Krooninen sairaus

tiivistelmä

Seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) -testi on suuren määrän vääriä positiivisia. Koska yksi merkki, PSA tarjoaa rajoitetun diagnostiset tiedot. Multi-merkki testi pystyy havaitsemaan paitsi kasvaimia vaan myös potentiaalisesti tappava niitä tarjoaa tyydyttämättömiä kliinisen tarpeen. Käyttämällä nanoString NCounter geeniekspression järjestelmä, 20-geenin multiplex testi on kehitetty, jotka perustuvat digitaaliseen geenin laskentaa RNA-transkriptien virtsaan keinona havaita eturauhasen syöpä. Tässä kokeessa, pätevä virtsa sentrifugoidaan pelletoimiseksi soluissa ja puhdistettu RNA monistetaan hybridisaation ennalta probesets. Monistaminen testi solulinjan RNA näytti ei esitellä merkittäviä bias, ja laskee sovitettu hyvin geenin runsauden tasoilla mitattuna DNA mikrosiruja. Data-analyysin, yksittäiset lukemat olivat verrattuna β2 mikroglobuliinin, kotitalouksien geeni. Virtsanäytteet 5 ennen leikkausta tapauksissa ja 2 ei-syöpä analysoitiin. Patologian tiedot noudetaan sitten. Signaalit enemmistö geeneistä oli alhainen kuin syövän ja alhainen Gleason tulokset, ja 6/6 tunnettu eturauhassyövän markkereita olivat positiivisia tapauksia. Yksi tapaus Gleason 4 + 5 osoitti sen sijaan voimakas signaali kaikille syöpään liittyvän markkereita, mukaan lukien CD24. Yksi ei-syöpä osoitti myös signaalit kaikille 6 syövän markkereita, ja tämä ihminen saattaa kertyä diagnosoimattomasta syöpä. Tämä multiplex koe määrityksiin luonnollinen jätetuotteen voidaan mahdollisesti käyttää seulontaan, varhaisen syövän havaitseminen ja potilaan kerrostumista. Diagnostista tietoa on saatu RNA: sta allekirjoituksia, jotka liittyvät solutyyppien eturauhasen kasvaimia.

Citation: Quek SI, Ho ME, Loprieno MA, Ellis WJ, Elliott N, Liu AY (2012) multiplex -määritys mittaa RNA transkriptit Eturauhassyöpä virtsassa. PLoS ONE 7 (9): e45656. doi: 10,1371 /journal.pone.0045656

Editor: Anthony WI. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 21 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Quek et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute – Early Detection Research Network (NCI EDRN) myöntää CA111244. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat julistaa kuuluminen yhden co-kirjoittajat, Nathan Elliott, että kaupallinen yhtiö nanoString Technologies. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ikääntyvän väestön määrä eturauhassyövän tapauksista kasvaa dramaattisesti seuraavassa kaksi vuosikymmentä. Seerumin PSA-testillä valvomaan miesten eturauhassyövän ja monet kasvaimia on havaittu varhain, sillä se käyttää. Kuitenkin lähes ¾ miehillä poikkeava PSA osoittautua negatiivinen syöpään kun koepala [1]. Näin ollen, monet koepaloja suoritetaan ovat tarpeettomia. Myös jotkut syövän tapauksissa huomaamatta PSA. Kun taas PSA on runsaasti eturauhasen tuottama se ei ole syöpä-spesifinen, vaikka molekyyli muotoja PSA kuten [2] proPSA näyttävät osoittavan parempaa suorituskykyä [2]. Muita markkereita tarvitaan lopullisen syövän diagnoosin. Lisäksi, markkereita tarvitaan erottamaan eturauhasen syöpien, jotka voivat olla hengenvaarallisia niistä, jotka eivät ole. Multi-markkeri vaaditaan. NanoString NCounter teknologia voi suoraan mitata useita RNA-transkriptien biospecimens, ja lukema on digitaalisen geenien laskee [3]. Vuonna NCounter järjestelmässä, kaksi oligonukleotidikoettimia suunniteltu kunkin transkriptin tavoite: yksi konjugoitu biotiiniin ja muut värikoodatut kanssa värimolekyyliä yhdistelmiä. Sen jälkeen liuoshybridisaatio, siepatut selostukset immobilisoidaan streptavidiinilla päällystetylle pinnalle, linjassa sähkökentässä, ja tunnistaa omat värikoodit. Koodit lasketaan mikroskoopilla /kamera laitteen ja taulukkona Excel. Teknisistä syistä enimmäismäärä geenejä, jotka voidaan analysoida ajoa kohti on hieman alle 800. tekniikka on näytteenotto hyötysuhde ~ 1% (eli 1800-molekyylejä tuotetaan 25 määrä), signaalin välillä -25 osoitteeseen 50000 laskee, ja hyvä toistettavuus [3].

