Krooninen sairaus

tiivistelmä

dendritic cell (DC) rokotteet kohdistaminen vain syöpäsolut ovat rajatun antituumorivaikutus in useimmissa kliinisissä tutkimuksissa. Targeting syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin) lisäksi syöpäsoluja saattaa voimistaa antituumorivaikutukset, koska valuuttalisiin, keskeinen osatekijä kasvain strooman, tukevat suoraan kasvaimen kasvua ja edistää immunosuppressiivisen kasvain microenvironment. Yhteistyöhön tavoite valuuttalisiin ja kasvainsolujen kehitimme uuden yhdisteen DC rokote, joka koodaa A20-erityisiä shRNA parantaa DC-toiminto, ja tavoitteet fibroblastien aktivoitumisen proteiini (FAP) ilmaistuna valuuttalisiin ja kasvaimen antigeeni tyrosiini liittyvä proteiini (TRP) 2 (DC-shA20-FAP-TRP2). DC-shA20-FAP-TRP2 rokotuksen indusoiman vankka FAP- ja TRP2-spesifisten T-soluvasteiden, mikä lisää kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta, että B16-mallia verrattuna yksiarvoisiin rokotteita tai rokote, joka koodaa antigeenejä ja ohjaus- shRNA. DC-shA20-FAP-TRP2 rokotuksen tehostettu kasvain soluttautumista CD8-positiivisten T-solujen, ja indusoi antigeenin leviäminen johtaa voimakas antituumorivaikutus. Siten co-tuumorisolujen ja valuuttalisiin tuloksia induktion laajapohjaisen kasvain-spesifisten T-soluvasteiden ja on mahdollisuus parantaa nykyistä rokote lähestymistapoja syövän.

Citation: Gottschalk S, Yu F Ji M, Kakarla S, Song XT (2013) rokote Co-tavoitteet tuumorisoluissa ja Cancer Associated Sidekudosmuodostussolujen tulokset Parannettu antituumorivaikutus aiheuttamalla antigeeni levittäminen. PLoS ONE 8 (12): e82658. doi: 10,1371 /journal.pone.0082658

Toimittaja: Nikolas K. Haass, University of Queensland Diamantina Institute, Australia

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 25 lokakuu 2013; Julkaistu: 12 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Gottschalk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana DAMD W81XWH-10-1-0281, NIH myöntää P50 CA126752 ja 1R01CA148748-01A1. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

dendritic cell (DC) rokotteet ovat osoittaneet rajoitettu antituumorivaikutus useimmissa kliinisissä tutkimuksissa [1]. Tämä tehon puutteen on todennäköisesti johtuu läsnäolo immunosuppressiivisten solujen kasvain sekä kasvaimen tukeva strooman rajoittavat rajat esillepanossa ja induktio laajapohjaisen kasvain antigeenispesifisten T-soluvasteiden [2], [3].

Cancer liittyy fibroblastien (valuuttalisiin) ovat keskeisiä solujen osa kasvaimen strooman ja ovat läsnä useimmissa yhteisen epiteelisyöpien, kuten keuhko-, rinta-, ja eturauhasen syöpä, sekä sarkooma ja melanooma [4] – [7]. CAF välittävät resistenssiä kemo-, radio- ja immunoterapia, ja CAF kasvaimen sisältöä tai geenit ilmaistaan ​​valuuttalisiin korreloi tulos [5], [8] – [10]. Valuuttalisiin ilmaista fibroblastit aktivoiva proteiini (FAP) [11] ja kohdennettua poistamista FAP-positiivisia valuuttalisiin siirtogeenisissä hiirimalleihin on voimakas antituumorivaikutukset korostamalla niiden keskeinen rooli kasvainten synnyssä [12]. Lisäksi FAP kohdistettujen rokotteiden vähensi kasvainten kollageenin sisällön ja moduloidaan kasvain immuuni microenvironment kokeellisissa malleissa [13], [14].

