Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

prostataspesifisen antigeenin (PSA) on perinteisesti käytetty indikaattorina läsnäolo eturauhassyöpä (PCA) ja sädehoito on yleensä käytetään käyttökelvottoman ja paikallisesti edennyt PCa . Kuitenkin miten solu PSA taso liittyy herkkyys Eturauhassyövän sädehoidon ei tunneta. Edellisessä havainto, että RelB-pohjainen NF-KB vaihtoehtoisen reitin differentiaalisesti säätelee PSA ja interleukiini-8 (IL-8) in aggressiivinen PCa on ohjannut huomiomme roolia RelB vastaukseen PCa sädehoitoon.

Menetelmät /Principal havainnot

RelB ja sen tavoitteet PSA ja IL-8 PCA solut manipuloida kohdunulkoinen ilmentymistä PCA solujen alhaisen endogeenisen tason RelB (LNCaP) ja RNAi-pohjainen knock-alas Eturauhassyövän soluja, joilla on korkea konstitutiivinen taso RelB (PC3). Vaikutukset RelB, PSA ja IL-8 vasteesta Eturauhassyövän sädehoitoa tutkittiin

in vitro

ja ksenograftikasvaimissa. RelB säätelee PSA ja IL-8 käänteisellä tavalla. Kun solu tasoa PSA ja IL-8 olivat suoraan moduloitu geenimanipulaatiot tai lisäämällä rekombinanttiproteiineja, tulokset osoittavat, että säätely ylöspäin IL-8 tehostettu radioresistance Eturauhassyövän soluja ja samanaikaisesti alassäädetty PSA. Sen sijaan säätely ylöspäin PSA johti pienentyneeseen radioresistance samanaikaisen alas-säätely IL-8.

Päätelmä /merkitys

RelB on keskeisessä asemassa vaste Eturauhassyövän ja sädehoidon ja käänteinen IL-8 ja PSA. Tulokset tunnistaa aikaisemmin tunnistamattomia suhdetta IL-8 ja PSA vasteen PCa solujen sädehoitoa.

Citation: Xu Y, Fang F, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) Inverse Suhde välillä PSA ja IL-8 in Eturauhassyöpä: Insight tulee NF-KB-välittyvä mekanismi. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10,1371 /journal.pone.0032905

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 07 helmikuu 2012; Julkaistu 5 maaliskuuta 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää CA 49797 on DKS ja CA 11580 on WHS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi yleisin maligniteetti Pohjois-Amerikassa ja toinen johtava syy syöpäkuolemista Yhdysvaltain miesten [1]. Seerumin PSA miehillä käytetään indikaattorina sairaus eturauhasen ja lisääntynyt PSA käytetään laajasti biomarkkerina Eturauhassyövän. Sädehoito on yleensä käytetään alkuvaiheen, käyttökelvottoman ja paikallisesti edennyt PCa. Kuitenkin, onko solu PSA voidaan käyttää indikaattoreina kasvaimen herkkyydelle sädehoitoon on tuntematon.

NF-KB: n, tulehdukseen reagoivan transkriptiotekijän, on tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja kestävyys hoidon aiheuttaman sytotoksisuuden [2] . Korkea konstitutiivinen taso NF-KB: syöpien on ollut mukana merkittävänä suojamekanismi syövän hoidossa [3]. Näin ollen NF-KB: n on pidettävä tavoitteeksi parantaa tehokkuutta tavanomaisen kemoterapian ja sädehoidon [4]. Olemme aiemmin osoittaneet, että yliekspressio RelB, NF-KB jäsen, tukahdutti PSA ilmentyminen androgeenien reagoiva LNCaP PCa soluja, mikä viittaa negatiivisen vaikutuksen NF-KB PSA ilmaisun [5]. Serendipitously olemme myös havainneet, että eläimillä, joissa RelB-yliekspressoitu LNCaP kasvaimia, veressä kiertävän IL-8 lisättiin.