tavoitteena on kehittää tätä nanoString teknologiaa eturauhassyövän havaitsemiseen analysoinnin avulla mitätöidään virtsan koska eturauhanen on tyhjentää virtsateiden. Erilaiset solutyypit, kuten sairaan niitä voidaan irtoa tai vapautetaan elimistä pitkin tätä ärsytystä. Sillä NCounter probesets, informatiivinen eturauhassyövän geenejä tunnistettiin transcriptomic analyysi syövän epiteelin ja syöpään liittyvän strooman solutyyppejä vastaan ​​niiden ei-syöpä vastine. Toistaiseksi asiaa solutyypit sisältyvät Gleason kuvio 3 CD26

+ syöpäsoluja, Gleason kuvio 4 CD26

+ syöpäsoluja, CD90

+ syöpään liittyvän stromasoluja kontrastin CD26

+ onteloerityssolut ja CD49a

+ stromasoluja [4], [5]. Valitut markkerigeenejä sisällytettiin nanoString eturauhassyöpä koetin kirjaston tuottamiseksi NCounter codeset. Virtsa kokoelma edustaa vähiten invasiivisia reitti saada testimateriaalille, ja ollessa jätteet, useita näytteitä voidaan kätevästi talteen ilman vaaraa tai stressiä potilaille. Koska solutyyppejä kasvaimia ovat eri geenien ilmentyminen, niiden geeni allekirjoitus ei pitäisi olla läsnä terve kuin syöpä. On myös mahdollista, että johtuen epänormaalin histoarchitecture kasvainten, syöpien sekä syöpään liittyvät solut ovat todennäköisemmin päästää virtsan kuin solujen normaali, erityisesti silloin, kun solunulkoinen matriisi tuhotaan kasvain- metalloproteinaasien.

Gen-Probe pCA3 virtsa testi on yksi perustuu tällä hetkellä läsnä syöpäsolujen virtsassa sairauksien diagnosointiin [6]. Se mittaa ei-koodaava RNA (pCA3) kautta target capture ja vahvistus, kemiluminesenssi koetin tunnistuksen lukema suhteellisissa valoyksiköissä. Monikeskustutkimus arviointi testi osoitti hyväksyttävää analyyttistä suorituskykyä ja oikea aihe luokittelu (syöpä

vs

. Biopsia negatiivinen) on vajaat 70% [7]. Ennustetyövälineenä merkki, pCA3 ei ollut merkittävää linkki Gleason pisteet, kasvaimen tilavuus, vaihe, joka perustuu 70 tapauksessa [8]. Toisessa tutkimuksessa raportoitu linkin näihin kliinis-[9]. Muihin markkereita voidaan sisällyttää käyttämällä koko transcriptome vahvistusta sen jälkeen polymeraasiketjureaktiolla (PCR) [10]. Kolme muuta markkereita (PSMA HPN, GALNT3) plus pCA3, voisi esimerkiksi erottaa syövän hyvänlaatuinen 100% yhdessä raportissa [11]. Multiplex PCR, ei kuitenkaan ole vankka tekniikka ja hankala esiintymään suuritehoisen ympäristössä. NCounter teknologia ei ainoastaan ​​monen markkerin analyysivalmiuksiin mutta myös helppokäyttöisyyden käytön. Payton

et al

. [12] ilmoitetaan soveltamisesta NCounter mitata RNA runsaasti akuutti myelooinen leukemia. Meidän kehittämistä multiplex (pCA3 plus muut merkkiaineiden) testi on motivoitunut samanlaisilla kokeilla tarjottavien rintasyöpäpotilaiden kerrostuminen [13].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi University of Washington Institutional Review Board. Mitätöidään virtsanäytteiden ja ylimääräinen kudosnäytteiden leikkauksia kerättiin luovuttajista kirjallista suostumusta.