Olemme aiemmin on osoitettu, että hiljentäminen A20, negatiivinen säätelijä NF κb- välittämää DC aktivointi, parantaa DC toiminto [15]. Tarkoitus Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli nyt arvioida rokote, joka hiljentää A20, ja yhteistyö tavoitteita FAP-positiivisia valuuttalisiin sekä syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että sellainen yhdiste, rokote on voimakas antituumorivaikutus ja joka co-kohdentaminen valuuttalisiin ja kasvainsolujen on kriittinen sytotoksisten T-solujen, jotka ovat spesifisiä kasvainantigeenejä ei rokotteen koodaama.

Materiaalit ja menetelmät

DC immunisaatiota ja kasvainmuodoista

tutkimus hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö valiokuntien Baylor College of Medicine (BCM). C57BL /6J hankittiin Jackson Laboratories ja ylläpidetään patogeenittomassa hiiri laitokseen BCM hoitokäytännön mukaisesti. DC-soluja pestiin PBS: ssä ja injektoitiin takana polkuanturaan naiivien C57BL /6 1 x 10

6 solua /hiiri. Hiiret uhrattiin merkitty päivinä; nivusten imusolmukkeet ja perna poistettiin solunsisäiseen värjäystä ja Elispotissa, vastaavasti. Kasvaimeen malli, C57BL /6-hiiriin injektoitiin 5 x 10

5 B16, B16-OVA tai esimerkiksi7-OVA-kasvainsoluja ihon alle. Viisi päivää myöhemmin hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin (n = 5 per ryhmät) ja injektoitiin 1 x 10

6 lentivirus-transdusoitujen LPS-erääntyi DC. Tuumoritilavuudet mitattiin kaksi tai kolme kertaa viikossa mikrometrillä.

Lentivirusvektori rakentaminen, tuotanto ja transduktio

HIV itsestään inaktivoiva (SIN) -vektori Tässä tutkimuksessa käytettiin oli pSIH1- H1-shRNA vektorin SBI. Hiiren A20 pieni hiusneula häiritseviä RNA-sekvenssi insertoitiin pSIH1-H1-shRNA tuottaa pSIH1-H1-A20-shRNA, joka sisältää A20 shRNA (5’CTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTT-3 ’). FAP tai TRP-2: n cDNA insertoitiin pSIH1-H1-shRNA valvonnassa CMV-promoottorin tuottaa pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-FAP, pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-TRP2 tai pSIH1-H1 -A20-shRNA-CMV-FAP-TRP2. Rekombinantti pseudotyypitettyä lentivirusvektoreita tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [15] ja konsentroidaan PEG-it ™ virus saostusliuosta (System Biosciences, Mountain View, CA).

Dendriittinen kulttuuri

Luuytimen dendriittisolut (DC) saatiin, kuten on kuvattu [16], seuraavin muutoksin. Punaiset verisolut lyysattiin inkuboimalla huoneenlämpötilassa punasolujen hajotuspuskuria (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja soluja pidettiin HyClone RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Summit, Fort Collins, CO) , ei-välttämättömiä aminohappoja, HEPES-puskuria, glutamax, β-merkaptoetanolia, IL-4 (20 ng /ml), ja GM-CSF (20 ng /ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) ja 5 päivää. DC: itä transdusoidaan sitten lentiviruksen 8 tunnin ajan, sitten viljeltiin vielä 12-16 tuntia LPS.

Virtaussytometria

virtaussytometrinen analyysi DC ja T-solujen ja suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15], [17]. Nivusimusolmukkeista hajotettiin ja maljattiin täydelliseen RPMI kanssa lentivirus-transdusoituja DC varten yön stimulaatio 37 ° C, minkä jälkeen solunsisäinen värjäys. Stained solut analysoitiin FACScalibur väline (Becton Dickinson (BD), Mountain View, CA) käyttäen CellQuest ohjelmistoa (BD) kaikille flow-rianalyysit.

