Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human Mäyräkoira homologi 1 (

DACH1

) on merkittävä osa verkkokalvon määritys Gene Network. Menetys DACH1 ekspressio havaittiin rinta-, eturauhas-, keuhko-, kohdun limakalvon, peräsuolen ja hepatosellulaarista karsinoomaa. Tutkia ilmaisu, sääntely ja toiminta

DACH1

ihmisen ruokatorven syöpä, 11 ruokatorven syöpä solulinjoja, 10 tapausta normaali ruokatorven limakalvo, 51 tapauksessa eri laatuja dysplasia ja 104 tapausta ensisijaisen ruokatorven squamous syöpä oli palveluksessa. Metylaatiospesifisen PCR, immunohistokemia, Western blot, virtaussytometria, pienet häiritsevät RNA: t, pesäkkeiden muodostumisen tekniikoita ja ksenografti hiirimallissa käytettiin. Huomasimme, että

DACH1

ilmentyminen säädeltiin promoottorialue hypermetylaation ruokatorven syöpään solulinjoissa. 18,8% (6 32) luokan 1, 42,1% (8 19) luokan 2 ja 3. asteen dysplasia (ED2,3), ja 61,5% (64 104) ruokatorven syöpään metyloitiin, mutta ei metylaatio löytynyt 10 tapauksessa normaalin ruokatorven limakalvon. Metylointi nostettiin etenemistä taipumus aikana ruokatorven syövän synnyn (

P

0,01).

DACH1

metylaatio liittyy huono erilaistumiseen (

P

0,05) ja myöhäinen kasvain vaiheessa (

P

0,05). Palauttaminen

DACH1

ilmaus estivät solujen kasvua ja aktivoida TGF-β signalointi KYSE150 ja KYSE510 soluja.

DACH1

tukahdutetaan ihmisen ruokatorven syöpä solujen kasvaimen kasvua vierassiirrekokeissa hiirillä. Lopuksi

DACH1

usein metyloitu ihmisen ruokatorven syöpä ja metylaation

DACH1

osallistuu alkuvaiheessa ruokatorven syövän synnyn. DACH1 ilmentymistä säätelee promoottorialue hypermetylaation.

DACH1

tukahduttaa ruokatorven syövän kasvua aktivoimalla TGF-β signalointi.

Citation: Wu L, Herman JG, Brock MV, Wu K, Mao G, Yan W, et al. (2014) hiljentäminen

DACH1

Edistää ruokatorven syövän kasvua estämällä TGF-β Signaling. PLoS ONE 9 (4): e95509. doi: 10,1371 /journal.pone.0095509

Editor: Dajun Deng, Pekingin yliopiston Cancer sairaalan ja Institute, Kiina

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2014; Julkaistu: 17 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia: National Basic Research Program (973 Ohjelmanro 2012CB934002, 2010CB912802), National High-tech-T National High-tech-T National Key tieteellinen väline Oheisohjelmisto Kiinan: https://www.most.gov.cn/index.htm; National Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: JGH on konsulttina MDxHealth, mutta tämä ei muuta kirjoittajien sitoutumista että PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on viidenneksi pahanlaatuinen sairaus ja on rankattu neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Kiinassa. [1] Ruokatorven levyepiteelisyöpä (ESCC) on vallitseva histologinen tyyppi ruokatorven syöpään, ja osuus on noin 90% ruokatorven syöpä tapaukset Pohjois- ja Keski-Kiinassa. [2] kehittymisestä huolimatta multimodaalisen hoitojen, The 5 vuotta eloonjäämisaste on alle 20%. [3] mekanismit ruokatorven syövän synnyn jäävät epäselviksi. Useita geneettiset ja epigeneettiset muutokset koettiin tärkeitä tekijöitä kehittämisen ruokatorven syöpään [4] – [6].

Mäyräkoira homologin 1 (

DACH1

), merkittävä osa verkkokalvon määritys Gene Network , ilmentyy laajalti epiteelisoluissa. Vähentäminen DACH1 ilmentyminen oli yhteydessä huonoon ennusteeseen rinta-, eturauhas-, keuhko-, kohdun limakalvon, peräsuolen ja maksan syöpä. [7] – [13] ilmentymistä DACH1 säädeltiin promoottorialue hypermetylaation endometriumin, peräsuolen ja maksan syöpä. [11] – [13]

DACH1

tukahdutetaan ihmisen maksasyövän aktivoimalla TGF-β signalointi. [13] Vaikka epigeneettiset muutokset ja toiminta