Probeset Selection

NCounter probesets suunniteltiin ja syntetisoitiin nanoString Technologies [3]. Mukaan nanoString koodiston suunnittelu, kukin koetin parin tehtiin komplementaarinen 100 emäksen alueen kohde-RNA. Sieppauskoetinta konjugoitiin biotiiniin immobilisoitavaksi päälle streptavidiinipäällystetyille levy jälkeen hybridisaation, ja reportteri koetin värikoodattu tag signaalin havaitsemiseen. Kaksikymmentä geenimerkkejä valittiin (taulukko 1). Näistä kuusi olivat geenien on raportoitu useiden ryhmien osoittaa kohonneen ekspression eturauhassyövän: AGR2 (anterior gradientti 2) [14], AMACR (α-methylacyl-CoA-rasemaasi) [15], CRISP3 (kysteiinirikas eritysproteiinia 3 ) [16], HPN (hepsiinin) [17], pCA3 [18], ja ERG (

v

-ets erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin, aktivoituu seurauksena geenin fuusion androgeenisäädellyn

TMPRSS2

) [19]. B2M (β2 mikroglobuliini) käytettiin kontrollina RNA laadun ja määrän. BRE (aivot ja lisääntymiselin-ilmaistuna TNFRSF1A modulaattori), IL24, CCL3 [kemokiini (C-C-motiivi) ligandi 3, makrofagi tulehduksellinen proteiini 1 alayksikköä MIP1α] havaittiin niin ylös geenien eturauhassyöpäsoluissa [4]. ACPP (eturauhasen hapan fosfataasi), AZGP1 (sinkki α2-glykoproteiini 1), KLK2 [(hK2) ja KLK3], ANPEP (alanyyli aminopeptidaasi, CD13), CD24, CD9, DPP4 (dipeptidyylipeptidaasi 4, CD26), MME (kalvo metallo-endopeptidaasi, CD10) sisällytettiin eturauhasen luminal solugeenejä kanssa differentiaalikaavojen syövän ja ei-syöpä [20]. CD90v (CD90 variantti BAD92446, ja CD90 /THY1) oli mukana syöpään liittyvän stromasoluja [5], [21], ja UPK3A (uroplakin 3A) virtsarakon soluihin [22].

Eturauhasen Cancer Cell Lines

eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3, C4-2, ja C4-2B pidettiin RPMI1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia. Transcriptomes PC3 ja C4-2 raportoitu aiemmin [23]. C4-2B oli peräisin C4-2 kasvulle (hiiri) luu [24]. PC3 ja C4-2 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). C4-2B [25] luovutti ystävällisesti Dr. Robert Vessella että urologian osastolla.

Taulukossa on esitetty normalisoitu geenin laskee vuonna laimennussarjaan 10000, 1000, 100, 10, 1 (3x) solut PC3

vs

. C4-2. Geenit on lueteltu ensimmäisessä sarakkeessa. Aineisto kyselyn näyttö ekspressiotasot näiden geenien C4-2 ja PC3 näkyy oikealla.

Virtsan keräys ja käsittely

Mitätöity virtsanäytteistä kerättiin luovuttajilta. Ei erityisiä ennalta keräys valmistelu vaadittiin potilaista. 2 tunnin sisällä, virtsaan (20-100 ml), kaadettiin kokoelma purkit osaksi 50 ml: aan steriiliä kartioputkiin, ja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin ajan. Supernatantti säästettiin (proteiinien analyysi); pelletti suspendoitiin uudelleen jäljellä virtsassa ja siirrettiin 1,5 ml: n Eppendorf-putkiin 1 min mikrosentrifugissa maksiminopeudella. Enintään 10 ui RLT-puskuria (Qiagen, Valencia, CA), joka sisälsi 1% β-merkaptoetanolia lisättiin. Solulysaatit säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes analyysi (NCounter hybridisaatio- tai RNA ja vahvistus).

Kuvassa on Excel muoto NCounter tietojen unamplified

vs.

Monistettiin (merkitty * ) RNA: C4-2B ja PC3-soluissa. POS ja NEG ovat valvonta probesets. B. Signaali laskee saatu unamplified

vs

. monistettu (merkitty *) verrataan histogramminäyttö. Gene count B2M vahvistetaan 100 ja kaikki muut geeni lukemat verrattuna B2M samasta näytteestä. Huomautus geenejä ilmenemisen puuttuminen ei vahvistu.