IL-8, joka on NF-KB-aktivoitu sytokiini, on ajateltu olevan tärkeä tekijä kasvaimen etäpesäke ja kestävyys hoitoon [6] – [9]. Veressä kiertävän IL-8 on kasvanut kehittynyt PCa siinä vaiheessa, kun kasvain ei enää reagoi antiandrogeeni hoitojen [10]. Lisäksi IL-8 lisää PCa androgeenista riippumaton etäpesäke [11], [12]. Siten IL-8 voi olla merkittäviä ennusteen arvioinnissa PCA kasvun ja hoitovaste. Tässä tutkimuksessa selvitettiin roolit PSA ja IL-8 radioresistance Eturauhassyövän soluihin käyttämällä

in vitro

ja

in vivo

lähestymistapoja. Tulokset paljastavat aiemmin tunnistamaton rooli IL-8 ja PSA määrittäjinä herkkyys PCa sädehoitoon.

Tulokset

NF-KB up-säätelee IL-8 mutta down-regulation PSA PCA-soluissa

aktivointi NF-KB-reitin uskotaan olevan merkittävä tekijä kehitystä radioresistance syöpäsoluja. Koska RelA ja RelB ovat kaksi jäsentä NF-KB perheen löytyy PCA soluissa [13], määritimme vaikutuksia RelA ja RelB IL-8 ja PSA ilmaisun ja radioherkkyyttä käyttämällä useita lähestymistapoja aktivaatio ja inaktivaatio UE -κB kautta. Ensinnäkin, RelA tai RelB yliekspressoitui LNCaP-soluissa transfektoimalla sitä vastaavaan cDNA konstruktioita. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, tasot PSA laskivat sekä RelA ja RelB kun ne yli-ilmentyvät LNCaP-soluissa. Sen sijaan, tasot IL-8 lisättiin sekä RelA ja RelB. Vastaava vaikutus RelA ja RelB on radioresistance LNCaP-soluja oli suurempi yliekspressioon RelB.

käsitellä NF-KB: n toiminto, RelA ja RelB cDNA rakentaa (A), RelA ja RelB siRNA (B), ja RelA ja RelB tumaansiirtymiseen estäjät (IκBαM ja p100M) (C) transfektoitiin LNCaP ennen IR hoitoa. Tasot transfektoitujen proteiinien ja siihen liittyvä tavoite PSA kvantitoitiin Western blotit (yläpaneeli). Länsi kuvat normalisoitiin β-aktiini ja sitten normalisoidaan ajoneuvon ohjaus. Kertamuutoksia on osoitettu. IL-8 pitoisuudet mediassa kvantitoitiin ELISA kit (keskimmäinen paneeli). Solun eloon jäämisestä kvantitoitiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla määritys (alapaneeli). * (P 0,05) ja ** (p 0,01) osoittavat tilastollinen merkitykset verrattuna ainekontrolliryhmään.

Toiseksi endogeenisen RelA ja RelB LNCaP-soluja tippuu alas käyttäen RNA häiriö (RNAi) lähestymistapa. RelA siRNA tai RelB siRNA transfektoitiin LNCaP vaientaa ilmaisua. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, tasot PSA kääntäen korreloi alennettu tasolle sekä RelA ja RelB, vaikuttaen havaittu RelB. Tasot IL-8 valmistettiin samalla väheni RelA ja RelB tippuu alas soluissa, jolla on suurempi vaikutus RelA siRNA. Radioherkkyyttä LNCaP-solujen parantaa vähentämällä joko RelA tai RelB (Fig. 1 B). Solun eloonjääminen hallinnassa siRNA aleni 46,3%: iin sädehoitoa, kun taas solujen eloonjäämistä laskettiin edelleen 30,1% eli 23,4%, kun RelA tai RelB oli tippuu alas. Tilastollinen analyysi osoitti, että merkittäviä eroja RelA siRNA ja RelB siRNA verrattuna valvoa siRNA. Siten knock-alas RelB lähes kaksinkertaistui solun tappaminen säteilyn vaikutusta. Kuitenkin tappaminen RelB siRNA plus säteily oli hieman pienempi kuin yhdessä vaikutukset siRNA yksin ja säteilyn yksin. Siten on mahdollista toinen osuma soluja, jotka olivat jo kuolleet voi selittää tämän havainnon. Kolmanneksi RelA ja RelB olivat estyy niiden tumaansiirtymiseen edelleen vahvistamaan rooliaan säätelyssä PSA ja IL-8 ilmaisuja. Mutant konstruktiomme IκBα (IκBαM) [14] tai P100 (p100M) [15] transfektoitiin LNCaP estää RelA: P50 dimeeriä tai RelB: p52 dimeeri tumaansiirtymiseen, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, vastaukset PSA: n ja IL-8 ilmaisuja olivat samanlaisia ​​kuin saadut tulokset RNAi-menetelmä (Fig. 1 B). Näin ollen, tukos joko RelA tai RelB tumaansiirtymiseen tehokkaasti parannettu radioherkkyyttä LNCaP-soluja.

