Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC17 on tyypin 1 kalvoon sitoutunut glykoproteiini, ilmentyy pääasiassa ruoansulatuskanavan. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava yliekspressio MUC17 korreloi pahanlaatuistumisriskin haimatiehyen adenokarsinoomat (PDACs); kuitenkin, tarkka sääntely mekanismia MUC17 ilmaisu ei ole vielä tunnistettu. Täällä tarjoamme ensimmäinen raportti MUC17 sääntelymekanismi hypoksiaolosuhteissa, olennainen piirre kasvaimen microenvironment ja voima syövän etenemisen. Meidän tietojen mukaan MUC17 merkittävästi indusoitiin hypoksinen stimulaation kautta hypoksian indusoituva tekijä 1α (HIF1α): sta riippuvainen reitin tietyissä haiman syöpäsoluja (esim AsPC1), kun taas muut haimasyövän soluja (esim BxPC3) osoitti vähän vastaus hypoksia . Mielenkiintoista, nämä matalan reagoiva soluilla on erittäin metyloitua CpG-motiiveja sisällä hypoksian reagoivan elementin (HRE, 5′-RCGTG-3 ’), sitoutumiskohdan HIF1α. Siten tutkimme demetylaation vaikutuksia CpG klo HRE on hypoksinen induktioon MUC17. Käsittelemällä matalassa reagoivien solujen 5-atsa-2’-deoksisytidiini liittää täydentäviä hypoksinen inkubaatio johti palauttamisessa hypoksinen MUC17 induktio. Lisäksi DNA metylaatio HRE haiman kudoksista sairastavien potilaiden PDACs osoitti korkeampi hypometylaatio asemaan verrattuna ei-syöpäkudoksiin ja hypometylaatio myös korreloi MUC17 mRNA ilme. Yhdessä nämä havainnot ehdottivat, että HIF1α-välitteisen hypoksinen signaalireitin edistää MUC17 ekspression ja DNA: n metylaation HRE voisi olla tekijä, hypoksia indusoituvuus MUC17 haiman syöpäsoluissa.

Citation: Kitamoto S, Yokoyama S, Higashi M, Yamada N, Matsubara S, Takao S, et ai. (2012) Expression of MUC17 säätelee HIF1α välittämä Hypoxic Vastaukset ja Vaatii Metylaatiospesifinen Free Hypoksia Vastaava Element Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (9): e44108. doi: 10,1371 /journal.pone.0044108

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 helmikuu 2012; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2012; Julkaistu: 10 syyskuu 2012

Copyright: © Kitamoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Princes Takamatsu Cancer Research Fund S. Yonezawa; Apurahat-in-tuki tieteellisen tutkimuksen tieteellisen tutkimuksen (B) 23390085 S. Yonezawa; Tieteellinen tutkimus (C) 21590399 M. Higashi; Nuorten tutkijoiden (B) 24701008 S. Yokoyama; Tieteellinen tutkimus prioriteettialuetta 239349 S. Kitamoto (JSPS Fellowship) alkaen opetus-, tiede-, urheilu, kulttuuri ja tekniikka, Japani; haima Research Foundation Japanin S. Yokoyama; ja Kodama Memorial Foundation, Japani M. Higashi. S. Batra tukee osittain National Institutes of Health avustusten (CA78590, CA163120, CA133944 ja CA111294). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi aggressiivinen syövän muotoja. Koska sen aggressiivinen kasvu ja metastaattisen ominaisuudet, yleinen eloonjäämisaste potilaiden haimasyöpä on 3-5% [1]. Suonettoman morfologia on tärkeä ominaisuus haimasyövän, mikä huonontaa veren ja hapen saanti. Niinpä haimasyövän sisältää syöpäsolujen ovat alhaiset happi jännitteitä, tilaa kutsutaan hypoksia. Kertyvät näyttö osoittaa, että hypoksinen kasvain microenvironment on läheisesti korreloivat kiinteiden kasvainten ominaisuuksiin kuten invaasio, etäpesäke, ja huono vaste syöpähoitoihin [2], [3]. Tässä suhteessa, hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF1α) on todettu olevan keskeinen säätelijä hypoksia vasteen, aktivoimalla eri syöpään liittyvien geenien, kuten VEGF: n, Caix, ja GLUT1.