RNA ja Amplification

Virtsa RNA valmistettiin RNAqueous Micro (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA). Lyhyesti, 90 ui Lysis Solution lisättiin 10 ui solulysaateista voimakkaasti sekoittaen. Viisikymmentä ui etanolia, lisättiin sitten, ja seos ladattiin Micro-suodatinpatruuna Assembly. Patruuna pestiin, ja RNA eluoitiin 2 x 8 ui esilämmitettyä Eluointi Solution. Riippuen RNA-pitoisuus, 3-5 ui eluoitua RNA: n (30-50 ng) käytettiin RNA-monistus käyttäen RiboMultiplier Sense-RNA: n vahvistus (Epicentre, Illumina, Madison, WI). Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi, terminaali oligomeerin koodaus, toisen juosteen cDNA-synteesi,

in vitro

transkription RNA ja DNaasi I ruuansulatusta suoritettiin valmistajan ohjeiden protokollaa Thermocyclerissä. Monistettu RNA puhdistettiin käyttäen RNeasy Mini (Qiagen) ja suspendoidaan uudelleen 30 ul: aan RNaasi-vapaata vettä. RNA solulinjoissa valmistettiin RNeasy Mini.

NanoString NCounter hybridisaatio ja esittäminen Gene Counts

Probe hybridisaatio suoritettiin 4-5 ui solulysaateista tai 100-2000 ng RNA: ta 18 h automatisoidussa NCounter konetta. Kaikki geenien NCounter codeset analysoitiin samanaikaisesti tosi multiplex tavalla. Raaka määrä normalisoitiin ensin käyttämällä keskimääräistä kuusi sisäistä piikki positiivinen kontrolli antureista kaikille näytteille huomioimaan systemaattisen eroja määrityksiä. Ne hallitsevat normalisoitu määrä verrattiin sitten ilmentymistason B2M (asetettu 100 mukavuussyistä). Tietojen esittäminen, kukin geeni count oli merkitty suhteessa kuin B2M kertomalla kertoimella 100 /(B2M geeni count). NCounter tulokset saatiin ennen patologia syövän noudettiin, ts sokaissut Gleason ja vaiheessa kasvaimia. Nämä patologia piirteet olivat katsoneet asian numerot tulososiossa.

vertaaminen raaka signaaliarvojen saatu (a) PC3 ja (b) C4-2 /​​C4-2B solut näkyvät. Pohjapaneelin (c) esittää vertailun kertamuutosta laskettu saatu data-arvot.

immunohistokemia

Serial 5-um jääleikkeiden kasvainten käsitellä immunovärjäys vasta-aineiden klusterin nimitys (CD) solun pinnan antigeenejä tai muita merkkiaineita, kuten on kuvattu [20]. Monoklonaalinen vasta-aine CD24 (klooni ML5, 01:50) saatiin BD PharMingen (San Diego, CA), monoklonaalinen vasta-aine CCL3 (klooni 4E7, 01:50) oli peräisin Abnova (Taiwan), ja vasta-aine AGR2 (klooni P1G4 , 1:50) tuotettiin meidän lab [26]. Immunovärjättiin leikkeet kuvattiin Olympus BX41 (Melville, NY) varustettu MicroFire digitaalikamera (Optronics, Kuunari, CA). Kuvat prosessoitiin Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA).

histogrammitietoja Näytössä näkyy signaali laskee P08-022N (sininen) ja P08-027N (magenta). Korkea laskennat B2M suljettiin tietojen näyttö. P08-022N ei osoita signaalit syövän markkereita. Sen sijaan P08-027N osoittaa laskee nämä merkit.

Tulokset

Limit of Detection

RNA laimennussarjaan eturauhassyövän linjat C4-2 ja PC3 on valmistettu, ja hybridisoidaan koettimeen kirjaston kuuden valitun halutun geenin: KLK3, CD90 /THY1, AGR2, HPN, pCA3, UPK3A. Raaka laskee normalisoituivat ja data analysoitiin nanoString tilastollisia ohjelmistotyökaluja. Tausta laskee havaittiin olevan 15 ja herkkyys raja oli ~20-30 soluja, joka perustuu runsaasti ilmaisi geenin, kuten KLK3 on C4-2 (Fig. 1). Lukemat olivat hyvässä sopusoinnussa solujen määrä: 22100 KLK3 laskee 10,000 solua; 2400 laskee 1000; 290 laskee 100. On solua kohti perusta, C4-2 osoitti allekirjoitus 2,21 KLK3, 0,06 HPN, 0,01 UPK3A, 0 THY1, 0 AGR2, 0 pCA3, kun PC3 osoittivat allekirjoitus 0 KLK3, 0 HPN, 0 UPK3A , 0 THY1, 0,005 AGR2, 0 pCA3. Allekirjoitusta C4-2 voitaisiin ilmaistu suhteissa pienintä lukema: 220 KLK3, 6 HPN, 1 UPK3A. Ilmaus sovitettu saavutettavasta DNA mikrosiruanalyysillä.