PSA kääntäen korreloi IL-8: Eturauhassyövän soluissa

PSA: n ja IL-8 on osoitettu olevan tärkeitä biomarkkereita monissa vaiheissa Eturauhassyövän etenemistä. Olemme osoittaneet, että säätely ylöspäin IL-8, mutta alas-säätely PSA liittyy yhä tuumorigeenisyystesti Eturauhassyövän soluja [5]. Kaksi PCa solulinjoja käytettiin vahvistamaan korrelaatio PSA IL-8: LNCaP, androgeenien reagoiva PCa solulinjassa, ilmentää PSA ja alhainen IL-8; PC3, androgeeni-riippumaton PCa solulinja, ilmentää korkealla tasolla IL-8, mutta PSA on havaittavissa. Transfektion jälkeen IL-8: n cDNA ilmentymiskonstrukti LNCaP, suhteelliset tasot PSA kvantitoitiin. Koska IL-8 ilmaisun kasvoi, solu PSA-arvot annoksesta riippuvaa laskua. Lisäksi knocking- alas PSA PSA siRNA aiheutti annoksesta riippuvaa nousua solun IL-8 tasoa (Fig. 2A). Lisäksi ilmentävät PSA PC3-soluissa johti vähenemiseen IL-8 tuotantoa. Kuitenkin, ei ollut ilmauksia PSA PC3-soluissa, vaikka IL-8 knocked- alas siRNA (Fig. 2B). On osoitettu, että NF-KB: n aktivaatio voi välittää prosurvival reitti IL-8: CXCR2 signalointi [16]. Koetin onko NF-KB voi olla välittäjänä havaittu käänteinen suhde IL-8 ja PSA, joka on NF-KB: n ja lusiferaasireportterista konstrukti oli kotransfektoitiin LNCaP-solujen PSA: n ekspressiokonstruktin tai PSA siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, liiallinen ilmentyminen PSA tukahdutetaan mutta PSA puutos tehosti NF-kB-välitteisen transkription aktivaation.

manipuloida PSA: n ja IL-8: Eturauhassyövän soluissa, LNCaP-solut transfektoitiin IL-8: n cDNA-konstruktin ja PSA siRNA (A); PC3-solut transfektoitiin PSA cDNA rakentaa ja IL-8 siRNA (B). Sen testaamiseksi, PSA vaikuttaa NF-KB: n transkription aktivaatiota, joka on NF-KB: n ja lusiferaasireportterista konstrukti transfektoitiin samanaikaisesti PSA ekspressiorakenne tai PSA siRNA ja β-gal-ilmentymiskonstrukti LNCaP. Lusiferaasi vasteet olivat normalisoitu β-gal-toiminta (C). PSA ja IL-8 tasojen määrä Western blotit normalisointia kuten kuvattu kuviossa 1.

PSA ja IL-8 pelata vastapäätä rooleja radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja

Being NF -κB säännelty geenituotteiden, PSA ja IL-8 voi olla tärkeä rooli vastauksissa Eturauhassyövän sädehoitoon. Siksi manipuloitu tasoa PSA ja IL-8 suoraan määrittää niiden roolit radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja. Lisääntyvä IL-8 LNCaP-soluissa joko käsittelemällä soluja IL-8-proteiinin (Fig. 3A, yläpaneeli) tai transfektoimalla IL-8-cDNA soluihin (Fig. 3A, pieni paneeli) pienensi PSA tasot ja herkkyys säteilylle. Lisäksi lentivirus–pohjainen shRNA vakaa knock-down PSA LNCaP johti yhä IL-8 tasoa ja vähentää radioherkkyyttä solujen (Fig. 3B). Edelleen todentamiseksi roolit PSA: n ja IL-8 radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja, PSA: n ja IL-8 PC3-solut moduloitu transfektoimalla PSA cDNA: n ja IL-8 siRNA, vastaavasti. Lentivirusta-pohjainen ilmentymä PSA ja knock-down IL-8 PC3-soluissa johti korkea PSA, vähentäminen IL-8 tasoa ja lisäsi radioherkkyyttä PC3-soluissa (kuvio. 3C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, käänteinen suhde IL-8 ja PSA PCa soluissa ja viittaavat siihen, että PSA: n ja IL-8 on vastakkaiset vaikutukset radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja.