Musiinit ovat voimakkaasti

O

-glycosylated proteiineja löytyy limakerroksen, ja ne ilmentyvät eri solun pinnalla monia epiteelin. Ne ovat vastuussa fyysisten ominaisuuksien limaa geelit ja osallistuvat epiteelisolujen suojelua ja ylläpitoa paikallisen molekyyli mikroympäristö [4], [5], [6], [7]. Sen sijaan on olemassa myös yhä enemmän todisteita siitä, että musiineilla ovat poikkeavasti ilmaistu erilaisia ​​syöpiä, ja ne ovat sekaantuneet pahanlaatuisiksi sekä kasvainsolujen lisääntymistä, eloonjääntiä, invaasio, ja etäpesäkkeiden [8], [9], [10]. Tässä yhteydessä, viimeaikaisissa tutkimuksissa kävi ilmi, että tietyt membraaniin sitoutunut musiineja ovat riittävät indusoimaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon ja siten ovat houkuttelevia kohteita syöpähoidon [11], [12].

MUC17 glykoproteiini oli tunnettu siitä, kun kalvoon sitoutunut musiinia [13]. RNA-blot-analyysi osoitti, että

MUC17

ilmentyy pääasiassa ruoansulatuskanavan, mukaan lukien pohjukaissuoli, sykkyräsuoli, ja poikittaisen paksusuolen [13], [14]. Fysiologisissa olosuhteissa, on ehdotettu, että endogeenisen MUC17 on tärkeä rooli solujen palauttamista prosessien ja edistää paksusuolen limakalvon suojaus [15], [16]. Moniaux et ai. raportoitu että MUC17 oli poikkeuksellisesti ilmaistu haimatiehyen adenokarsinoomat (PDACs) verrattuna sen puute ilmentymisen normaalissa haimassa tai haimatulehdus [17]. Lisäksi Hirono et ai. Lisäksi on raportoitu, että MUC17 on itsenäinen ennustetekijä liittyy imusolmuke etäpesäke PDACs [18]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että MUC17 voi olla tärkeä rooli haimasyövän etenemiseen. Mitä sääntelyn mekanismi MUC17, meidän edellinen tutkimus ehdotti, että epigeneettiset muutokset, mukaan lukien CpG-DNA: n metylaation ja histonimodifikaation H3-K9 että MUC17 proksimaalisen promoottorin ovat keskeisiä tekijöitä MUC17 ilmaisun [19]. On kuitenkin vielä epäselvää, minkälaisia ​​transkriptiotekijöitä rekrytoidaan sen MUC17 promoottori ja osallistuvat säätelyyn MUC17 ilmaisun.

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme ensimmäinen todiste kuvaava sääntelyn mekanismi MUC17 vuonna hypoksinen kasvain microenvironment. Tuloksemme osoittavat, että MUC17 indusoidaan HIF1α välittämällä hypoksinen vastauksen, ja erityiset DNA metylaation määrittää hypoksinen indusoituvuus MUC17 haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Ihmisen haiman kasvainten kudokset saatiin Kagoshima University Hospital, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET. Tutkimus hyväksyi eettisen komitean Kagoshima yliopistollisen sairaalan.

Haimasyöpä solulinjoissa ja ihmisen kudosnäytteiden

Ihmisen haiman sinoomasolulinjoja AsPC1, BxPC3, HPAFII, ja PANC1 ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). BxPC3 ja AsPC1 soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO, USA.). HPAFII soluja viljeltiin Eaglen minimum essential väliaineessa (Sigma). PANC1 soluja viljeltiin D-MEM (Sigma). Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja 100 U /ml penisilliiniä /100 g /ml streptomysiiniä (Sigma). Hypoksinen viljelyolosuhteet saavutettiin usean kaasun yrityshautomo sisältävä kaasuseos, joka koostuu 94% N

2, 5% CO

2, ja 1% O

2 (ASTEC, Japani). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ellei toisin mainita.

RNA ja RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) ja kvantifioitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). RT-PCR, saatu mRNA käänteiskopioitiin cDNA: High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet myöhemmin PCR on esitetty taulukossa S1. PCR suoritettiin AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa.

