Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain p53, joka aktivoituu eri stressi ja onkogeeni aktivointi, on tavoite syöpälääkettä kehittäminen . Tässä tutkimuksessa, seulomalla paneelit proteiinikinaasi-inhibiittoreita ja proteiini fosfataasi-inhibiittorit, olemme määritelleet 5-Iodotubercidin niin vahva p53 aktivaattori. 5-Iodotubercidin on puriinijohdannainen ja käytetään estäjä erilaisten kinaasien kuten adenosiini kinaasi. Huomasimme, että 5-Iodotubercidin voi aiheuttaa DNA-vaurioita, varmistettiin induktio DNA taukoja ja ydinvoiman pesäkkeitä positiivinen γH2AX ja TopBP1, aktivointi Atm ja Chk2 sekä S15 fosforylaatio ja säätely ylöspäin p53. Sinänsä, 5-Iodotubercidin indusoi G2 solusyklin pysähtymisen p53-riippuvaisella tavalla. Itu myös indusoi solukuolemaa p53-riippuvaisen ja riippumattaman tapoja. DNA taukoja olivat todennäköisesti syntyy sisällyttämällä 5-Iodotubercidin metaboliitin DNA: han. Lisäksi 5-Iodotubercidin osoitti kasvaimen vastainen vaikutus, koska se voi vähentää kasvaimen kokoa -ksenograftia hiirimalleissa p53-riippuvainen ja riippumattaman tapoja. Nämä havainnot osoittavat, 5-Iodotubercidin uutena genotoksisia lääke, joka on kemoterapeuttinen potentiaali.

Citation: Zhang X, Jia D, Liu H, Zhu N, Zhang W, Feng J, et al. (2013) tunnistaminen 5-Iodotubercidin perimää Drug Anti-Cancer Potential. PLoS ONE 8 (5): e62527. doi: 10,1371 /journal.pone.0062527

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 joulukuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2013; Julkaistu: 7. 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (81130039, 31071229 ja 81121001), Ministry of Science and Technology of China (National Key Scientific Program (2012CB966901, että BL)), Shanghai Pujiang Program (10PJ1405000), Cheung Kong Tutkijat ohjelma opetusministeriön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi johtavista syistä kuolleisuuden maailmanlaajuisesti. Mukaan äskettäin julkaissut tietoja, oli 12,7 miljoonaa uutta syöpätapausta ja 7,6 miljoonaa syöpäpotilaiden kuoli vuonna 2008, rintasyöpä on yleisin naisilla ja keuhkosyövän yleisintä miehillä [1]. Syövän hoito sisältää kirurgisten poistamiseksi pahanlaatuista kudosta ja käyttöä sädehoidon ja kemoterapia tappaa pahanlaatuisia soluja ja /tai rajoittaa kasvaimen kasvua. Kemoterapeuttiset lääkkeet jaetaan alkyloivat aineet, antimetaboliitit, topoisomeraasin estäjät, kasvialkaloidit ja terpenoideja, anti-kasvain antibiootteja, ja muut [2]. Tähän asti on puute onnistu, näyttö hoito useimmille syöpätyyppien [3].

Anti-aineenvaihduntatuotteet ovat johdannaisia ​​nukleosidien, kuten pyrimidiinianalogien. esim., gemsitabiini ja puriinianalogit, esimerkiksi, fludarabiini [4]. Ne voidaan sisällyttää DNA: han, joka johtaa päättymiseen muodostuvien DNA-juosteen pidennys. Jotkin nukleosidianalogeja voidaan myös estää osallistuvia entsyymejä DNA-synteesiä tai entsyymejä, jotka ylläpitävät deoksinukleotideja homeostaasiin, edelleen häiritsee DNA: n synteesiä. Sinänsä monet näistä nukleosidianalogien aiheuttaa DNA-vaurioita, mukaan lukien kahden ja yhden DNA rikkoo laukaista sisäisiä puolustusmekanismeja tappaa nopeasti jakautuvien solujen tai solujen, joille aktiivinen DNA korjaukseen, tai aiheuttaa solusyklin pysähtyminen S-vaiheeseen [4]. Tämä on merkittävä mekanismi, jonka useimmat antimetaboliittien tehtävistään syövän vastainen vaikutus.

soluissa, DNA-vaurioita tai genotoksinen lääke aktivoi perheen PI3K kuten kinaasien (PIKKs) sisältäen atm, Atr, ja DNA- PKcs DNA-katkoksia tai pysähtynyt replikointi haarukat, jossa he fosfory- erilaisia ​​proteiineja kuten γH2AX, TopBP1, Chk1 /2 ja p53. Integroitu aktivoituminen näiden efektoriproteiinit indusoi solusyklin pysähtymiseen, solun vanhenemista tai apoptoosin [5], [6]. Tämän seurauksena, soluja, joilla on epästabiili genomin eliminoidaan, mikä estää kasvaimen muodostumisen [7] – [11]. ATM-p53-reitin on suuri kasvain tukahduttaa polku ja p53 on mutatoitunut enemmän kuin 50% ihmisen ensisijaisen kasvaimissa [12] – [14].