Signaalin laskee P08-024pre (Gleason 3 + 3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2c), P08-025pre (Gleason 3+ 4), ja P08-046pre (Gleason 3 + 4, T2c) on verrattu P08-022N. Huomautus ei vain syövän markkereita mutta myös eturauhasen luminaali markkereita tuotetaan signaaleja (syöpäsolujen myös tuottaa näitä markkereita). B. Kaksi leikesarjojen tuumorinäytesylinterin 08-052A värjättiin CCL3 ja AGR2 ilme. Suurennus on 100x.

geeniekspressioprofiili säilytettiin RNA Amplification

arvioimiseksi RNA vahvistusta, PC3 ja C4-2B RNA monistettiin ja tuloksena tuotteet hybridisoidaan NCounter 20- geeni codeset: ACPP, AGR2, AMACR, ANPEP, AZGP1, B2M, CD90v, BRE, CCL3, CD24, CD9, CRISP3, DPP4, ERG, HPN, IL24, KLK2, MME, pCA3, UPK3A. Kuva. 2A esittää RNA määrä saatuja tietoja Excel-muodossa. Signaali laskee (mistä ~2,000 ng tulo RNA) välillä unamplified ja monistettiin materiaali olivat suhteellisesti vastaava näitä markkereita (Fig. 2B). Suhteellinen runsaus on myös säilytettävä. Merkittävä bias ei nähty mitään transkriptio. Esimerkiksi 2000 ng C4-2B RNA: 151027 laskee B2M, 200 ng tuotti 13,335 laskee, ja 1700 ng monistettiin RNA: 120849 laskee; varten AMACR, samasta RNA tuotetut määrät 114542 laskee, 12095 laskee, ja 69311 laskee vastaavasti. Merkittävin tulos oli, että ei-ilmentyvien geenien (tausta laskee 25-30) ei havaittu, esimerkiksi stroomasolujen geeni CD90v: 40 laskee, 2 laskee, ja 36 laskee, ja IL24:23 laskee, 3 laskee , 26 laskee vastaavasti kolmen määriä RNA.

tiedot näytöllä näkyy korkea signaali laskee saatu, etenkin CD24. B. CD24 immunohistokemia osoittaa voimakkaasti värjätään syöpäsoluja Tuumorinäytteet 01-009E ja 02-034A. Suurennus on 40x.

Concordance välillä NCounter ja DNA Microarray Profilointi

PC3

vs

. PC3 ilman odotettavissa eroa ja C4-2B

vs

. C4-2 muutamalla eroja tarkoituksella valittu vertailuun. Saat PC3, vahva konkordanssin (Pearson

r

= 0,78, Fig. 3) ilmennystasoissa välillä geenin laskee ja array signaali arvoja löytyi. Matalampi korrelaatio (

r

= 0,68) välillä C4-2B ja C4-2 voisi johtua harvoista ilmentyvät eri geenien välillä, esim C4-2B oli positiivinen AGR2 ja C4-2 ei. Kaiken ilmaus taita ero 20 geenien PC3

vs

. C4-2B /C4-2 osoitti korrelaatio

r

= 0,77. Siten NCounter voisi tuottaa tarkan profiilin ilmaisivat geenien ja niiden runsaus erityisissä solutyypeissä.

Virtsa RNA allekirjoitus kuin syövän

Ensimmäinen kohortti mitätöidään virtsanäytteet kerättiin lab vapaaehtoisilla . Kokeellinen data (ei esitetty) osoittivat, että 1) näytteen valmistelu oli riittävä, että ei ollut olemassa merkittävää RNA: n hajoamisen osoittamien signaaleja piikki-in nanoString valvonnan näytteissä; 2) suurempi virtsan tilavuus ei välttämättä tuota enempää soluja; 3) signaalit olivat yleensä alhaisia ​​ilman RNA vahvistusta; 4) verta virtsassa tuotetaan vääriä lukemia. Lisäksi, asettamalla eturauhassyöpäsolujen PC3 ja C4-2 virtsassa 6 tuntia ei tuottanut merkittävän vähenemisen signaalin määrä (tuloksia ei ole esitetty).