Proteiinin uutto ja Western blotting

Soluja viljeltiin 6 cm astioita hypoksisissa edellytykset niiden nimetty kertaa. Kokosoluliuotteista valmistettiin käyttäen RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Nacalai Tesque, Japani). Sen jälkeen kvantitointiin BCA määrityksellä (Thermo Scientific), yhtä suuret määrät ratkaistiin 3-8% SDS-PAGE ja siirrettiin sähkön PVDF kalvoja. Sillä MUC17 ilmentymisen analyysi, proteiini- lysaatit eroteltiin 2% agaroosigeeleillä, jotka sisältävät SDS: ää ja passiivisesti siirretään PVDF-membraaneille ja niitä inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa. Membraanit blokattiin 1% rasvaton maito /PBST: ssä 2 h, ja altistettiin standardin immunologinen menettelyä käyttäen spesifisiä ensisijainen vasta-aineita. Ensisijainen vasta-aineet olivat seuraavat: anti-ihmisen MUC17 (kani pAb, 1:1000, syntyy yksi kirjoittajista, tohtori Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE, USA); anti-ihmisen HIF1α (hiiren mAb, 1:1000, H1alpha67, Novus Biologicals), ja anti-ihmis-α-tubuliinin (hiiren mAb, DM1A, Sigma).

RNA-interferenssi

RNA häiriö (RNAi) kokeista,

HF1A

ilmentyminen hiljennettiin käyttäen on-Target plus siRNA (Dharmacon) mukaan valmistajan ohjeiden. On-Target plus siControl kuin kohdistaminen siRNA käytettiin kontrollina. AsPC1-soluja siirrostettiin 6-cm: n maljoihin, ja 50-60% konfluenssiin, ne transfektoitiin 13,6 nmol /L siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Dual-Luciferase Reporter Assay

5 ’reunustavan sekvenssin (-687-53) ihmisen MUC17 monistettiin käyttäen genomista DNA: ta eristettiin AsPC1 soluja. PCR-fragmentti pilkottiin Nhel: llä ja Xhol: llä ja kloonattiin pGL4.17-vektoriin (Promega). Tuottaa HRE mutantteja ihmisen MUC17 promoottorin, QuikChange Salama Site-Directed Mutagenesis Kit käytettiin (Stratagene). Alukesarjat on esitetty taulukossa S1. Jotta kahden lusiferaasireportterigeenin määritys, AsPC1 solut ympättiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 1 x 10

5 solua /kuoppa ja transfektoitiin väliaikaisesti 75 ng: aan lusiferaasireportteriplasmidi käyttäen JetPEI (Polyplus Transfektio) mukaisesti valmistajan protokollaa. Sitten lusiferaasiaktiivisuuden kokosoluliuotteista määritettiin 24 tunnin kuluttua käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) on Tristarin multimode mikrolevylukijalla LB 941 (Berthold Technologies). Renilla lusiferaasireportterigeenin ilmaistaan ​​pGL4.74 vektori samanaikaisesti transfektoitiin sisäisenä kontrollina.

Kromatiini immunosaostuksella

kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määritys tehtiin käyttäen Katkaisu-ChIP kit ja OneDay ChIP kit (Diagenode, Philadelphia, PA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti nukleoproteiinikompleksien sonikoitiin vähentää DNA-fragmenttien kokoja 300-500 bp käyttämällä Bioruptor (Cosmo Bio). Yksi mikrogramma normaalin hiiren lgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina, ja hiiren anti-humaani HIF1α-vasta-ainetta käytetään kunkin immunosaostus. Immunopresipitoidun DNA monistettiin PCR: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu. Siru alukkeet suunniteltiin kohdistaa HRE paikalla MUC17 promoottorin. Alukkeet myöhemmin PCR on esitetty taulukossa S1. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C 5 min, 34 sykliä 96 ° C: ssa 5 s, 59 ° C: ssa 5 s ja 68 ° C: ssa 7 s, ja lopullinen laajennus 72 ° C 1 min. Monistetut tuotteet alistettiin 1,0% agaroosigeelielektroforeesilla.