p53 aktivaation edistää solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista ja apoptoosia. Aktivointi tai ylös-säätely p53 kasvaimia on osoitettu estävän tuumorin kasvua, perustamisesta p53 kohteena syövän lääkekehityksessä [13], [15]. Useat pienmolekyyliyhdisteitä on kehitetty jotka on kohdistettu erityisesti MDM2-p53 vuorovaikutus, vakauttaa p53, ja estää kasvaimen kasvua. Lisäksi, p53 voidaan toimittaa kasvaimia viruksia ja tämä on osoitettu olevan merkittäviä terapeuttisia vaikutuksia [16]. Jos haluat etsiä uusia potentiaalisia anti-kasvain huumeet, me seulotaan pienmolekyylisalpaajilla paneelin proteiinikinaasien ja paneelin proteiinia fosfataasien yhdisteitä, jotka voivat aktivoida p53 [17]. Me raportoimme tässä tunnistaminen 5-Iodotubercidin (ITU) p53-aktivaattorin. Itu käytetään yleisesti estäjät, erityisesti adenosiini-kinaasi (ADK), koska sen affiniteetti ATP-sitoutumiskohtien näiden entsyymien ja on osoitettu vaikuttavan solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. ADK katalysoi siirtoa γ-fosfaattiryhmän ATP: adenosiini, jolloin alas-säätelemällä solujen tasot adeniininukleotidien [18] – [20]. ITU on rakenteeltaan samanlainen kuin adenosiini ja sen kuvassa tuottaa DNA-vaurioita, aktivoi atm-p53-reitin, ja aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G2 vaihe p53-riippuvainen käytös. Itu edistää myös solukuolemaa p53-riippuvaisen ja riippumattaman tapoja. Vielä tärkeämpää on, Itu havaittiin olevan anti-kasvain aktiivisuus, myös p53-riippuvaista ja riippumattaman tapoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Itu on mahdollinen kemoterapeuttinen lääkeaine, jonka ominaisuudet eroavat useimmista muista anti-metaboliitit. Koska Itu suorittaa sen antituumorivaikutuksen pääasiassa kautta tuottaa DNA-vaurion, Itu voi myös aiheuttaa genomin epävakautta normaaleissa soluissa ja mahdollisesti johtaa syövän kehittymiseen. Siksi varovaisuutta tulee noudattaa käytettäessä Itu mahdollisten muiden kuin syöpään liittyvät terapeuttinen tarkoitus.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Eläinkokeet tässä tutkimuksessa, kuten BALB /cASlac nude-hiirissä, normaali C57B /6-hiiret, atm +/- hiiret, tehtiin suositusten mukaisesti vuonna National Research Council opas hoito ja käyttö Laboratory Animals, jossa protokollat ​​hyväksymän Institutional Animal Care ja käyttö komitea Shanghai , Kiina [SYXK (SH) 2011-0112]. Kaikki pyrittiin minimoimaan kärsimyksen hiirillä.

Cell Culture

Ensisijainen hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluja (peräisin C57B /6-hiiret) ja Atm – /- MEF (129 hiiristä ) tuotettiin laboratoriossa, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa HCT116 (p53 + /+) ja HCT116 (p53 – /-) olivat lahja B. Vogelstein laboratoriosta [21], [22]. Näitä soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone), 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

Western blot -analyysi

Solut hajotettiin TNEN puskurissa (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, ja 0,1% Triton X-100), jota oli täydennetty 1 mM NaF, Na

2VO

3, 1 mM PMSF: ää, ja 1 ug /ml aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini A Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad-määritystä. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore). Vasta-aineita p-atm, p-Chk2 (Thr68), Chk2, p-p53 (Ser15), tai p53 saatiin Cell Signaling. Vasta-aineita Atm (GTX70103) olivat Genetex. Vasta-aineita β-aktiini oli Santa Cruz Biotechnology.

RNA hiljentäminen

Pieni häiriöitä RNA (siRNA) kohdistaminen ihmisen ADK saatiin GenePharma yrityksen ja transfektoitiin HCT116 soluihin valmistajan ohjeiden protokollaa. Down-regulation ADK arvioitiin reaaliaikainen PCR 72 tuntia transfektion jälkeen. Sekvenssit siGENOME ADK SMARTpool olivat AGGGAGAGAUGACACUAUA; GGAGAGAUGACACUAUAAU; AAAGUUAU GCCUUAUGUUG; ja GAGAGAUGACACUAUAAUG. Negatiivinen kontrolli UUCU CCGAACGUGUCACGUTT; ACGUGACACGUUCGGAGAATT.