Entsyymi-immunologiset spot (Elispotissa) määritys

Elispotissa määrityksissä eristetyt T-solut suoritettiin kuten on kuvattu aiemmin on kuvattu [15], [17]. Pernat hajotettiin ja pernasoluja puhdistettiin käyttämällä MACS CD4 (L3T4) tai CD8 (Ly-2) mikrohelmet (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Solut maljattiin kolmena rinnakkaisena OT-II tai OT-I-peptidiä (10 ug /ml) tai anti-CD3 /CD28 Positiivisena kontrollina. Levyjä inkuboitiin yön yli, sitten IFN-γ eritys arvioitiin (vasta-aineet: Mabtech). Tuloksia arvioitiin sokkona jonka ZellNet Consulting, Inc. (New York, NY), jossa on automatisoitu Elispotissa lukija järjestelmä, käyttäen KS Elispotissa 4.3 ohjelmisto.

Sytotoksisuusmääritvs

sytolyyttinen aktiivisuus T-solut arvioitiin tavallisella krominvapautusmäärityksestä, joka mittaa kykyä in vitro-stimuloidaan uudelleen pernasolujen hajottamaan kohdesoluihin (20, 50). Splenosyyttejä yhdistettiin immunisoiduista hiiristä stimuloitiin uudelleen in vitro RPMI-1640, joka sisälsi B16-OVA kasvain lysaattia ja IL2 4-6 päivää. B16 ja B16-OVA-solut leimattiin natrium-

51Cr kromaatti liuosta 60 minuutin ajan 37 ° C: ssa ravistellen. Eri määrä efektorisolujen inkuboitiin vakio määrä kohdesoluja (5 x 10

4 /kuoppa) 96-kuoppaisille U-pohjaisille levyille (200 ul /kuoppa) 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Supernatantit kolmena kappaleena viljelmistä kerättiin. Prosentuaalinen hajoaminen laskettiin kuten (kokeellinen vapautuminen – spontaani vapautuminen) /(maksimi release – spontaani vapautuminen) x 100.

Tilastollinen

Tilastoanalyysiin käytimme Studentin t-testi 95 % luottamustasolla, määritellään p 0,05. Tulokset on tyypillisesti esitetty keskiarvoina ± SEM. Eläinkokeita, 5 hiiret suunnitellaan tunnistamaan suuren vaikutuksen koko 2, jossa edellyttäen, että ainakin 80% teholla 5% tyypin I virhe. Hiiren kokeita, selviytyminen, määritetään aika tuumorisoluinjektion analysoitiin log-rank-testi.

Tulokset

toiminnallinen luonnehdinta lentivirusvektorien koodaavat shA20, FAP ja TRP2

rakennettu 4 lentivirusvektoreilla, jotka koodaavat shA20 ja FAP (Lv-shA20-FAP), shA20 ja TRP2 (Lv-shA20-TRP2), shA20, FAP ja TRP2 (Lv-shA20-FAP-TRP2), tai kontrollina shRNA, FAP, TRP2 (Lv-shCo-FAP-TRP2) (Fig. 1A). Siirtogeenin ilmentymisen, ja vaimentaminen A20 varmistettiin RT-PCR: llä luuytimestä peräisin DC transdusoitu VSV-G-pseudo- lentivirusvektoreita (Fig. 1 B, C).

(A) kaaviossa lentiviruksesta konstrukteja. (B ja C) Hiiren BM-DC-solut transdusoitiin lentiviruksen ja FAP ja TRP2 lauseke (B) ja A20 lausekkeen (C) havaittiin RT-PCR: llä tai Q-PCR: llä erikseen. (D ja E) Hiiret immunisoitiin 1 x 10

6 lentivirusta Transdusoimattomia BM-DC 25: aan steriiliä PBS: ää tai PBS ohjaus footpad 14 päivää rokotuksesta pernasolut valmistettiin ja CD8 + (D) ja CD4 + (E) T soluista. Taajuus FAP- ja TRP2-spesifisten T-solujen määritettiin käyttäen IFN-γ-ELISPOT-määrityksissä (n = 2, määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena). AF, lentivirusvektoriannos ilmensi A20-erityinen lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) ja FAP; AT, lentivirusvektori ilmensi A20-shRNA ja TRP2; AFT, lentivirusvektori ilmensi A20-shRNA, FAP, ja TRP2; CFT, lentivirusvektori ilmensi GFP-shRNA, FAP, ja TRP2; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi; PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos.