DNA metylointianalyysi

CpG demetylaation analyysiä, AsPC1 soluja inkuboitiin 1 uM 5-azadC (Sigma) 7 päivää. Lopussa hoidon, DNA: n ja proteiinin uutettiin metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja Western-blottauksella. DNA: n uutto ja MSP suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Lyhyesti, kokonais-DNA solulinjoista ja kudoksista uutettiin käyttäen DNeasy Tissue System (Qiagen). Bisulfiittimodifikaatio genomisen DNA: n (2 ug) suoritettiin käyttäen Epitect bisulfiitin Kit (Qiagen), ja yhtä suuret määrät muunnettua DNA: ta monistettiin PCR: llä käyttämällä AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems). Spesifisyys MSP-alukkeiden vaikuttaa suuresti termodynaamisen ominaisuudet 3′-pään ehdotetun aluketta. Siten asetamme Sytidiinitähteen CpG sisällä HRE kuin 3 ’päähän MSP aluketta. U aluke on suunniteltu monistamiseen natriumbisulfiittia muunnetaan DNA metyloimattoman kunnossa, kun taas M pohjamaali on spesifinen natriumbisulfiittia muunnetaan metyloitua DNA: ta. HRE kohdistetut alukeparit on esitetty taulukossa S1. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 96 ° C: ssa 5 s, 59 ° C: ssa 5 s ja 68 ° C: ssa 5 s, ja lopullinen laajennus 72 ° C 1 min. Monistetut tuotteet alistettiin 1,0% agaroosigeelielektroforeesilla.

tutkimiseksi edelleen korrelaation MUC17 ilmentymisen metylaatiostatuksen biologisista näytteistä, haiman kasvainten kudokset saatiin kirurgisesti resektoitiin haiman näytteet 10 potilasta, joiden PDAC . Normaali haiman kudoksista saatiin samoilla potilailla alueilta kaukana kasvain. Kaikki kudosnäytteet säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Suorittaa MSP ja RT-PCR, kokonais-DNA ja RNA eristettiin kudoksista ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu. Bändit saatu MSP ja RT-PCR kvantitoitiin Image J suur, ja suhteellinen taso unmethylation kussakin näytteessä laskettiin indeksinä unmethylation tilan käyttämällä yhtälöä (%) = U /(U + M). Korrelaatio MUC17 mRNA: n ilmentymisen kanssa metylaatiostatuksen HRE analysoitiin käyttäen Spearmanin testiä.

Tilastollinen analyysi

lusiferaasireportteri ja siru määritykset, tilastolliset erot määritettiin käyttäen kaksipuolista opiskelijan

t

-testi. Tutkia korrelaatio HRE metylaatiostatuksen ja MUC17 ilmaisun kudosnäytteistä, Spearmanin testi suoritettiin käyttäen tilastollista ohjelmistoa R versio 2.12.2. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

ilmentyminen MUC17 lisääntyy hypoksiaolosuhteissa haiman syöpäsoluissa

vaikutuksen tutkimiseksi hypoksisen altistuminen MUC17 ilmaisun, me viljellä ihmisen haimasyövän soluja AsPC1 hypoksisissa viljelyolosuhteissa (1% O

2) ja 2 päivää. RT-PCR-analyysi, ilmaus MUC17 ja Caix, hypoksinen merkki, lisääntyi merkitsevästi, kun taas HIF1α mRNA-tasot olivat stabiileja hypoksisissa olosuhteissa, mikä vahvistaa aiemmin raportoitu posttranskriptionaalisella asetuksen HIF1α [20]. Western blotting käytettiin myös tutkimaan MUC17 proteiinin taso, ja se paljasti merkittävä induktio MUC17 ja HIF1α ilmaisun ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 1A ja 1 B). Tähän mennessä HIF1α tunnetaan keskeinen säätelijä hypoksinen vasteen moniin syöpiin. HIF1α sitoutuu hypoksia reagoivan elementin (HRE, 5′-RCGTG-3 ’), joka on sitoutumiskohdan HIF1α, ja transaktivoi monet hypoksia-reagoiva geenejä, mukaan lukien VEGF, GLUT1, ja Caix. Teimme sekvenssianalyysi noin 3,0 kb: n MUC17 promoottorin Matlnspector-ohjelmisto (Genomatix) ja löysi oletetun HRE (+ 37 /+ 41) proksimaalisessa promoottorialueen MUC17. Niinpä arveltu, että MUC17 yliekspressio hypoksisissa olosuhteissa välittää HIF1α. Jotta voidaan tutkia vaikutusta hypoksia transkriptionaalisen aktiivisuuden MUC17 promoottorin, konstruoimme MUC17 promoottori-lusiferaasireportteri- vektori, joka sisältää HRE päällä. Hypoksisissa olosuhteissa, AsPC1 solut transfektoitiin tällä konstruktilla osoitti huomattavasti reportterin aktiivisuutta (kuvio 1C), mikä viittaa siihen, että parantamiseksi MUC17 ilmaisun hypoksisissa olosuhteissa johtuu kasvu transkriptionaalista aktiivisuutta.