määrittämiseksi roolit PSA: n ja IL- 8 radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja, LNCaP-soluja käsiteltiin IL-8-proteiini tai stabiilisti transfektoitu IL-8: n cDNA (A) ja stabiilisti transduktoi- PSA shRNA lentiviruksen (B); PC3-solut stabiilisti transduktoi- PSA cDNA: n ja IL-8 shRNA lentivirus (C). Tasot PSA kvantitoitiin Western blotit ja tasoja IL-8 kvantitoitiin joko Western blotit tai Elisa kit. Solujen eloonjääminen kvantifioitiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksissä. Western blotit normalisoitui hallintalaitteet ja solujen hengissäsäilymisosuus analyysi kuten on kuvattu kuviossa 1.

Up-regulation of RelB vähentää radioherkkyyttä LNCaP kasvain

in vivo

yllä olevat tiedot on saatu

in vitro

syyttää RelB ja se on suunnattu, IL-8 ja PSA, sillä on tärkeä rooli radioherkkyyttä Eturauhassyövän. Tarkistaa aseman RelB on säteilyherkkyyttä Eturauhassyövän ja käänteinen suhde IL-8 ja PSA ilmaisuja

in vivo

, vakaa RelB-ilmentävien LNCaP klooni luotu (Fig. 4A) ja ihon alle injektoidaan kylkiin nude uroshiirillä; kasvaimen kasvua seurattiin 50 päivää mittaamalla kasvaimen koko. Kasvaimen kasvu muutoksen kvantifioitiin aika (päivinä) vaaditaan kasvaimen koon saavutetaan tilavuus 500 mm

3. Kuva. 4B osoittaa, että keskimääräinen aika verrokkiryhmässä päästä 500 mm

3 oli 54 ± 6,7 päivää. Kasvaimen kasvu kasvu RelB-ilmaisi klooni kesti 43 ± 5,6 päivää tavoittaa 500 mm

3. Eläimet, joiden keskimääräinen kasvaimen koko 500 mm

3 satunnaistettiin kahteen ryhmään 1) käsittely fraktioitua säteilyä (3 Gy säteily päivässä 5 päivän ajan) ja 2) laparotomiakontrolleissa. Hiiret inhimillisesti tapettiin kun kasvaimet olivat saavuttaneet maksimikoko 2000 mm

3. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, että unradiated hiirillä, vektorisäätö kasvaimet kasvoivat 500 mm

3 2000 mm

3 25 ± 3,7 päivää, kun taas kasvain ilmentävien RelB saavuttanut samankokoisia 14 ± 2,3 päivää. Ionisoiva säteily (IR) esti tehokkaasti kasvun ohjaus kasvaimen sisällä 50 päivän ajan kokeen. Kuitenkin IR vain pysähtyi kasvu RelB ilmentävien kasvainten 20 päivän ajan säteilyä, jonka jälkeen kasvain uusiutumista havaittiin. Koe lopetettiin, koska jotkin hiiret säteilevän ryhmää kehitti huonokuntoiset epäillyn kliinisiä oireita systeeminen sairaus, kuten kuivuminen, työläs tai pinnallinen hengitys, ja menettää 20% niiden enimmäispaino. Sen jälkeen kun tuumorit poistettiin, ilmaus RelB ja tasot PSA: n ja IL-8 kasvainkudoksessa kvantifioitiin käyttämällä sopivaa vasta-ainetta kutakin proteiinia. Yhdenmukainen korkea RelB yksilöityjen RelB-ilmaisi kasvaimia, IL-8 nostettiin mutta PSA väheni samalla tuumorikudoksissa (Fig. 4D).