Sen osoittamiseksi, että Lv transdusoitujen DC indusoivat FAP- ja TRP2-spesifisten T-soluvasteiden, hiiret rokotettiin 1 x 10

6 DC-shA20- FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2, tai DC-shCo-FAP-TRP2. Neljätoista päivää rokotuksesta CD4- ja CD8-positiivisten pernasoluja eristettiin ja läsnäolo FAP- ja TRP2-spesifisten T-solujen määritettiin IFN-y Elispotissa määrityksissä. Hiiret rokotettiin A20-vaiennetaan DC rokotteiden indusoi huomattavasti korkeampi FAP- ja TRP2-spesifisten CD4- ja CD8-positiivisten T-soluvasteita (p 0,05) kuin hiiret rokotettiin DC-shCo-FAP-TRP2, vahvistaa meidän aiempaan toteamukseen hiljentäminen ja A20 on DC edistää induktio vankka CD4- ja CD8-positiivisten antigeenispesifisten T-soluvasteiden

in vivo

(Fig. 1 D, E) [15]. Ei ollut merkittävää eroa (p 0,05) induktio FAP- tai TRP2-spesifisten T-solujen vasteet jälkeen rokottamalla hiiriä DC ilmentävien yksittäisten (DC-shA20-FAP tai DC-shA20-TRP2) tai molemmille antigeeneille (DC-shA20 -FAP-TRP2), mikä osoittaa, ettei antigeenisten kilpailua, kun molemmat antigeenejä koekspressoi.

DC-shA20-FAP-TRP2 rokote on voimakas antituumorivaikutus

B16 malli sopii arvioida, kohdistaminen FAP-positiivisia kasvain strooman parantaa antituumorivaikutukset koska B16-solut eivät ilmennä FAP [18]. Varmistimme induktion FAP ekspression 5 päivää lähettää B16 kasvaimen istutuksen RT-PCR: llä (Fig. 2A). Hiirillä, joilla on 5 päivää vanha B16 kasvaimia rokotettiin yhdellä annoksella 1 x 10

6 DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2, tai DC-shCo-FAP- TRP2 rokote. Kaikki A20-vaiennetaan rokotteita oli antituumorivaikutus, kun taas ei-A20 vaiennetaan DC rokote ei ollut yhtään (Fig. 2B). Ei ollut eroa antituumorivaikutuksen DC-shA20-FAP ja DC-shA20-TRP2 rokotteiden, mikä osoittaa, että T-soluvasteita vastaan ​​strooman antigeeniä yksinään voi olla merkittäviä antituumorivaikutuksia (Fig. 2B). Kohdistaminen FAP ja TRP2 samanaikaisesti DC-shA20-FAP-TRP2 rokote aiheutti suurimmat antituumorivaikutus (DC-shA20-TRP2 vs DC-shA20-FAP-TRP2, p 0,05; DC-shA20-FAP vs DC-shA20- FAP-TRP2, p 0,05). Tämä johti merkittävään kasvuun selviytymisen hiirillä, jotka saivat DC-shA20-FAP-TRP2 rokote verrattuna muihin rokote ryhmät (kuvio 2C). Superior antituumorivaikutus on kasvain- ja strooman kohdistetut rokote varmistettiin käyttäen DC-shA20-FAP-OVA rokotteen B16-OVA ja esimerkiksi7-OVA mallit (Fig. S1A, B).

(A) RT-PCR FAP ja GAPDH B16 solulinjan, ja päivä 5 B16 kasvaimia. (B, C) Hiiret inokuloitiin B16 seuraa immunisaatio 1 x 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT), DC-shCo-FAP-TRP2 (ACT) tai PBS päivänä 5 (n = 5 ryhmää kohden). (B) Cotargeting FAP ja TRP2 kanssa AFT johti suurimman kasvaimenvastaista vaste (AF vs AFT, p 0,05; AT vs AFT, p 0,05). (C) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä (AF vs AFT, p 0,05; AT vs AFT, p 0,05).