Immunofluoresenssi Histochemistry

MEF tai HCT116-soluja viljeltiin peitelasit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kahdesti ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA), jotka läpäiseviksi 0,1% Triton X PBS: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin PBS: ään, jossa oli 1% BSA: ta (1:200). Objektilasit blokattiin (1% BSA PBS: ssä) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, niitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, ja jota seurasi sekundaarisen vasta-aineen inkubointi 60 min huoneenlämpötilassa. Levyjä sitten asennetaan ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla.

RNA uuttaminen ja Realtime PCR

RNA: t soluista uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin käyttäen Quantscript RT Kit (Tiangen). MRNA-tasot kohteisiin määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä, ja normalisoidaan tasot β-aktiini. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 järjestelmässä.

Cell Cycle Analysis

Solut ympättiin 35 mm: n maljoihin ja viljellään 24 tunnin ajan ja oli 60-70% konfluenssiin. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Itu 24 tai 48 tunnin ajan, kerättiin trypsiinikäsittelyllä, suspendoitiin uudelleen 200 ui PBS: ää, ja kiinnitettiin 100% etanolia yön yli 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pelletoitiin sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 800 ul PBS: ää, joka sisälsi ribonukleaasi A (100 ug /ml) ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Sitten 10 ui propidiumjodidia (PI, 4 mg /ml PBS) lisättiin näytteisiin, jotka arvioitiin FACSCalibur fl ow taussytometrin käyttäen Cell Quest ohjelmistoa (BD Bioscience).

Cell eloonläämismääritys

mittaamiseksi solujen eloonjäämisaste jälkeen Itu hoidon, solut maljattiin 1 x 10

4 96-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli, jotka sitten käsiteltiin Itu 48 tuntia. Solujen lisääntymisen reagenssi WST-1 (Roche) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin vielä 4 tuntia 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitataan kontrollina käyttäen mikrolevyn lukijaa 440 nm: ssä. Viittaus aallonpituus oli 630 nm.

-ksenograftia Mouse Models

Male BALB /cASlac-nude-hiiriin (3 viikkoa vanhoja) hankittiin Shanghai SLAC Laboratory Animal C. LTD. Hiiriä pidettiin SPF hiiren laitos 1 viikon ennen ympätty HCT116-solujen. HCT116 (p53 + /+ ja p53 – /-) solut kerättiin trypsinoimalla, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään pitoisuus 5 x 10

7 /ml. Me pistetään ihon alle 3 × 10

6 solujen BALB /cASlac nude-hiirissä selkään, jossa p53 + /+ solujen vasemmalla puolella ja p53 – /- solut oikealla puolella. 2 viikon kuluttua hiiret jaettiin useisiin ryhmiin ja käsiteltiin Itu tai liuotinta (PBS). Hiiret punnittiin ja koko kasvaimen mitataan. Pituus (L) ja leveys (W) kasvain mitattiin digitaalisella paksuus ja ilmaistiin kasvaimen tilavuus (0,5 × W

2, mm

3).

Perimän DNA Analysis HPLC-MS:

MEF-solut ja HCT116 solut paikallaan tai log-vaiheeseen käsiteltiin Itu eri aikoja. Genomi-DNA uutettiin fenoli /kloroformilla, pestiin huolellisesti 70% etanolilla, ja sitten digestoitiin käyttäen aiemmin raportoitu menetelmä, jossa muutokset [23]. Lyhyesti, alikvootit genomisen DNA: ta inkuboitiin 1 ul: DNaasi I (2 U /ul, NEB), 10 ui Snake Venom fosfodiesteraasin (0,26 mU /pl, Sigma Aldrich), ja 2 ui Etelämantereen fosfataasilla (5 U /ul, NEB) yön yli 37 ° C: ssa. Täydellinen digestio johti seokseen, jossa oli mononucleosides, arvioituna HPLC: llä. Digestoitu DNA-näytteet analysoitiin HPLC-MS-järjestelmä oli varustettu Agilent C18-pylväs (Agilent, San Jose, CA, USA). Liuotin A oli vettä, joka sisälsi 0,5% (v /v) muurahaishappoa, ja liuotin B oli metanolia, joka sisältää 0,25% (v /v) muurahaishappoa. Eluutioprofiilille käytettiin 2-20% B: tä 30 minuutin ajan lisäämällä 98% yli toisen 20 min, sitten 98% B: tä 10 minuutin ajan, ja lopulta palaavat 2% B 20 min aikana. Virtausnopeus asetettiin 20 ul /min ja eluaattia seurattiin 254 nm: ssä. Tyypillisesti, 5 ui kutakin näytettä injektoitiin käyttämällä hyvin levyn näytteenottaja.