Vakaa RelB ilmaisi LNCaP klooni leimasi Western blot (A). RelB /LNCaP-soluja injektoitiin uroshiirillä kasvaimen muodostuminen ja kasvu ulottuu 500 mm

3 (B). Kasvaimet käsiteltiin IR (5 x 3 Gy) ja kasvainten tilavuudet mitattiin, kunnes ne saavuttivat 2000 mm

3 (C). RelB, PSA: n ja IL-8-tasojen määrä kasvaimeen lysaateissa ja analysoitiin tilastollisesti (D). Tilastollinen merkitykset Kasvaimen tilavuutta (C) ja tasot kohdeproteiinien (D) välillä RelB ilmaistuna ja ajoneuvon hallinnan sekä marras- IR ja IR-käsiteltyjen ryhmien osoitetaan.

Down-regulation of RelB parantaa radioherkkyyttä PC3 kasvainten

edelleen vahvistaa suojaava rooli RelB säteilyä vastaan, lentiviruksesta-pohjainen RelB siRNA PC3 klooni valittiin (Fig. 5A) ja injektoitiin kylkiin nude uroshiirillä. Vuonna ohjaus siRNA ryhmä, keskimääräinen aika kasvaimen päästä 500 mm

3 oli 11 ± 2,1 päivää, kun taas keskimääräinen aikaa RelB knock-down ryhmä laajennetaan 26 ± 5,1 päivää (kuvio. 5B). Kasvaimia käsiteltiin IR 3 x 5 Gy jälkeen kasvaimen saavutettu keskimääräinen koko on 500 mm

3. Vuonna unradiated kontrollihiiret, kasvaimen koko ohjaus siRNA ryhmä kasvoi nopeasti 500 mm

3-2000 mm

3 15 ± 3,1 päivää. Verrattuna kontrolliryhmään siRNA ryhmä, kasvaimen kasvu RelB knock-down ryhmä oli huomattavasti hitaampaa kuin kontrolliryhmässä siRNA ryhmä. IR esti kasvun ohjaus kasvain trendinä on regrowth kun 20 vuorokautta IR. Mielenkiintoista on, että IR ei ainoastaan ​​ohjata kasvaimen uusiutumista, mutta se myös vähentää kasvaimen kokoa RelB siRNA ryhmä (Fig. 5C). Erot

in vivo

eivät yksinkertaisesti heijastuksia kasvueroja

in vitro

koska ei ole tapahtunut merkittävää alenemista solujen kasvua, kun RelB stabiilisti tippuu alas PC-3-solut. Siten säteilylle herkäksi vaikutus knock-alas RelB johtuu esto säteilyn indusoituvan NF-KB: n aktivoitumisen. Vaikutukset siRNA-välitteisen knock-alas RelB varmistettiin Western blot-analyysit RelB ja IL-8 kasvainkudoksessa (Fig. 5D). Nämä tulokset tukevat roolia RelB vastaukseen PCa sädehoitoon.

lentivirusta perustuva RelB siRNA knock-down PC3 klooni karakterisoitiin Western blotit (A). RelB shRNA /PC3-soluja injektoitiin uroshiirillä tuumorin muodostumiseen (B). Kasvaimet käsiteltiin IR (3 x 5 Gy), kun kasvainten oli 500 mm

3 ja kasvainten annettiin kasvaa 2000 mm

3 (C). RelB ja IL-8-tasojen määrä kasvaimeen lysaateissa ja analysoitiin tilastollisesti (D). Tilastollinen analyysi kasvaimen tilavuutta ja tasot kohdeproteiinien, kuten on kuvattu kuviossa 4.

Keskustelu

PSA on androgeenireseptorin (AR) -regulated tuottama seriiniproteaasi eturauhasen epiteelisolujen [17]. Vaikka seerumin PSA taso korreloi läsnä PCA monet tekijät, kuten tulehdus, infektio, eturauhasen liikakasvu sekä kudoksen prosesseja, johtaa tiettyihin eheyden menetystä eturauhasen rauhanen ja vuoto PSA välillä ontelon interstitiaalitilaan neste ja yleiseen liikkeeseen. [18], [19]. Lisäksi PCA voi olla läsnä ilman seerumin PSA-tasot [20]. Itse asiassa ei ole olemassa detectible tasoa PSA androgeeni-riippumaton PCa solulinjoissa, kuten PC3 ja DU-145. Vaikka PSA käytetään biomarkkerina diagnoosissa PCA sen biologinen toiminta ei ole täysin selvitetty. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat, että solun PSA taso voi olla tärkeä indikaattori PCa soluvasteen IR. Alassäätöä PSA androgeeniresponsiivinen LNCaP johtaa alentunut säteilyherkkyyttä ja ilmentymistä PSA androgeeni-riippumaton PC3-solujen tulokset tiiviimpään radioherkkyyttä, mikä viittaa siihen, että PSA on tärkeä rooli vastauksena Eturauhassyövän soluja sädehoitoon.