(A) AsPC1 solut viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2) varten osoitetut ajat. MUC17 mRNA: n ekspressio tutkittiin RT-PCR: llä kunakin ajankohtana. (B) AsPC1 soluja viljeltiin alle normoxic tai hypoksinen edellytykset ilmoitettu kertaa. Solulysaatit tutkittiin anti-MUC17, HIF1α, ja α-tubuliinin vasta-aineiden Western blot-analyysi. Intensiteetit nauhojen kvantitoitiin densitometrinen skannaus, ja suhde MUC17 a-tubuliinia ilmentyminen on esitetty kunkin kaistan suhteellinen intensiteetti verrattuna saatu normoxic AsPC1 soluissa. (C) MUC17 promoottorin aktiivisuus mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay. Transfektion jälkeen MUC17 reportteriplasmidilla, AsPC1 soluja inkuboitiin normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 24 tuntia. Solulysaatit analysoitiin käyttämällä lusiferaasianalyysissä pakki Tristar monimuoto mikrolevylukijalla LB941 (Berthold Technologies). Transformaatiotehokkuus normalisoitui perusteella Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Promoottori mukaista toimintaa happiolosuhteissa sai arvon 1. P-arvot määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testi. * P 0,05.

Hypoxic induktio MUC17 säätelee HIF1α riippuvan signaalireitin

Sen tutkimiseksi, onko HIF1α todella osallistuu hypoksinen induktion MUC17, me tutkittiin, mikä vaikutus HIF1α hiljentäminen on hypoksinen MUC17 induktioon AsPC1 soluissa käyttämällä siRNA. Hypoksiaolosuhteissa, ohjaus siRNA ollut vaikutusta transkriptio MUC17, HIF1α, Caix, ja ß-aktiini. Päinvastoin, käsittely siRNA: t kohdistaminen HIF1α johti merkittävä lasku hypoksinen MUC17 induktion sekä Caix (kuvio 2B). Sama tulos havaittiin proteiinin taso (kuvio 2B), mikä osoittaa, osallistuminen HIF1α on hypoksinen MUC17 induktioon.

(A) jälkeen transfektion HF1A siRNA: iden, AsPC1 soluja viljeltiin normoksia (N) tai hypoksia (H) 24 tuntia. MRNA: n tasoon mitattiin RT-PCR: llä. (B) Solulysaatit AsPC1 soluja käsiteltiin HF1A siRNA: t immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. α-tubuliinin toimi latauskontrollina. (C) tiheydet hankitun bändejä Western blotting -analyysi kvantitoitiin ja ilmaistaan ​​suhteellisina kertaisesta verrattuna saatu mock-solut hypoksisissa viljelyolosuhteissa. ns, ei ole merkittävä. * P 0,05, ** P 0,005.

Hypoksia parantaa rekrytointia HIF1α HRE ja aktivoi MUC17 transkriptio

arvioimiseksi osallistumista HIF1α vuonna MUC17 transkription säätelyyn, me suoritetaan ChIP määrityksissä. Tuloksena ilmeni, että anti-HIF1α vasta-aineen merkittävästi rikastettu MUC17 promoottorin fragmenttien kätkeminen HRE hypoksisissa olosuhteissa, mutta jotka eivät kuulu happiolosuhteissa (kuvio 3A ja 3B). Lisäksi testasimme HRE oli todellakin välttämätöntä hypoksian indusoimaan MUC17 transaktivaation. Reportterivektoreita mutaatioita tällä HRE sivuston rakennettiin ja transfektoitiin AsPC1 soluihin hypoksisissa olosuhteissa. Kuten kuviossa 3C, solut transfektoitiin joko mutantti vektoreilla näytteillä vähensi transaktivaation verrattiin villityypin promoottorikonstruktiin-transfektoituja soluja, mitkä olennaiset roolia HRE sivuston hypoksinen MUC17 induktio.