DACH1

ihmisen ESCC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa olemme lähinnä analysoineet epigeneettiset muutokset ja mekanismi DACH1 on ruokatorven syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus pöytäkirjat hyväksyttiin eettisen komitea Kiinan PLA General Hospital (Luvan numero: +20.090.701-015), ja kirjallinen suostumus saatiin osallistujille. Kaikki menettelyt eläinten tutkimuksen hyväksyi eläinten eettisen komitean Kiinan PLA General Hospital (Luvan numero: 2013-X8-40) ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Tutkimus toteutettiin suuntaviivojen mukaisesti vuoden 1975 Helsingin julistuksen ja oli yhdenmukainen hyvän kliinisen ohjeita ja paikallisia viranomaismääräyksiä.

Ensisijainen ihmisestä otettujen kudosnäytteiden ja Solulinjat

Yhteensä 104 tapausta ensisijaisen ruokatorven okasolusyöpä kerättiin tuore kudoksen kiinalainen PLA General Hospital. Kaikki näytteet luokiteltiin TNM, mukaan lukien vaihe I (N = 5), vaihe II (N = 66), vaiheen III (N = 32), ja vaihe IV (N = 1). Viisikymmentä yksi tapauksia ruokatorven dysplasia kerättiin parafinoidut näytettä, joista 32 tapausta grade 1 dysplasia (ED1), 11 tapausta luokka 2 dysplasia (ED2) ja 8 tapausta Asteen 3 dysplasia (ED3). Kymmenen tapausta normaali ruokatorven limakalvo (NE) kerättiin koepala alle tähystys kiinalaisesta PLA General Hospital. Niistä 104 syöpänäytteissä, 30 tapausta parafiiniblokit oli saatavilla Hyväksytty viereiseen kudokseen. Yksitoista ihmisen ESCC solulinjoissa (KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510, TE1, TE3 ja TE8) on mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki ESCC solulinjoja on kuvattu aikaisemmin [14] – [17], ja pidettiin RPMI-1640 (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja. Eettinen komitea Kiinan PLA General Hospital hyväksyi tämän tutkimuksen (Luvan numero: +20.090.701-015), ja kirjallinen lupa on saatu ennen keräämistä kudosnäytteen ja solulinjoissa.

5-atsa-2′ deoksisytidiinin hoito, RNA: n eristäminen ja Semi-käänteistranskriptio-PCR

ESCC solulinjat jaettiin ja alhainen tiheys (30% yhtymäkohta) 12 tuntia ennen käsittelyä. Soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-AZA) (Sigma-Aldrich), jonka pitoisuus on 2 uM kasvualustassa, joka vaihdettiin joka 24. tunti yhteensä 96 h hoito. Lopussa hoitojakson, solut kerättiin ja totaali-RNA eristettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen). Semikvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12].

bisulfiittimodifikaatio, metylaatiospesifinen PCR ja bisulfiittimodifiointi Sequencing

Genominen DNA ESCC solulinjoja ja primaarisia ESCC kudokset valmistettiin proteinaasi-K-menetelmällä. Metylaatiospesifisen PCR (MSP) ja bisulfiittimodifiointi Sequencing (BSSQ) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. [18], [19] MSP-alukkeita ja BSSQ alukkeita [12] suunniteltiin mukaan geenisekvenssejä noin transkription aloituskohdasta, että CpG saarella

DACH1

geeni (GenBank NM_080759.4) promoottorialue ja syntetisoitiin (BGI ) havaitsemiseksi metyloimatonta (U) ja metyloituja (M) alleeleja.

immunohistokemia (IHC) B

immunohistokemiallinen värjäys DACH1 suoritettiin 4 um paksu leikesarjojen johdettu muodollinen telmillä parafiiniin lausetta vasta-aine DACH1 (1:500 laimennus, Proteintech) kuten aiemmin on kuvattu. [12] värjäytymisen voimakkuus ja laajuus värjättyä alueen luokiteltiin mukaan Saksan puolikvantitatiivisen pisteytysjärjestelmää, joka oli myös kuvattu aiemmin [12].

plasmidin muodostaminen ja transfektio

DACH1

ekspressiovektori oli lahja Dr. Cvekl.