IL-8, tulehdusta sytokiinien, ainutlaatuisesti ilmaisee androgeeni-riippumaton PCa soluissa, mutta ei androgeenien reagoiva PCa soluissa [8], [21]. Kohonnut IL-8 tasoa kehittyneissä PCa on katsottu olevan merkittävä tekijä syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymisen jälkeen hoitojen [6], [12]. Tämä tutkimus paljastaa mielenkiintoinen suhde PSA ja IL-8 vastetta PCa solujen sädehoitoa. Käänteinen suhde PSA ja IL-8 ilmaisuja confounds päätellä, että havaitut muutokset radioherkkyyttä Eturauhassyövän ovat riippuvaisia ​​PSA; vaihtoehtoisesti havaittu vaikutus PSA voi välittää, osittain muutoksen IL-8 tasolla. Tiedot tässä raportissa esitetyt suoraan osoittaa roolia IL-8 radioherkkyyttä Eturauhassyövän soluja. Yhdessä nämä tulokset korostavat monimutkainen suhde IL-8 ja PSA, jotka osaltaan vastaus Eturauhassyövän soluja sädehoitoon.

NF-KB on konstitutiivisesti aktiivinen monissa syövissä, ja se toimii ylös-asetuksen of antiapoptoottisten ja onkogeenisten geenien [10], [22], [23]. Toinen tärkeä biologinen toiminta NF-KB liittyy koordinointia synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen, joka ylläpitää solun puolustusmekanismit [3]. NF-KB: n vuoksi katsotaan hyödyllinen lisä perinteisen kemo- tai radio-hoitoa. NF-KB on viisi Rel-sukuiset proteiinit, jotka sisältävät RelA /p50-heterodimeerin-välitteisen klassisen reitin ja RelB /p52-heterodimeerin-välitteisen vaihtoehtoisen reitin [3], [10], [13]. RelB on ainutlaatuinen ilmaistu kehittyneitä Eturauhassyövän soluihin ja RelB perustuvan vaihtoehtoisen reitin tärkeä rooli kasvainten synnyssä Eturauhassyövän [24], [25]. Olemme aiemmin osoittaneet, että selektiivisen inhibition vaihtoehtoisen reitin merkittävästi estää tuumorigeenisyyden Eturauhassyövän soluja [5], [26], [27]. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat, että RelB voi myös olla kriittinen rooli radioresistance Eturauhassyövän soluja, osittain kautta käänteinen vaikutus ilmaisuja IL-8 ja PSA.

AR on olennaisen tärkeää Eturauhassyövän aloittamista ja etenemistä. Jopa silloin, kun PCa etenee hormoni tulenkestävät vaiheita, AR signalointi edelleen läpi erilaisia ​​androgeenista riippumattomien mekanismien [28]. Siten ablaatio Jälleenkytkentätoiminto on tavoite ensivaiheen hoidolle. Vaikka nämä hoidot ovat aluksi tehokkaita, toistuva kasvainten syntyä palautettu AR toimintaa [29] tai jopa muiden ligandin sitoutumista reseptoreihin [30]. Koska AR tavoite, PSA valvoo hallinnan PCa. Kuitenkin, kun läsnä on AR ei ole riittävä ennustaa tehokkuutta hoidon, koska tason PSA voidaan myös säädellä monet muut tekijät. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä AR ja NF-KB: n signalointi ovat tärkeitä tekijöitä etenemistä PCa. Palauttaminen AR aktiivisuuden puuttuessa androgeenin pidetään mekanismi PCA edetessään hormonin tulenkestävä vaiheessa [29]. Lisäksi NF-KB: n välittämää IL-6-STAT3 aktivoinnin uskotaan olevan tärkeä mekanismi kasvainten etäpesäkkeiden [31]. Kuitenkin rajat puhua välillä signaalien kulkureiteillä on vaikeasti. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat, että yli-ilmentyminen RelB kasvoi solutasolla IL-8, mutta laski tasolle PSA, viittaa siihen, että NF-KB: n kohdegeenien voidaan säädellään eri tavalla eri jäsenten NF-KB-perheen tai RelB voi toimia toisena aktivaattori IL-8 transkriptio palvellessaan negatiivisena co-säädin PSA transkriptio. On osoitettu, että yhdistelmä RelB ja aryylihiilivetyreseptori (AhR) voi aktivoida transkriptiota RelB /AhR elementti ainutlaatuisesti sijaitsee ylävirtaan IL-8-KB-sivustolla [32]. On myös osoitettu, että NF-KB: n estää PSA transkription kautta androgeenireseptorin elementti sijaitsee promoottorialueen geenin [33]. Meidän havainto on yhdenmukainen sen mahdollisuuden kanssa, että NF-KB on paitsi kyky aktivoida sen kohdegeenin vaan myös estämään sen kohdegeenin koostumuksesta riippuen vaikuttavista tekijöistä transkription.