käyttäminen RNA-monistusta, toinen kohortti yksilöitä [saada ilman eturauhasen tentti (DRE)] testattiin: P08-022N, P08-027N miehiltä, ​​jotka eivät aikaisemmin diagnosoitu syöpä, joka vieraili UW: n Eturauhassyöpä Tietoisuus; P08-023, P08-024, P08-025, P08-029, P08-046 pre-op (erative) syöpäpotilailla. Käyttämällä histogrammin muodossa tietojen näyttö, kaikki signaali laskee valitun eturauhassyövän geenejä olivat tausta P08-022N: AGR2 = 0,08 [(8 laskee suhteessa B2M = 100 (10,000 lukemaa)], AMACR = 0,46, CD90v = 0,02, CRISP3 = 0,25, ERG = 0,1, HPN = 0,04, pCA3 = 0,09 (Fig. 4, data merkinnät sinisellä). oli myös pieni edustus eturauhasen (erittävien) soluja virtsaan päätellä ACPP = 0,2, AZGP1 = 0,14, KLK2 = 0,06.

Tämä yhdistetty data näyttö havainnollistaa eroa Gleason tulokset (syytettä B2M sisältyvät).

epäilyttävän N asiassa

P08-027N (ikä 54), sen sijaan näytetään syövän kaltainen signature: AGR2 = 0,61 (61 lukemaa), AMACR = 2,33, CRISP = 11,21, ERG = 0,76, HPN = 0,34, pCA3 = 0,53 (Fig. 4, syötettävät magenta), verrattuna ei-syöpä allekirjoitus P08-022N. kanssa 6/6 tunnettu eturauhassyövän markkereita pisteytys edellä tausta, hyvä todennäköisyys, että luovuttaja oli kätkeminen diagnosoimattomasta kasvain. lisäksi syöpä sääteli CD24 oli 7,98. Myös suurempi määrä eturauhasen geenien: ACPP = 1,4, AZGP1 = 0,91, KLK2 = 1,25.

allekirjoitukset Ala Gleason asiat

laskentasignaalit saatu P08-024pre (Gleason 3 +3; PSA = 9,3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2c, PSA = 3,6; kasvaimen tilavuus = 0,6 ml), P08-025pre (Gleason 3 + 4, T2c; PSA = 7; kasvaimen tilavuus = 5 cc ), ja P08-046pre (Gleason 3 + 4, T2c, PSA = 26; kasvaimen tilavuus = 5 cc) verrattuna niihin ei-syöpä P08-022N on esitetty kuviossa. 5A. P08-024pre osoitti AGR2 = 0,67, AMACR = 1,73, CRISP3 = 1,11, ERG = 0,91, HPN = 0,38, pCA3 = 0,59 ja P08-046pre osoitti AGR2 = 0,52, AMACR = 1,21, CRISP3 = 2,03, ERG = 0,66, HPN = 0,21, pCA3 = 0,81. Nämä geeni laskee kuusi syövän merkkiaineet olivat 3-kertaisesti yli taustan laskee ei-syöpä P08-022N. IL24 (0,80 ja 0,43, vastaavasti) löydettiin säädellään ylöspäin syövän [4]. Kasvu CCL3 (3,69 ja 3,08, vastaavasti) saattaa osoittaa läsnäolon G4 tuumorisoluihin CCL3 oli yksi geeneistä yläreguloituja G4

vs

. G3 kasvainsolujen [4]. Kuva. 5B esittää Gleason kuvio 4 kasvainsolut värjäystä varten CCL3 (ja AGR2) in kudosnäytteessä 08-052A. Nämä geeni signaalit voitaisiin myös osaltaan leukosyyttien. P08-029pre, joka tuli pieni kasvaimen 0,6 cc, osoitti marginaalinen (2- ja 3-kertainen taustan yläpuolella) näiden geenien, paitsi AMACR: AGR2 = 0,16, AMACR = 0,32, CRISP3 = 0,78, ERG = 0,28 , HPN = 0,12, pCA3 = 0,19. Toisaalta, P08-025pre oli pieni määrä näitä geenejä paitsi CRISP3: AGR2 = 0,06, AMACR = 0,16, CRISP3 = 2,27, ERG = 0,04, HPN = 0,03, pCA3 = 0,07.