(A) sitoutuminen HIF1α kromatiinin vahvistettiin siru määrityksellä. AsPC1 soluja viljeltiin normoksia tai hypoksia 24 tuntia. PCR suoritettiin spesifisillä alukkeilla kattaa HRE. (B) tiheydet Hankitun bändejä paneelissa (A) kvantitoitiin käyttäen Image J (NIH) ja normalisoitiin Input Jokaisessa kokeessa. (C) arvioimiseksi transaktivaatiota aktiivisuuden HIF1α kautta HRE, kaksi Lusiferaasimääritys suoritettiin. AsPC1 solut transfektoitiin villityypin tai HRE mutantti MUC17 promoottorikonstrukteja hypoksisissa olosuhteissa 24 tuntia. P-arvot määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testi. ns, ei ole merkittävä. * P 0,01, ** P 0,001.

Differential ekspressiokuviota MUC17 aiheuttama hypoksia erilaisissa haimasyövän solulinjoissa

Lisäksi arvioimme onko hypoksinen induktio MUC17 on universaali tapahtuma haiman syöpäsoluja. Muihin solulinjoja (BxPC3, HPAFII, ja PANC1) viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa on 2 päivää, ja mRNA: n ilmentymisen tasoja seurattiin. Tulokset paljastivat, että MUC17 ekspressiotasot AsPC1 ja HPAFII solut huomattavasti hypoksisissa olosuhteissa. Sitä vastoin, vain heikko kasvu havaittiin BxPC3 ja PANC1 soluja (kuvio 4A). Tässä yhteydessä olemme viime aikoina raportoitu, että DNA hypometylaatio on avaintekijä MUC17 ilmentymistä haimasyövän (kuva 4B). Mielenkiintoista, AsPC1 ja HPAFII soluja, jotka osoittivat merkittävä MUC17 induktio hypoksiaolosuhteissa, näkyy lähes kokonaan metyloitumattoman HRE (nro 13) sisällä MUC17 promoottori, kun taas BxPC3 ja PANC1 solut olivat erittäin metyloitua hRes [19]. Niinpä arveltu, että DNA metylaatiostatuksen HRE määrittelee MUC17 induktio vastauksena hypoksia.

(A) Differential ekspressiokuviota MUC17 aiheuttama hypoksinen altistuminen haimasyövän solulinjoissa. Kukin haiman solulinjaa viljeltiin normoxic (N) tai hypoksinen (H) olosuhteissa. MRNA: n määritettiin RT-PCR: llä kunakin ajankohtana. (B) Ihmisen MUC17-geenin promoottorisekvenssin, joka ulottuu kantoja -687-302 suhteessa transkription aloituskohdasta. Numerot CpG kohdat on alleviivattu. HRE sivusto sisältää CpG (nro 13).

DNA metylaatiotilan HRE määritti hypoksian indusoituvuus MUC17 ilmaisun

tutkimiseksi osallistuminen DNA metylaation HRE vuonna MUC17 ilmaisu hypoksisissa olosuhteissa, käsittelimme BxPC3 ja PANC1 solujen 5-AzadC (DNA demetyloivan aine) ja 7 päivää, ja soluja inkuboitiin vielä 24 tunnin ajan normoksia tai hypoksia. Ensin vahvisti demetylaation vaikutus 5-AzadC käsittely HRE MSP (kuvio 5A). Sitten tutkimme MUC17 ilmentymistä soluissa, joita käsiteltiin 5-AzadC hypoksisissa olosuhteissa, jolloin palauttaminen MUC17 ilmentymisen vain soluissa, joita käsiteltiin 5-AzadC käsiteltäväksi hypoksian (kuvio 5B).