Sädehoito aiheuttaa kasvun pysähtymiseen ja kuolemaan syöpäsoluissa joko suoraan ionisaation DNA tai reaktiivisten hapen lajien (ROS), jotka voivat vahingoittaa DNA: ta. On osoitettu, että genotoksinen aineet, kuten IR, aiheuttama double-säikeen katkoksia (DSB: t) stimuloivat NF-KB-reitin tuottaa positiivista palautetta silmukoita kautta sytokiinien tuotantoa, joka puolestaan ​​aktivoi DNA korjausmekanismit [34] – [36]. Sytokiini-aktivoitua NF-KB-reitin voi myös johtaa induktion antioksidantti entsyymejä, jotka suojaavat syöpäsolut vastaan ​​ROS tuottavan terapeuttisia. Aiemmat tutkimukset, jotka osoittavat, että NF-KB: n ja sen antioksidantti tavoite, mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), huomattavasti lisätä radioherkkyyttä aggressiivisen eturauhassyövän solut [5], [25], ovat sopusoinnussa havainnon myöhemmin mekanismia.

mekanismi, jolla PSA voi moduloida soluvastetta sädehoitoa on edelleen tuntematon. On mahdollista, että havaittu negatiivinen vaikutus PSA johtuu osittain kasvu IL-8 tasolle, kun PSA on vähennetty. Todellakin, käänteinen yhdistys PSA ja IL-8 havaittiin sekä androgeenien reagoiva ja androgeenista riippumaton PCa soluissa, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt suhde IL-8 PSA myötävaikuttaa radioresistance Eturauhassyövän soluja. Tulevaisuuden tutkimuksen määrittää miten tason PSA vaikuttaa IL-8 olisi mielenkiintoista.

Yhteenvetona tämän tutkimuksen käytetään täydentäviä kokeellisten lähestymistapojen osoittaa, että RelB myötävaikuttaa radioresistance Eturauhassyövän soluja ja kääntäen säätelee IL -8 ja PSA ilmaisuja. Käänteinen suhde IL-8 ja PSA-arvot on ennustava vastauksesta Eturauhassyövän soluja säteilylle, mikä viittaa mahdollisuuksia parantaa sädehoidon Eturauhassyövän suoraan modulaatio IL-8 ja /tai PSA-arvot. Tämä on ensimmäinen kokeellista näyttöä syyttämään roolia PSA sädehoidon Eturauhassyövän soluja. Insights saatu tässä tutkimuksessa tarjota tieteellinen perusta käytön IL-8 /PSA-suhde kuin matkapuhelinverkon indikaattori hallintaan PCa solujen säteilyn.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoito

Ihmisen eturauhassyöpä LNCaP ja PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) kasvatettiin ja pidettiin RPMI-elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. Soluja käsiteltiin IR käyttämällä 250 kV röntgenlaite (Faxitron-yksikköön röntgen Corp.) kanssa huippu energiaa 130 kV, 0,05 mm Al suodatin, annoksella 0-5 Gy. Vaikutuksen tutkimiseksi IL-8 säteilyn vasteet, LNCaP-solut esikäsiteltiin IL-8 (BD Biosciences) pitoisuuksina 0-100 pg /ml 12 tuntia ennen säteilyaltistusta. Radioherkkyyttä Eturauhassyövän solujen määrä määritettiin käyttämällä solujen hengissäsäilymisosuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [26].