Massaspektrometrinen analyysi Näytteiden muodostavat HPLC-systeemiä suoritettiin suoraan Agilent ESI-TOF-massaspektrometriin. Massaspektritulokset kirjattiin positiivisionisella tilassa koko keston HPLC aikavälillä. Tiedot analysoitiin käyttämällä Analyst QS (Agilent, San Jose, CA, USA).

analyysi Cellular dNTP Tasot

aiemmin validoitu LC-MS /MS lähestymistapaa käytettiin määrittämään dNTP pitoisuuksien [24]. Standardiliuokset dATP ja dGTP (dCTP ja dTTP jätettiin pois teknisten vaikeuksien vuoksi tämän järjestelmän avulla) pitoisuutena 100 mmol /l käytettiin rakentaa 0, 19,5, 39, 312,5, 625, 1250 ja 2500 ng /ml standardi kalibrointikäyrää.

solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan jääkylmää 60% metanolia, vorteksoitiin, ja sijoitettiin 95 ° C: ssa 3 minuutin ajan ja sonikoidaan 30 s Branson Sonifier 450 ( Branson, Danbury, CT, USA). Uutteet sentrifugoitiin 16000 g: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa solujätteen poistamiseksi ja saostettiin proteiini ja DNA: ta. Tuloksena Supernatantit läpi tasapainotettiin ennalta Amicon Ultra-0,5-ml sentrifugisuodattimet 4 ° C: ssa poistamaan makromolekyylien ( 3 kDa) seuraavat protokollaa valmistajan (Millipore, Billerica, MA, USA). Suodos haihdutettiin tyhjiökuivainsentrifugia -70 ° C: ssa ja saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 25 ui: aan nukleaasitonta vettä valmis määrittämään tai säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Ennen HPLC-analyysin näytteet kuivattiin tyhjössä uudelleen, suspendoitiin 0,5 ml: aan HPLC-H

2O, joka sisälsi kaksi yksikköä, happaman fosfataasin (0,26 mU /pl, Sigma Aldrich), ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa, tuottaa deoksinukleotidien. 30 ui näytettä injektoitiin ACQUITY UPLC (Waters, USA) HPLC-systeemiä käytössä lämpö C18 100 x 2,1 mm, jonka jälkeen partikkelien 5 um kvadrupoli tandem massaspektrometriä (Applied Biosystems TRIPLA- QUAD 5500). Analyst 1.5.2.A vaihegradientilla ohjelma on sovellettu erottamaan kaikki analyytit virtausnopeudella 300 ml /min. Liikkuva faasi koostui metanolista (komponentti A) ja 20 mmol /l ammoniakin asetaattipuskurissa pH: ssa 4,5 (komponentti B). Erottamisen jälkeen, analyyttien HPLC efferent syötettiin massaspektrometriin kautta TurboIonspray rajapinnan yhdistettynä lämmitetty turbo typpivirrassa haihdutetaan liuottimet ja lisätä ionisaatiota tehokkuutta. Seuraavat massa siirtymiä seurattiin-dA: 252,2 /234,1; dA1:252.2 /96,0; dG: 268,1 /232,1; dG1:268.1 /184.1; dG2:268.1 /124.1. A ja A1 ovat johdannaisia ​​dATP ja G, G1 ja G2 ovat johdannaisia ​​dGTP.

Tulokset

tunnistaminen Itu kuin p53 Activator

Jos haluat etsiä p53 aktivaattorit, me seulottiin western blot -analyysillä paneelin estäjät ja paneeli fosfataasiestäjät etsiä tunnettujen yhdisteiden, jotka voivat säätää ylös p53 proteiinin tasot (ja lista-inhibiittorit, katso taulukko S1) [17]. Ensisijainen MEF käytettiin seulontaan, koska solulinjat yleensä mutaatioita p53 ja /tai sen alkupään sääntelyviranomaisten. Nämä inhibiittorit levitettiin 10 uM pitoisuus valmistajan suosittelemaa eston kinaasien tai fosfataasien. Kaksi yhdistettä ulos 113-inhibiittorit kykenivät indusoimaan p53-ilmentymisen proteiinin tasot. Yksi on 5-Iodotubercidin (Fig. 1A), joka on yhdiste, jota käytetään inhibiittoria adenosiini-kinaasin ja muiden kinaasien, kuten Erk2. ITU on osoitettu olevan antikonvulsiivinen aktiivisuus sekä [19]. Itu aiheuttama p53 ylössäätöä havaittiin sekä MEF ja HCT116, jossa jälkimmäinen koolonisyöpäsolulinja positiivinen p53 (Fig. 1 B ja 1 C). Annostus kokeet osoittivat, että Itu pystyi ajan säädellä p53 niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 0,25 uM (Fig. 1 B ja 1 C).