allekirjoitus High Gleason asia

signaalin laskee P08-023pre (Gleason 4 + 5; PSA = 5) oli merkittävästi voimakkaampaa ( 70-kertaisesti yli taustan) verrattuna N: AGR2 = 10,26, AMACR = 32.61, CRISP = 38,35, ERG = 17,15, HPN = 5,74, pCA3 = 10,8 (Fig. 6A). Erityisesti, erittäin korkea CD24 määrä (111,95) saatiin. Suuri määrä eturauhasen kasvaimia osoittavat lisääntynyt CD24-värjäys [20], ja voimakkaasti värjättiin Gleason kuvio 5 soluja voidaan nähdä kuviosta. 6B muistilohkottuun Tuumorinäytteet 01-009E ja 02-034A. Lisäksi, CD90v = 4,19 syöpään liittyvän stroomasolujen havaittiin. Vaikuttaa siltä, ​​että tässä tapauksessa enemmän syöpäsoluja ja muiden solutyyppien päästettiin virtsaan. Tämä voi johtua menetys histoarchitectural eheyden kehittyneissä sairauksien (joka voi myös johtaa korkeampiin seerumin PSA-arvot). Yhdistetty data näyttö kuvassa. 7 esittää signaalin ero tämän korkealaatuisesta syöpä ja muut.

Keskustelu

Käyttämällä nanoString tekniikka, olemme kehittäneet monen markkerin virtsa testi, joka voidaan mahdollisesti soveltaa seulontaan, havaitseminen ja potilaan kerrostuminen eturauhassyöpää. RNA allekirjoitukset saatu meidän satunnaisesti valittujen ensimmäinen kohortti kliinisten virtsanäytteet lupaavia, että ne voi havaita syöpä neljässä viidestä ennalta op yksilöitä perustuu kuuteen tunnettu eturauhassyövän markkereita kuten pCA3, nykyinen virtsa-pohjainen merkki. Vielä tärkeämpää on, P08-023pre potilaalta, jolla korkea-asteen tauti ilmeni runsaasti RNA laskee monille markkereita. Mitä tulee epäilyttävä P08-027N tapauksessa lisätestejä ei voida tehdä, koska olinpaikasta tämän kertaluonteisen luovuttaja ei tunneta.

pCA3 virtsa testi osoittaa, että syöpäsolujen löytyy virtsasta. Toisin kuin pCA3 testi, meidän virtsan testaus ei vaadi tarkkaavainen DRE, vaikka DRE voisi lisätä signaaleja mekaanisesti aiheuttamaan lisää solun vapautumista rauhanen [7]. Siten NCounter testi voitaisiin kehittää ei-invasiivisen syövän seulontaan. Tämä tavoitteenaan, testaus suuren ikäluokan miesten peräisin väestöön, joilla ei ole diagnosoitu syöpä on erittäin tärkeää, koska perustason ilmentyminen valitun eturauhassyövän markkereita virtsassa ei tunneta.

Monet eturauhassyövän markkereita ilmaistaan ​​myös ei-eturauhasen solutyyppejä, esimerkiksi AMACR munuaistiehyeiden solujen [27], CRISP3 sekretorisessa epiteelin miehen sukuelimet, [28], ERG mRNA: ta ja proteiinia endoteelisoluissa (vaikka ERG fuusio on nimenomaan eturauhassyöpä) [29], HPN vuonna epididymiksen rakkularauhanen (The Human Protein Atlas, https://www.proteinatlas.org), AGR2 vuonna uroteelin ja munuaisten tubulussolujen (The Human Protein Atlas ja julkaisematon data) . PCA3 ollessa ei-koodaava transkripti, sen ilme ei ole laajalti kartoitettu immunohistokemiallisesti kuin muut. Vaikka geeni allekirjoitukset kaikenlaisen urogenital syövän /sairaudet ovat suureksi osaksi tuntemattomia, kuusi tunnettua eturauhassyövän geenejä AGR2, AMACR, CRISP3, ERG, HPN, ja pCA3 ovat tai alle tausta, esimerkiksi virtsarakon syöpä [30] . On todennäköistä, että kunkin urogenitaalisen maligniteetin /tauti aiheuttaisi ainutlaatuinen geeni allekirjoitus. Esillä NCounter codeset on suunniteltu erityisesti eturauhassyövän perustuu käytettävissä olevien tietojen tasalla. Post-op virtsa (Hyväksytty pre-op) on informatiivinen, onko kaikki syövän markkereita (plus prostataspesifisen niistä) katoaisi leikkauksen jälkeen. Potilailla käsitelty fokusoitu säteily, syöpä markkereita mutta ei ACPP, AZGP1, KLK3 häviäisi jos kasvain on onnistuneesti ablatoitu. Muita kysymyksiä ovat: mikä on päivä-to-day vaihtelua, jos lainkaan, että allekirjoitus; tekee allekirjoitus on yhteys ikään kuin seerumin PSA; mikä on määrä normaalin

vs

. syöpäsolujen irtoa virtsaan.