DC-shA20-FAP-TRP2 rokote lisääntyy FAP- ja TRP2-spesifinen CD8-positiivisten T-solujen kasvaimia

tutkimiseksi mekanismeista parantaminen antituumorivaikutuksia, ensin määritetään taajuuden CD4- ja CD8-positiivisten T-solujen B16 kasvaimia 3 viikkoa rokotuksen jälkeen. Vaikka ei ollut merkittävää eroa prosentteina CD4-positiivisten T-solujen kasvaimia ryhmien välillä rokotetuista hiirissä (tuloksia ei esitetty), oli merkittävä (p 0,05) 4-kertainen nousu prosentteina CD8-positiivisten T-solujen sen jälkeen, kun DC-shA20-FAP-TRP2 rokotuksen verrattuna kontrollihiiriin (Fig. 3A, B). Sen sijaan monovalentin rokotuksen tai ei-vaiennettu FAP /TRP2 DC rokote ei tihentää kasvaimensisäisenä CD8-positiivisten T-solujen verrattuna kontrolleihin. Tutkia spesifisyyden soluttautua CD8-positiivisten T-solujen, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) eristettiin 3 viikkoa rokotuksen jälkeen. Solunsisäinen sytokiini värjäys IFN-γ suoritettiin postitse stimulaation FAP- tai TRP2-ilmentävät DC. DC-shA20-FAP-TRP2 rokotus indusoi korkein taajuus FAP- ja TRP2-spesifisten T-solujen verrattuna muiden rokotteiden (Fig. 3C), peilaus aiemmin havaittu yleinen kasvu määrä CD8-positiivisten T-solujen kasvaimia .

Hiiret inokuloitiin B16 kasvaimia seuraa immunisaatio 1 x 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 ( AFT) tai PBS: ää päivänä 5. Kasvaimen kudokset leikeltiin 3 viikkoa rokotuksen jälkeen (n = 5). (A) edustaja FACS-analyysi tunkeutumisatmosfäärin CD8 + T-soluja. (B) Yhteenveto tiedoista kaikki hiiret osoittavat merkittävää kasvua (p 0,05) ja CD8 + T-solujen rokotettujen hiirten AFT (n = 8 ryhmää kohti). (C) TIL uudelleenstimuloitiin DC transdusoitu FAP (DC-Lv-FAP) tai TRP2 (DC-LV-TRP2), minkä jälkeen solunsisäinen värjäys IFN-γ. Yksi 2 edustavien kokeiden esitetty.

DC-shA20-FAP-TRP2 Rokote aiheuttaa antigeenin leviämisen

Edellisessä kokeessa huomasimme, että DC-shA20-FAP Rokote indusoi TRP2 erityisiä T-soluvasteita (Fig. 3C), mikä viittaa epitoopin leviämisen ja induktio-antigeenin leviämisen. Tutkia tätä päätelmää, B16 tuumoreita kantavaa hiirtä rokotettiin päivänä 5 DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2 tai PBS. 3 viikon kuluttua taajuus spesifisten T-solujen B16 liittyvän kasvaimen antigeenejä tyrosinaasi-liittyvä proteiini 1 (TRP1), tyrosinaasi (Tyr), gp100, ja melanooma-antigeeniin T-solut tunnistavat (MART1) kesken pernasoluja ja kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä määritettiin. Vaikka kaikki rokotteet indusoivat merkittävää lisäystä TRP1-, Tyr, gp100- ja MART1-spesifisten T-solujen in TIL verrattuna PBS-hiiriin on injektoitu (Fig. 4A), taajuus melanooma-spesifisten T-solujen oli korkein DC -shA20-FAP-TRP2-rokotetuista hiiristä (p 0,05). Ainoastaan ​​DC-shA20-FAP-TRP2 Rokote indusoi systeemistä T-soluvasteita TRP1, Tyr, gp100, ja MART1 (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että kohdistaminen kasvaimen strooman sekä kasvaimen mahdollistaa induktio antigeenin leviäminen.