. Rakenteiden Itu, adenosiini, ja Fludarabiini. B. Western blot osoittaa, että Itu up-regulation p53 MEF annoksesta riippuvaisella tavalla. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Itu 8 tuntia ja tasot p53 analysoitiin western-blotilla. C. Western blot osoittaa, että Itu up-regulation p53 HCT116-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Itu 8 tuntia ja tasot p53 analysoitiin western-blotilla. Pidemmän alttiina elokuva osoitettiin myös osoittavan, että p53 ilmennettiin HCT116 solujen perustasoon. D. Knock-down ADK ei aktivoinut p53. Vasen paneeli: lasku ADK mRNA läsnäollessa ADK siRNA; Oikea paneeli: proteiini tasot p53 läsnäollessa ohjaus ja ADK siRNA HCT116-soluissa.

Miten Itu indusoi p53 säätelyä ylöspäin? p53 ilmentymistä ajan säädellään eri stressi ja onkogeeni aktivointi, erityisesti genotoksinen stressi [25]. Koska Itu on laajalti käytetty estäjä ADK, joka on keskeisessä asemassa adenosiini homeostaasiin [26], [27], on mahdollista, että Itu häiritsee adenosiini homeostaasiin, häiritsee DNA-synteesin ja aiheuttaa DNA-vaurioita ja siten aktivoi p53. Jos tämä on totta, kaatamalla ADK matkisi ADK esto ITU jopa säätelevä p53. Käytimme yhdistettiin siRNA kaataa ADK in HCT116-soluissa (kuvio. 1D, vasen paneeli), ja totesi, että lasku ADK tasoa, toisin kuin esto ADK kanssa Itu, ei merkittävästi muuttanut proteiinin tasot p53 on perustaso ( kuva 1D, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että Itu aiheuttama p53 ylössäätöä ei todennäköisesti aiheutunut suoraan estämällä ADK.

Itu syyt DNA-vaurio

Itu on puriini kaltainen rakenne jossa ”NH” korvataan ”CI” at 7

th asema puriininukleosidi (Fig. 1A). Itu voidaan sisällyttää DNA jälkeen muunnettu deoksiriboosisokeriosan by ribonukleotidireduktaasiin [4]. Itu teoriassa voisivat muodostaa 2 vetysidoksia tymidiinin kaksijuosteinen DNA (Kuva. S1). Kuitenkin, ITU-T pariksi voi aiheuttaa väli ongelma ”C-I” Itu (asemassa 7) on paljon suurempi kuin ”N-H” adenosiini, ja muuttaa puriini rengas voi olla tunnistettavissa DNA-polymeraaseja. Lisäksi ”C-I” Itu on varsin aktiivinen ja epävakaa. Itu on siis todennäköisesti metaboloituu ja sittemmin sisällytetty DNA aiheuttaa DNA-vaurioita. Tämän varmistamiseksi me testattiin ensin onko Itu voisi muuttaa karyotyyppejä ja HCT116-soluja. Solut käsiteltiin ensin Itu 36 tuntia ja sitten karan myrkkyä kolkisiinin tiivistyä kromosomeja. Lukumäärä ja ulkonäkö kromosomien analysoitiin valomikroskoopilla jälkeen gimsa värjäystä. On selvää, että Itu käsittely johti ulkonäön rikki kromosomien 32% ITU-käsiteltyjen solujen verrattuna 0% käsittelemättömillä soluilla (Fig. 2A), viittaa siihen, että Itu voi aiheuttaa kaksijuosteisen DNA: n taukoja.

A. Edustavia kuvia karyotyyppejä ja HCT116 puuttuessa tai läsnä Itu. B. havaitseminen Itu johdannaisen genomi-DNA: jäljittelevän soluissa. HPLC-MS-analyysi Itu metaboliittien genomi-DNA: ITU-käsiteltyjen solujen. Genominen DNA eristettiin ITU-käsitellyistä soluista ja sulatettu nukleosideja, jotka analysoitiin HPLC: llä (vasen paneeli), joka liittyy suoraan massaspektrometriin. MS-analyysi molekyylin kokoon DTU näytettiin oikeassa paneelissa. C. Solunsisäinen dATP ja dGTP altaat eivät vaikuttaneet Itu hoitoa. A ja A1 ovat johdannaisia ​​dATP ja G, G1 ja G2 ovat johdannaisia ​​dGTP.

