Positiivinen (Aa) ja negatiivinen (Ab) värjäyksiä HIF1α havaittiin kahden tyypillisen kasvaimissa Gleason pisteet 9 (Inset laatikko, X20 view).