(A) demetylointi CpG sivustoja MUC17 promoottorin BxPC3 ja PANC1 solujen jälkeen 1 uM 5-azadC hoitoa. MUC17-negatiivinen /vähäinen solulinjoja käsiteltiin tai ei 5-azadC varten 7 päivää. Metylointi tila MUC17 promoottorin kätkeminen HRE tutkittiin MSP. PCR-tuotteet on merkitty M (metyloitu) monistettiin metylaatiospesifistä alukkeita, ja ne joita on merkitty U (metyloitumaton) monistettiin alukkeilla, jotka ovat spesifisiä metyloitumaton DNA. (B) Palauttaminen MUC17 ilmaisun haimasyövän solulinjoissa 5-azadC hoitoa. Soluja käsiteltiin tai ei 5-azadC varten 7 päivää. Viime 24 h, kukin ryhmä viljeltiin normoxic (N) tai hypoksinen (H) olosuhteissa. MUC17 ilmentyminen tutkittiin Western-blottauksella.

MUC17 ilmentyminen korreloi hypometylaatio on HRE promoottorialueella

Lisäksi, arvioida biologinen merkitys HRE: n metylaation MUC17 ilmaisun, tutkimme MUC17 ilmaisun ja metylaatiostatuksen normaaleissa ja haiman tuumori kudoksissa potilailla, joilla on PDACs RT-PCR: llä ja MSP, vastaavasti. Yhdenmukainen aiempien raporttien [17], [18], MUC17 mRNA ja proteiini yli-ilmentynyt PDAC (kuva 6A ja B). MSP-analyysi käyttäen 10 pariksi PDAC näytettä (ei-syöpä kudoksiin; n = 10, syöpäkudoksiin; n = 10), metyloimattomia signaalit merkittävästi havaittiin kudoksista PDAC verrattuna niihin, ei-syöpäkudoksiin (kaksi-tailed Studentin

t

-testi, P = 0,007). Tutkimme myös korrelaatio MUC17 mRNA ilmaisun ja metylaatiostatuksen HRE. Taso MUC17 mRNA voimakkaasti korreloi hypometylaatio tilan HRE sisällä MUC17 promoottorin haimasyövän (kuvio 6C).

(A) MUC17 mRNA ilmaisun ja HRE metylaatiostatuksen normaalissa haimassa (N) ja haiman tuumori kudoksissa (T) tutkittiin RT-PCR: llä ja MSP, vastaavasti. (B) edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä tiedot MUC17 sairastavalla potilaalla PDAC. Mittakaava, 100 pm. (C) Korrelaatio MUC17 mRNA: n ilmentymisen ja HRE metylaatiostatuksen analysoitiin Spearmanin testi. Tiheydet hankitun kvantitoitiin käyttäen Image J, ja suhteellinen määrä unmethylation kussakin näytteessä laskettiin indeksinä poikkeava unmethylation tilan yhtälön (%) = U /(U + M).

keskustelu

Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet ihmisen MUC17, joka yli-ilmenee PDACs, itsenäisenä ennustetekijä imusolmuke etäpesäke [17], [18]. Vaikka tiedetään vain vähän toiminnallista roolia MUC17 syövän ymmärtäminen sääntelyn mekanismi MUC17 voi olla tärkeä askel kehitettäessä uusia strategioita syövän diagnosointiin ja hoitoon.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet hypoksinen asetuksen of MUC17 haiman syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että MUC17 merkittävästi indusoi hypoksia ajasta riippuvalla tavalla, ja tämä säätelyä suoraan välittyy HIF1α. Lisäksi käytetään neljää solulinjojen eri MUC17 hypoksinen inducibilities pystyimme ehdottaa mallina epigeneettiset sääntelyn MUC17 haimasyövän. Ehdotamme, että DNA: n metylaatio on HRE estää HIF1α välittämää MUC17 transaktivaatiota soluissa matalalla MUC17 hypoksinen indusoituvuuden, kun taas progressiivinen hypometylaatio HRE mahdollistaa näkyvä kasvu MUC17 ilmaisun hypoksisissa olosuhteissa solujen korkea hypoksinen indusoituvuuden. On yhä enemmän todisteita siitä, että metylaatio CpG-sivustojen promoottorialueita vaikuttaa induktion geenin ilmentymisen HIF1α, oletettavasti rajoittamalla pääsyä transkriptiotekijöitä ja

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT elementtejä [21], [22]. Kuten on esitetty kuviossa 6, hypometylaatio HRE sisällä MUC17 promoottori on yleinen tapahtuma haiman potilaiden kudosten kanssa PDAC. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan valaista muita tekijöitä MUC17 ilmaisun, tämä voi selittää, miksi MUC17 yliekspressoituu haimasyöpä. Mitä puute Caix induktion PANC1 soluissa, on osoitettu, että Caix ilme on, ainakin osittain, säätelee paikkasidonnainen CpG hypometylaatio -74 bp promoottori munuaissolukarsinoomassa ja muut syöpäsolutyyppien [23] , [24], [25]. Näin ollen, tämä vaste voidaan myös vaikuttaa DNA metylaatiostatuksen HRE sisällä Caix promoottori.