Cell transfektio

ilmaista RelA, RelB, PSA, IL-8, p100M ja IκBαM proteiinien PCa soluissa, ekspressiokonstruktit koodaavat näitä proteiineja käytettiin. RelA (p65) ekspressiokonstrukti on lahja laboratoriossa Nancy Rice (NIH); p65 cDNA kloonattiin välillä H

ind

III – X

ba

I sivustoja pRC-CMV vektori; RelB, PSA: n ja IL-8 ekspressiorakenteiksi hankittiin Open Biosystems. RelB luettelo nro .: MHS1010-7507797; PSA luettelo nro .: MHS1010-9205472; IL-8 luettelo nro .: MHS1010-58052. CDNA kloonattiin välillä E

Cor

V – N

ot

I sivustoja pCMV-Sport6 ​​vektori; P100M konstruktio saatiin tohtori Shao-Cong Sunin laboratoriosta Pennsylvania State University [37]. P100M sekvenssi kloonattiin välillä H

ind

III – X

ba

I sivustoja pCMV4 vektori; IκBαM konstruktio saatiin tohtori Veronique Imbert laboratoriosta, Adhésion Cellulaire, Hôpital de Sainte Marguerite, Marseille, Ranska. IκBα (S32-36A) mutantti sekvenssi kloonattiin klo E

Cor

V sivuston pcDNA 3.1 vektori. Kaikki vektorit sisältävät CMV-promoottorin ja käytettiin ilman indusoituva kunnossa. Vakaa transfektoidut kloonit valittiin neomysiinin vastustuskyky. Kolhi alas endogeenisen RelA RelB, PSA ja IL-8 PCA soluissa, erityiset siRNA (Santa Cruz Biotech.) Transfektoitiin. Lentivirusta-pohjainen shRNA rakentaa (Open Biosystems) käytettiin vakaasti knock-down tavoitteiden mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tasot proteiinien varmistettiin Western blotit. NF-KB-lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää neljä kopiota NF-KB: n elementit liitetty SV40-promoottori on pGL3-vektoria (Promega) on aiemmin rakennettu [25]. Reportteri-konstrukti on kotransfektoitiin PSA ekspressiovektorin tai PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) Ja β-galaktosidaasi (β-gal) rakentaa osaksi LNCaP-solujen vaikutuksen määrittämiseksi PSA NF-KB: n transkription aktivaatiota.

Eläimet

Neljän viikon ikäisiä, koiraspuolisia NCRNU (nu /nu kateenkorvattomia nude) hiiret hankittiin Taconic (Hudson). 1.8 x 10

6 PCa soluja sekoitettuna matrigeelin (BD Biosciences) injektoitiin oikeaan kyljissä hiirillä. Kasvaintilavuudet laskettiin viikoittain käyttäen normaalia kaavaa (A × B

2 x 0,52, A ja B edustavat lävistäjä kasvain pituudet). Kasvainkudoksessa kerättiin, ja 100 ug kudokset lyysattiin määrällisesti proteiinin tasot käyttäen Western-blotteja. Eläinkoe ​​menettelyjä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Kentuckyn yliopistosta, hyväksyntä lisäpöytäkirjan 01077M2006.

Western blot.

määrällisesti proteiinin tasot, solujen ja kudosten uutteita erotettiin käyttäen SDS-PAGE, 8% (w /v) polyakryyliamidigeelissä, ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja blotattiin ensisijaisen vasta-aineita RelA, RelB, P100, IκBα, PSA, IL-8 ja β-aktiini. Vuohi anti-hiiri-IgG-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen havaitsemiseen käytettiin RelA, PSA, IL-8, ja β-aktiini. Muut proteiinit havaittiin käyttäen vuohen anti-kani-lgG-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Immunoblotit tehtiin näkyviksi tehostetulla kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

IL-8 määrän

Viljellyt media kerättiin lopussa kokeellisia toimenpiteitä. Tasot IL-8 erittyy viljellyistä soluista kvantitoitiin käyttäen IL-8 Elisa -kittiä (BD Biosciences) mukaan valmistajan protokollan.

Tilastotiedot analysoi

Useita toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin jokaisen sarjan data. Kuvat Länsi-blotit kvantitoitiin käyttäen Carestream Molecular Imaging ohjelmisto (Carestream Health Inc.). Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA ja Tukeyn monivertailutesti, jota seuraa data-analyysi, jossa Graphpad Prism.