Hiiret inokuloitiin B16 kasvaimia seuraa immunisaatio 1 x 10

6 DC-shA20-FAP ( AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT) tai PBS päivänä 5. TIL ja Splenosyyttejä valmistettiin 3 viikkoa rokotuksesta (n = 5). (A) TIL stimuloitiin uudelleen DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 tai mock transdusoituja DC (PBS) ja sen jälkeen solunsisäinen värjäys IFN- γ. FACS-analyysi ja kumulatiivinen pylväsnäyttönä. TIL eristetty AFT-rokotetuista hiiristä oli korkein taajuus B16-speciifc T-solujen (p 0,05). (B) Pernasoluja suoritettiin IFN-y-Elispotissa määrityksissä. DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 tai mock transdusoida DC: iden (PBS) käytettiin APC: itä. Siellä kasvoi merkittävästi (p 0,05) T-solujen spesifinen TRP1, TYR, gp100, ja MART1 vain AFT-rokotetuista hiiristä.

antigeenin leviäminen johtaa parannettu antituumorivaikutus

kun osoittaneet, että kehitetty yhdiste rokotteiden indusoiman B16-antigeenin leviäminen halusimme määrittää, jos nämä antigeenispesifisten T-soluilla on kasvaimen vastainen vaikutus. Hiiriin istutettiin B16-OVA ja B16 niiden oikealle tai vasemmalle kyljet, ja 5 päivän kuluttua rokotettu DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA tai PBS. DC-shA20-OVA rokotuksen ainoastaan ​​inhiboi kasvua B16-OVA, kun taas DC-shA20-FAP rokote esti B16 sekä B16-OVA kasvaimen kasvua (Fig. 5A, B). DC-shA20-FAP-OVA-rokote oli suurin tuumorin vastaista aktiivisuutta sekä kasvainsolulinjoissa (p 0,05; Fig. 5A, B). Tämä on johdonmukainen havainto, että co-kohdistaminen kasvain antigeenin ja FAP indusoi systeemistä T-solujen vasteita kasvainantigeenin ole läsnä rokotteessa (4B). Vaikka DC-shA20-OVA rokotus ei johtanut kasvuun kokonaiselinaika johtuen antigeeninegatiivisille B16 kasvaimia, DC-shA20-FAP tai DC-shA20-FAP-OVA rokotus johti merkittävään kasvuun eloonjäämiseen verrattuna DC-shA20-OVA (p 0,05; Kuva 5.C).

(AC) Hiirille istutettiin B16-OVA tai B16 kasvain oikealle tai vasemmalle kylki erikseen seurasi immunisoimalla 1 x 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-OVA (AO), DC-shA20-FAP-OVA (AFO) tai PBS: ää 5 päivää myöhemmin (n = 5 ryhmää kohden). B16-OVA (A) ja B16 (B) kasvaimen kasvua mitattiin. AFO ja AF rokote oli anti-B16 toimintaa AFO ollessa ylivoimainen (p 0,05). (C) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä (AO vs AF, p 0,05; AO vs AFO, p 0,05). (D, E) Hiiret rokotettiin B16-OVA seurasi immunisaatio 1 x 10

6 AF, AO, AFO, ja PBS 5 päivää myöhemmin. 3 viikkoa myöhemmin pernasoluja valmistettiin ja niitä viljeltiin in vitro, kun läsnä on B16-OVA kasvaimen lysaattia ja IL2 ja 5 päivää ja niiden sytolyyttinen aktiivisuus arvioitiin standardin suoritettiin

51Cr release assay B16-OVA (D) tai B16 ( E). Splenosyyttejä eristettiin AF ja AFO-rokotetuista hiiristä oli merkittäviä sytolyyttinen aktiivisuus B16. * AFO vs AF ja AO, p 0,05; ** AF ja AO vs PBS, p 0,05, *** AFO ja AF vs AO, p 0,05).

edelleen varmistamiseksi systeeminen induktion spesifisten T-solujen antigeeneille ole läsnä rokote, hiiriin injektoitiin B16-OVA ja rokotettujen jälkeen 5 päivää DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA, tai PBS: ää. 3 viikon kuluttua pernasolua rokotettujen hiirten eristettiin ja stimuloitiin uudelleen 5 päivän

ex vivo

ennen järjestelmän sytotoksisuuskoetta B16-OVA ja B16 soluja kohteina. Pernasoluja korjattu DC-shA20-FAP tai DC-shA20-FAP-OVA-rokotetuista hiiristä osoitti merkittäviä tappamista B16-OVA ja B16-solut (Fig. 5D, E), jos sillä DC-shA20-OVA rokote pääasiassa indusoi OVA-spesifisten T-soluvasteita.