On joitakin vaikutuksia huomioon toiminnallista roolia MUC17 syövän kehittymisessä. Vuonna kiinteitä kasvaimia, koska vapaan leviämisen syöpäsolujen ja riittämätön verisuonten muodostumista, hapenpuutteen (hypoksia) ja ravinteiden puutetta pidetään olennaiset piirteet kasvaimen microenvironment ja voima syövän etenemisen. Viime aikoina on raportoitu, että MUC1, jota on pidettävä myös hypoksian indusoituvan musiinigeenit, voisi edistää autophagy, joka tarjoaa selviytymisen etu matalan glukoosin korosti microenvironment kautta tukahduttaminen glukoosin puutteen aiheuttama nousu ROS tasoilla paksusuolensyöpä [26]. Lisäksi se on myös raportoitu, että stabiili transfektio pienten hiusneula-RNA kohdistaminen endogeenisen MUC17 paksusuolen syövän LS174T solut johti alentuneeseen soluaggregaation, vähentää solujen välistä sitoutumista ja muuttoliike sekä lisääntynyt alttius apoptoosiin [15]. Nämä havainnot osoittavat, että MUC17 saattaa olla joitakin toimintoja, kuten solujen vaeltamiseen, invaasio, vastustuskykyä apoptoosin ja sopeutuminen korosti mikroympäristöjen haiman syövän etenemisessä.

Muutokset DNA metyloinnin ovat yksi merkittävimmistä epigeneettiset muutokset ihmisen syövässä . Kasautuvan näyttöä siitä, että poikkeava DNA: n metylaatio havaitaan usein jo varhaisessa ja precancerous vaiheita ihmisen syövän synnyn, ja se voi olla merkki karsinogeenisia riskin varhainen diagnostinen markkeri syövän, ja biologinen ennustaja syövän pahanlaatuisten kasvainten [27], [ ,,,0],28]. On raportoitu, että epigeneettisiä muutoksia, mukaan lukien DNA: n metylaatio suurelta osaltaan ekspressiota ihmisen musiinia perheen geenien syöpää [19], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Zhu et al. ovat raportoineet poikkeava kasvu sekä ilmaisun ja hypometylaatio MUC4 aikana Panin-PDAC eteneminen [35]. Lisäksi olemme kehittäneet uuden menetelmän havaitsemiseksi DNA metylaation nimeltään MSE, joka mahdollisti havaitseminen muuttuneen metylaation haimanesteessä ja paljasti merkittävästi erilaiset metylaatiovyöhykkeiden MUC1 promottorista intraduktaalisissa papillaarikuvioiden mucinous kasvain ja PDAC, mikä osoittaa sen mahdollinen -diagnostiikkakäyttöön [36]. Vaikka tarvitaan lisätutkimuksia selventämään kliinis merkityksen ja tarkka mekanismit MUC17 ilmaisun, nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että metylaatio tila MUC17 promoottori on epigeneettisestä markkeri diagnoosia syöpäriskiä ja ennustaminen tuloksia potilailla, joilla on PDAC. Yhdessä meidän tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että MUC17 ilmaisua on parannettu HIF1α välittämä hypoksinen vasteen ja että DNA: n metylaatio on HRE on keskeinen tekijä hypoksia indusoituvuus MUC17 haimasyövän. Tulevaisuudessa merkitystä näiden havaintojen haimasyövän synnyssä selvitetään.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Synteettiset oligonukleotidit, joita käytetään tässä tutkimuksessa. Synteettiset oligonukleotidit listattu paikan numero suhteessa transkription aloituspaikan. MSP-analyysi, * tarkoittaa U alukkeena metyloitumattomien alleelien. ** Osoittaa M pohjamaali metyloidulle alleelien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0044108.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Ms Izumi Houjou ja Yukari Nishimura erinomaisesta teknisestä avusta.