Osa kemoterapeuttisten toimivat interkalatoivista DNA (esim doksorubisiinin) tai ristisidosyhdisteiden DNA (esim sisplatiini), kun taas nukleosidianalogit tuottaa DNA taukoja sisällytettynä DNA ja häiritseviä nukleotidin pariksi. Testata, onko Itu voidaan metaboloituu ja osaksi genomi-DNA replikaation aikana, olemme sitä analysoitiin johdettujen nukleotidien eristetyn genomisen DNA: ITU-käsitellyissä soluissa, jotka olivat joko stationäärivaiheessa tai tukin vaiheessa HPLC-massa- spektrometrillä. Identiteetti nukleosidien varmistettiin vertaamalla vastaavaan vertailuaine. Itu (MW 392,153) voidaan metaboloituu deoksi-iodotubercidin (Ditu, MW 376,154), tubersidiini (TU (jossa epästabiili -I poistettu), MW 266,257), ja deoksi-tubersidiinin (DTU, MW 250,257). Ensin verrattiin nukleotidia, jotka ovat peräisin genomisesta DNA: HCT116 ja MEF-soluista, ja havaitsivat, että HCT116 oli paljon monimutkaisempi spektri nukleotideja ja niiden johdannaiset kuin MEF-, viittaa siihen, että nukleotidien metaboliaa voisivat muuttua syöpäsoluja. Sitten päätti käyttää MEF testata onko Itu johdannaiset sisällytetään DNA. Olemme havainneet, että DTU oli läsnä genomi-DNA: ITU-käsiteltyjen log-vaiheen soluissa, mutta ei paikallaan soluja tai käsittelemättömiä soluja (Fig. 2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Itu metaboloituu (jossa -I poistettu) ja ne on sisällytetty DNA.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että puriinianalogit, kuten fludarabiini Klofarabiini voivat estää ribonukleotidireduktaasia, entsyymi, joka katalysoi ribonukleotidien deoksiribonukleotideiksi, mikä vähentää tasot solun dNTP: ja häiritsee DNA: n synteesiä [4]. Olemme havainneet, että käsittely Itu annoksilla riittävästi upregulate p53 ei ollut vaikutusta mRNA: n tasot ribonukleotidireduktaasin. Vertasimme myös altaat dATP ja dGTP, jotka ovat tuotteita ribonukleotidireduktaasia, valvonta ja Itu-käsiteltyjen solujen massaspektrometrian jälkeen vakiintunut protokollaa, ja totesi, että Itu hoito ei vaikuta altaat dATP tai dGTP soluissa ( kuva 2C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että Itu ei estä ribonukleotidireduktaasia.

Validoida Tämän toteamuksen käsittelimme HCT116 ja MEF kanssa Itu 8 tuntia ja analysoitiin muodostumista DNA-vaurion aiheuttama ydinaseiden pesäkkeitä, joita oletettu kuten DNA-vaurioita ja korjaus keskuksissa [28], [29]. Yksi varhaisimmista proteiinit kootaan DNA tauot ovat γH2AX, histoni H2A variantti, joka ilmentyy kaikkialla. Se voidaan fosforyloida PIKK jäsenet, kuten Atm ja Atr nopeasti sen jälkeen, DNA-vaurion [30]. Teimme huomaavat Itu hoito johti kertymistä ydinvoiman pesäkkeitä positiivisia γH2AX molemmissa HCT116 (10,39 ± 1,82% käsittelemättömien solujen vs. 90,19 ± 2,21% ITU käsitellyt solut) ja MEF (7,45 ± 0,29% käsittelemättömien solujen vs. 91,63 ± 0,73%: ITU käsiteltyjen solujen) (Fig. 3A ja 3B). Lisäksi Itu käsittely johti myös kertymistä ydinvoiman pesäkkeitä positiivisia TopBP1, toinen pesäkkeitä-lokalisoitu proteiinin, vuonna HCT116 (14,25 ± 5,12% käsittelemättömien solujen vs. 95,24 ± 1,39% ITU käsitellyt solut) ja MEF (13,08 ± 5,15% käsittelemättömien solujen vs. 93,32 ± 2,70% ITU käsiteltyjen solujen) (Fig. 3A ja 3B).

. Hoito HCT116 1 uM Itu 8 tuntia aiheuttama ydinaseiden pesäkkeitä positiivinen γH2AX, TopBP1, ja aktivoitu Atm. Kofeiini hoito vähensi muodostumista näiden pesäkkeitä. HCT116-soluja esikäsiteltiin kofeiinia (5 mM) 1 tunnin ajan, ja sitten Itu lisättiin viljelmiin vielä 8 tuntia. Solut kiinteän ja värjättiin γH2AX, TopBP1 tai p-Atm. B. Hoito MEF 1 uM Itu 8 tuntia aiheuttama ydinaseiden pesäkkeitä positiivinen γH2AX, TopBP1, ja aktivoitu atm.