NCounter probeset voidaan laajentaa koskemaan useita yleisempää geenejä (vieressä B2M) geenien määrä vertailua varten, ja muut markkereita havaitsemiseen spesifisten solutyyppien kuten PTPRC /CD45 valkosoluja, PECAM1 /CD31 endoteelisolujen, NCAM1 /CD56, B3GAT1 /CD57, NGFR /CD271 hermosolujen elementtejä, UMOD (uromodulin) munuaisen solut (ja UPK3A virtsarakon soluja). Probe suunnittelu ei ole täydellinen, ja joskus uusia probesets saattaa olla tarpeen, jos ensimmäiset heikkoa, esim DPP4 /CD26 nykyisessä codeset. Sekä luminaalisen ja syöpäsolut voimakkaasti immunovärjättiin CD26, mutta signaali laskee DPP4 olivat yleensä alhaisia. Eturauhassyövän spesifisyys, miesten negatiivinen koepaloja, eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu, eturauhastulehdus, sekä miehillä virtsarakon ja munuaisten syöpään testataan. Spesifisyys on kasvanut multiplex muodossa NCounter. Valitut markkereita ovat ne, joilla on lisääntynyt ilmentyminen eturauhassyövässä kuten pCA3 ja AGR2. Useat tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet, että virtsa pCA3 pisteet voisi tarjota lisäkeino lääkärit voivat hallita potilaille [31]. Bu

et al

. havaittu virtsassa AGR2 RNA qRT-PCR mukana 31 tapauksessa (positiivinen biopsia) ja 29 tarkastukset (negatiivinen biopsia) osoittaakseen, että virtsa AGR2 transkripti päihitti seerumin PSA [32]. NCounter codeset paitsi sisältää pCA3 ja AGR2 vaan myös probesets muihin informatiivinen markkereita. Teoriassa anturi kirjasto voi sisältää kaikki geenit (myös EST) tunnistaa kautta geeniekspressioanalyysissä kuin säädellään ylöspäin eturauhasen syöpäsoluja.

NCounter Testi sopii seurantaan potilaiden aktiivista seurantaa. Nämä ovat miehiä, joilla on diagnosoitu syöpä, mutta patologian ominaisuudet niiden kasvain Ehdottaisin ei-tappavia syöpä [33], [34]. Ensimmäinen virtsa RNA allekirjoitus kullekin potilaalle saadaan aikaan ilmoittautuminen. Kukin potilas voi sitten seurata määräajoin NCounter testi onko muutoksia RNA nimikirjoitus taudin etenemiseen mitattuna PSA kaksinkertaistui aika, Gleason luokittelua, DRE tai näyttöä syövän leviämistä.

Koska seulonta työkalu, kaikki ihmiset voivat saada allekirjoituksen iässä 40 ja seuraa vuosittain tai joka toinen vuosi muutoksia tähän lähtötason virtsassa RNA profiilin. Multipleksisiirtomenetelmä ELISA mittaamaan eturauhassyövän eritettyjä proteiineja (esim AGR2 ja muut) voidaan mahdollisesti kehittää täydentämään RNA testi. Siten, korrelaatio AGR2 RNA laskee ja AGR2 proteiinin määrä on sama näytteiden täytyy suorittaa. Virtsa supernatantti konsentroidaan spin suodattamalla mittaus AGR2 proteiinin äskettäin kehitetty sandwich AGR2 ELISA [26]. Näin vaihtoehtoisesti kaikki ihmiset voisivat seuloa AGR2 ELISA. AGR2 signaali kehottaa sitten NCounter testaus pisteet ilmentymisen muu syöpä merkkiaineita vahvistusta.

Lopuksi NCounter testi on monipuolinen ja voi sisällyttää markkereita muita urologic syöpien, kuten virtsarakon [30] ja munuaisissa. Lisäksi on mahdollista sisällyttää merkkiaineita tahansa tautia virtsateiden elimiä tehdä monikäyttöinen kliininen koe. Kerääminen ja käsittely virtsaa on helppo suorittaa ja hinta on edullinen (arviolta 100 $ testi). Vielä tärkeämpää on, digitaalisen datan ulostulo tätä testiä voidaan helposti arkistoida ja seurata, ja on helposti ymmärrettävissä lääkäreille ja potilaille.

Kiitokset

Kiitämme Deanna Gonzalez ja Jennilee Kho potilaan suostumus ja virtsan keräys ja Jennifer Noteboom hakemiseksi patologian tietoja.