keskustelu

tulokset osoittavat, että DC-rokote, jossa antigeeniä esittelevä vaimennin A20 on estetty, ja joka on kohdistettu FAP-positiivisia valuuttalisiin ja kasvaimen antigeeni TRP2 on voimakas kasvaimenvastainen vaikutukset, mahdollistaa rajat esittely tuumoriantigeenien kasvaimensisäisiä APC: iden jolloin laajapohjaisen induktio T-solujen spesifinen kasvaimen antigeenejä eivät sisälly rokotteeseen.

kasvain mikroympäristölle on monimutkainen miljöö ja sillä on keskeinen rooli kasvaimen aloittamista, etenemistä ja välittävät terapeuttisia vastus [9], [10]. Targeting ei-pahanlaatuisia soluja läsnä kasvaimet lisäksi syöpäsoluja voi siten tehostaa syövän hoitomuotoja kehitettäessä [7], [19], [20]. FAP-positiivisia valuuttalisiin, Keski solukomponenttiin kasvaimen strooman, ovat nousseet avaintoimijoita edistämisessä soluväliaineen (ECM) remodeling, verisuonten muodostumista ja immuunitukahdutus [21]. Esimerkiksi siirtogeenisiä hiiriä, joissa difteriatoksiinin reseptori ilmentyy kontrollin alaisena FAP-promoottorin, difteria-toksiinin, joka tappaa vain kasvaimeen liittyvien FAP-positiivisia stroomasolujen, johti täydelliseen ablaation kiinteiden kasvainten [12] .

FAP on kalvoon sitoutunut aminopeptidaasi, joka on mukana ECM remodeling [22]. Esto aminopeptidaasiaktiivisuus FAP alensivat kasvaimen kasvua ja liittyi kertyminen kollageenin, vähentynyt määrä myofibroblasteja, ja laski kasvaimen verisuonten muodostumista kokeellisissa malleissa [21], mutta ei objektiivista kliiniset vasteet kliinisissä tutkimuksissa [23] . Kohdistaminen FAP kanssa humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine, sibrotuzumab, ei myöskään todettu objektiivisia kliinisiä vasteita; kuitenkin, kuvantamisen tutkimukset paljastivat, että vasta-aine edullisesti lokalisoitu etäpesäkekasvainten sivustoja annon jälkeen [24].

Useat ryhmät ovat tehneet rokote tutkimuksia pelkästään kohdistamista FAP, jotka osoittavat, että S. typhimuirum-, plasmidi- tai DC-pohjainen FAP rokotteilla on antituumorivaikutus ennaltaehkäisevässä tai varhaisessa terapiapuitteissa, moduloivat kasvain microenvironment edistämällä Th1 polarisaation ja parantaa soluttautumista CD8-positiivisten T-solujen [13], [14], [18], [25]. Vaikka cotargeting FAP-positiivisia valuuttalisiin ja kasvaimen solut DC rokotteen osoitti merkittävää viivettä kasvaimen kasvua yhdessä prekliiniset tutkimukset, ei mekaaniset tutkimukset suoritettiin [18].