Itu Aktivoi Atm

Lisäksi pesäkkeitä positiiviseksi γH2AX ja TopBP1, Itu käsittely johti myös ydinvoiman pesäkkeitä positiivisia p-atm (10,13 ± 2,88% käsittelemättömien solujen vs. 85,84 ± 4,63% ITU käsiteltyjen solujen) (S1981 fosforylaatio, osoitus Atm aktivointi) (Fig. 3A ja 3B) [31], mikä osoittaa, että Itu aiheuttaa DNA-vaurioita ja aktivoi Atm. Tämän mukaisesti havainnon, Itu aiheuttama p-Atm ja γH2AX pesäkkeitä muodostumista HCT116-soluissa voisi vähentyä (alas 15,37 ± 1,15% ja 9,00 ± 1,19% vastaavasti) käsittelemällä kofeiinia, estäjä Atm ja Atr (Fig. 3A ). Tukeakseen toteamisesta Itu aktivoi atm, käytimme western blot analysoida Atm S1981 fosforylaatio sekä atm välittämän Chk2 fosforylaation. Vaikka Atm arvellaan vain aktivoida kaksijuosteista DNA taukoja [7], [31], [32], viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että nukleosidianalogit voivat myös aktivoida atm sekä sen loppupään reittejä [30], [33], [ ,,,0],34]. Atm on todettu paikallistaa pysähtynyt replikointi haarukat ja saattavat estää haarukan romahduksen soluissa [30], [33]. Olemme havainneet, että Itu hoito johti ajasta riippuva fosforylaatio S1981 on Atm sekä Chk2 fosforylaation Thr68 in HCT116-soluissa (kuvio. 4A). Itu hoito johti myös Ser15 fosforylaatio p53 (Fig. 4A), joka suoritetaan PIKKs samoin. Vastaavasti Itu voisi stimuloida p53 fosforylaatiota ja Chk2 fosforylaatiota MEF (Fig. 4B). Nämä tulokset edelleen tukevat päätelmää, että Itu aiheuttaa DNA-vaurioita ja aktivoi atm.

. HCT116-soluja käsiteltiin 1 uM Itu eri aikoja ja aktivointi Atm, Chk2, ja p53 arvioitiin kanssa Western blot käyttämällä spesifisiä fosfo-vasta-aineita. B. MEF-soluja käsiteltiin 1 uM Itu eri aikoja ja aktivointi Atm, Chk2, ja p53 arvioitiin kanssa Western blot käyttämällä spesifisiä fosfo-vasta-aineita.

Itu Led S Phase Extension ja G2 /M-pidätys on p53-riippuvaisen Manner

Monet nukleosidianalogit aiheuttaa solusyklin pysähtyminen S-vaiheeseen poikkeuksia, kuten 20-C-syaani-20-deoksi-1-β-D-arabino- pentofuranosylcytosine (CNDAC), joka aiheuttaa solusyklin pysähtyminen G2 vaiheessa [4], [35]. Sisällyttäminen nukleosidianalogeja lopettaa venymisen muodostuvien DNA-juosteen ja johtaa sammumisen lisääntymään haarukat. Testata, onko Itu aktivoi solusyklin tarkastuspisteiden, käsittelimme p53 + /+ ja p53 – /- HCT116-solujen kanssa eri pitoisuuksia Itu 24 tai 48 tuntia. Todettiin, että 24 tunnin hoidon suuremmilla pitoisuuksilla Itu johti vaatimaton korotus S vaiheessa olevien solujen, jotka oli mukana lasku prosenttiosuuden G1 vaiheessa olevien solujen, muuttamatta merkittävästi prosenttiosuus G2 /M vaiheessa solut (Fig. 5A ja 5B). Kun soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla Itu 48 tuntia, lisää solut olivat G2 vaiheessa mukana on lasku G1 vaiheessa, mutta ei muuta merkittävästi prosenttiosuutta S-vaiheessa olevien solujen (Kuva. 5C ja 5D). Yksi selitys on, että solut perin juuttunut S vaiheessa mutta onnistui läpi S-vaiheeseen ja lopulta juuttuneena G2 /M vaiheessa. Näin Itu lähinnä aktivoi G2 tarkastuspiste. Tämä on toisin kuin useimmat nukleosidianalogeja, jotka johtavat S-vaiheeseen solusyklin pysähtymisen [4], ja ionisoivaa säteilyä (IR), joka indusoi solusyklin pysähtymisen G1 ja G2 faasi ja siihen liittyy väheneminen S-vaihe HCT116-solut [21]. Koska p53: n, 24-h-hoito johti aluksi kasvua S-faasissa suuremmilla annoksilla Itu (Fig. 5A ja 5B), mutta 48 tuntia käsittelyn jälkeen, ero kontrollin ja käsiteltyjen välillä solujen tuli vähän (kuvio . 5C ja 5D), mikä osoittaa, että p53 – /- HCT116-soluissa, mutta ei p53 + /+ HCT116-solut, tehdään S-vaiheessa pidätyksen ja että p53 – /- solut onnistui pakenemaan tämän tarkistuspisteen. Lisäksi p53 – /- solut eivät osoittaneet G2 vaiheen pysähtymisen (Fig. 5A ja 5B). Nämä tulokset osoittavat, että Itu aiheuttama G2 vaiheen pysähtymisen edellyttää läsnäoloa p53.

. HCT116 (p53 + /+ ja p53 – /-) käsiteltiin eri pitoisuuksilla Itu 24 tuntia. Solut fiksoitiin, värjättiin PI, ja analysoitiin FACS: llä. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa näytettiin. B. Edustavia solusyklin profiilit p53 + /+ ja p53 – /- HCT116: n läsnä ollessa 2,5 uM Itu 24 tuntia. C. HCT116 (p53 + /+ ja p53 – /-) käsiteltiin eri pitoisuuksilla Itu 48 tuntia. Solut fiksoitiin, värjättiin PI, ja analysoitiin FACS: llä. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa näytettiin. D. Edustavia solusyklin profiilit p53 + /+ ja p53 – /- HCT116 läsnä on 1,0 uM Itu 48 tuntia.

Itu indusoi p53-riippuvainen ja riippumattaman Cell Death

p53 on vahva proapoptoottiset rooli ja se on vakiintunut, että DNA-vaurioita indusoi solukuolemaa lähinnä ATM-p53-reitin. Sitten testattiin sytotoksisuus Itu vuonna HCT116 ja osallistumista Itu aiheuttaman p53 säätelyä ylöspäin. Itu hoito johti solukuolemaa p53 + /+ HCT116-soluja (EC50 = 1,88 uM), mutta p53 – /- HCT116-solut osoittivat resistenssiä ITU-indusoitua solukuolemaa (EC50 = 7,8 uM) (Fig. 6A), mikä viittaa siihen, on tärkeä rooli p53 välittämisessä Itu-solukuolema. Lisäksi Atm puute, jonka tiedetään vähentää p53 induktion, esti myös Itu-indusoituvaa solukuolemaa MEF (Fig. 6B) [36], sopusoinnussa hyvin hyväksytty rooli Atm edistämisessä solukuolemaan alle genotoksinen stressi. Vähemmän kuin täydellinen pelastaminen solukuoleman p53 puute osoittavat, että Itu voisi omistaa sytotoksisuus, joka on riippumaton p53, esimerkiksi estämällä pro-eloonjäämisen signalointi kuten Erk2.

. HCT116-solut (p53 + /+ ja p53 – /-) käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla Itu 48 tuntia, ja solujen lukumäärä mitattiin WST-1-määritystä. * P 0,05, kun p53 – /- soluja verrattiin p53 + /+ -solut. B. Atm + /+ ja Atm – /- MEF-soluihin käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla Itu 48 tuntia, ja solujen lukumäärä mitattiin WST-1-määritystä. * P 0,05, kun Atm – /- solut verrattiin Atm + /+ soluja. C. Villityypin ja p53 – /- HCT116-soluja käsiteltiin Itu 24 tuntia, ja solujen lukumäärä mitattiin WST-1-määritystä. Itu ei aiheuttanut solukuolemaa, kun soluja viljeltiin 0,1% seerumia tai konfluentteja villityypin HCT116-soluissa. * P 0,05 verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Monet nukleosidianalogien vaativat DNA sisällyttäminen toteuttamaan sen sytotoksista vaikutusta. Edelleen testata sytotoksista vaikutusta Itu ei-jakautuvia soluja, me viljeltiin HCT116 joko stationaarifaasin tai, kun läsnä on 0,1% seerumia 24 tunnin ajan, ja suurin osa soluista on G1-vaiheessa. Näissä olosuhteissa Itu ei tappaa solut (Fig. 6C), mikä viittaa siihen, että Itu on otettu DNA: han, jotta voitaisiin suorittaa sen sytotoksista aktiivisuutta. Tämä on johdonmukainen havainto, että Itu metaboliitti on läsnä genomisen DNA: jäljittelemään solujen (Fig. 2B).

Kuitenkin, virtaussytometrialla määrityksissä ei havaittu merkittävää kasvua sub-G1-vaiheessa olevien solujen, joka on osoitus apoptoottisten solujen, 24 tai 48 tuntia Itu-hoidon eri annoksilla (Fig. 5B ja 5D). Tämä on päinvastoin kuin IR tai HADC (histonideasetylaaseja) estäjä MGCD0103, mikä johti huomattavaan kasvuun sub-G1 vaiheeseen HCT116-soluissa [21], [37]. Lisäksi, ei DNA: ta tikkaat havaittu sen jälkeen, kun Itu hoidon (tuloksia ei ole esitetty).