tutkimukset ulottuvat nyt nämä havainnot ja osoittavat, että hiljentäminen ubikitiinipromoottori ligaasilla A20, antigeeniä esittelevään vaimennin DC, johtaa merkittävään kasvuun taajuus FAP-spesifisten T-solujen verrattuna DC-rokote, jossa on ohjaus shRNA. Tämä korostaa tärkeää roolia hiljentäminen alipaineensäätöventtiileillä kuten A20 miehistönkuljetusvaunuissa aiheuttamaan T-soluvasteita omia antigeenejä, kuten FAP [15]. Havaitsimme eroa antituumorivaikutuksen DC-shA20-FAP ja DC-shA20-TRP2, mikä osoittaa, että kohdistaminen valuuttalisiin by FAP rokottaminen voi aiheuttaa antituumorivaikutukset samanlainen rokotteita, jotka kohdistuvat pahanlaatuisia soluja. Kuitenkin rokotus DC-shA20-FAP-TRP2 johti suurimman antituumorivaikutus. Mekanistinen tutkitut paljasti, että cotargeting on valuuttalisiin ja kasvainsolujen johti lisääntyneeseen CD8-positiivisten T-solujen kasvaimia ja induktio T-solujen, jotka ovat spesifisiä antigeenejä ei ole läsnä rokotteessa, jolla on voimakas antituumorivaikutus. DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, ja DC-shCo-FAP-TRP2 Rokote indusoi vertailukelpoisia CD8-positice TIL (Fig. 3B), mutta vain DC-shA20-FAP ja DC-shA20-TRP2 rokotteita oli antituumorivaikutus (Fig. 2B). Olemme aiemmin osoittaneet, että A20-siRNA-adjuvanttia DC rokotteiden indusoida voimakas kasvaimen antigeeni-spesifisten sytotoksisten T-solujen ja auttaja-T-solut, jotka ovat refraktorisia Treg inhibition [15]. Näin ollen, vaikka kaikki kolme rokotteiden indusoiman verrattavissa TIL vasteita, DC-shA20-FAP ja DC-shA20-TRP2-indusoidun TIL ovat todennäköisesti tehokkaampia tuumorin kasvun estämisessä.

Vaccine tutkimukset rintasyöpä, munuaissyöpä, ja melanooma potilaiden viittaavat siihen, että rajat esitys ja epitoopin leviämisen korreloi parannetun eloonjäämiseen [26] – [28]. Lisäksi, induktio laaja-alaista kasvaimen spesifisten T-soluvasteiden jälkeen otto- T-solujen siirto yhdellä melanoomapotilaalla johti täydellinen vaste [29]. Vaikka nämä tutkimukset korostavat epitoopin leviämisen vaikuttavista tekijöistä tehokkaasti indusoimaan rajat esitys ja epitoopin leviämisen ovat nykyään ole määritelty. Vaikka kaikki rokotteet indusoi alhainen TIL jotka olivat spesifisiä antigeenejä ole läsnä rokote, vain kasvain- ja strooman kohdistetut Rokote indusoi systeemistä T-soluvasteita kaikilla testatuilla kuin rokotteessa antigeenejä. Kohdistaminen vain kasvain strooman DC-shA20-FAP johti induktioon TRP2-spesifisten TIL ja systeemisen TRP2-spesifisten T-soluvasteiden, jotka olivat korkeammat (vaikkakaan ei merkitsevä) verrattuna DC-sh-TRP2 rokotetta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kohdistettu FAP-positiivisia strooman tuloksia tuhoaminen B16-solujen ja käänteinen immunosuppressiivisen kasvaimen mikroympäristössä.

Tärkeää on, että indusoi kasvaimen spesifisten T-solujen oli sytotoksinen ja oli antituumoriaktiivisuus antigeenin menetystä variantteja (ALVS), joka jo on havaittu potilailla ilmoittautunut rokotteen tai T-solujen immunoterapia tutkimukset että vain kohdistaa kasvain antigeenejä [30], [31]. Vaikka muut ryhmät ovat osoittaneet kokeellisissa malleissa että rajat esittely antigeenien stroomasolujen on kriittinen poistamiseksi ALVS käyttäen erittäin ilmaistaan ​​malli-antigeeni [32], tuloksemme osoittavat, että kohdistaminen stromasoluja on ollut tunnusomaista hidas laajapohjainen anti-kasvain vasteita, jotka olisi minimoimiseksi ALVS.

Yhteenvetona, yhdiste rokote olemme kehittäneet indusoi CAF- ja kasvaimen immuunivasteita ja saa aikaan laaja-alainen T-soluvasteita tuumoriantigeenejä vastaan. Näin ollen, valuuttalisiin lisäksi pahanlaatuisia syöpäsoluja on mahdollista parantaa nykyistä rokote lähestymistapoja syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

DC-shA20-FAP-OVA rokote on voimakas antituumorivaikutus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082658.s001

(PDF) B

Kiitokset

kiitos Cliona M Rooney ja Malcolm K Brenner varten hyödyllisiä keskusteluja ja neuvoja.