DACH1

ekspressiovektorin ja Smad sitovan elementit (SBE) -4 Luc reportteriplasmidilla kuvattiin aiemmin. [20]

DACH1

myös subkloonattiin plenti6-GFP-vektorilla. Shuttle-vektorikonstruktiot ja ViraPower Packaging Mix kotransfektoitiin 293FT solujen saamiseksi lentivirus mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). Lentivirus lisättiin sitten KYSE510 ja KYSE150 soluja, ja sceened jonka Blasticidin (5 ug /ml, Invitrogen) tuottaa

DACH1

ilmentyi stabiilisti soluissa. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) käytettiin plasmidin transfektion jälkeen. Kaikki konstruktit varmistettiin sekvensoimalla.

solunelinkykyisyysmääritys

DACH1

ilmentyi stabiilisti solujen ja uusia, ohjaus ympättiin 96-kuoppalevyille (3 x 10

3 solua /kuoppa), ja solujen elinkyky mitattiin päivittäin 96 tuntia käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo laboratorioill) mukaan valmistajan ohjeiden. Tulokset esitettiin graafisesti keskiarvoja ± SD. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

pesäkemuodostusta

DACH1

vakaasti ilmaisseet soluja ja uusia, ohjaus (5 x 10

2 solua /kuoppa) maljattiin 2 ml täydellistä kasvualustaa. Keskipitkällä ja reagenssit vaihdettiin kerran 72 tuntia. 2 viikon kuluttua inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 75% etanolissa 30 minuutin ajan ja värjättiin 0,2% kristallivioletilla (Beyotime) 20 minuuttia ja laskenta. Kutakin koetta varten, pesäkkeen muodostumisen määritys suoritettiin kolme kertaa.

virtaussytometria-analyysi

solusyklin analyysi, Cell Cycle Detection Kit (KeyGen Biotech) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin näyte analysoitiin virtaussytometrialla FACScan -virtaussytometrillä (Becton-Dickinson) käyttäen 488 nm: n laser. Histogrammit analysoitiin solusyklin osastoissa käyttäen ModFit versio 2.0 (Verity Software House). Apoptoosin analyysi, anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (KeyGen Biotech) suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

DACH1 Knock alas siRNA

neljä valitaan pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) kohdistaminen

DACH1

ja RNAi negatiivinen kontrolli Duplex käytettiin tässä tutkimuksessa, ja sekvenssit on kuvattu aikaisemmin. [12] RNAi-oligonukleotidin tai RNAi negatiivinen kontrolli Duplex (GenePharma) transfektoitiin KYSE140 soluihin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Dual-lusiferaasi Reporter Assay

KYSE510 ja KYSE150-soluja (3 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin 24 tunnin ajan ja transfektoitiin sopivaa yhdistelmää reportteri, ekspressioplasmidit ja ohjaus vektori, mukaan lukien SBE4-luc-reportterin plasmidin (20 ng /kuoppa ), PRL-TK kontrollivektorille (2 ng /kuoppa) sisäisenä kontrollina toimittaja, ja yhä suurempia määriä

DACH1

exprssion plasmidi. Soluja pidettiin seerumin puutteessa 36 tunnin ajan ja stimuloitiin sitten tai ilman TGF-β1 (Peprotech) 12 tuntia ennen lusiferaasi-määritystä. Suhteellinen Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kutakin koetta varten, lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin kolme kertaa.

Protein valmistus ja Western blot -analyysi

Protein eristäminen ja western blot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. [12] Ensisijainen vasta-aineet olivat seuraavat: DACH1 (Proteintech); c-Myc, p21, fosfo-Smad3, cyclinD1 (Cell signalointi Technology); CDK4 (Affinity); fosfo-Smad2 (Millipore); cyclinE1, CDK2, Smad2 ja Smad3 (Bioworld Technology); p-Actin (Beyotime). Täplät visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Pierce Bioscience).

In vivo

tuumorigeenisyystesti

DACH1

vakaasti ilmaisseet KYSE510 soluja ja uusia, ohjaus (4 × 10

6 solua 0,2 ml: ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta) ihon alle ruiskutettiin selän kylkeen 5-viikkoisen naaras-BABL /c-nude-hiirten; kunkin ryhmässä 5 hiirtä. Tuumorin koko mitattiin joka 5 päivä 4 viikon ajan alkaen 5 päivää istutuksen jälkeen, ja kasvaimen tilavuus määritettiin seuraavan kaavan mukaan: kasvaimen tilavuus (mm

3) = [pituus (mm)] x [leveys (mm) ]

2/2. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt eläinten eettisen komitean Kiinan PLA General Hospital (Luvan numero: 2013-X8-40). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Tilastollinen analyysi

Data kerätään useista riippumatonta koetta esitetään keskiarvona ± SEM, ja analysoitiin käyttäen Studentin

t

testiä. DACH1 ilmentymistaso välillä ruokatorven syöpä ja sovitettu viereisen kudosnäytteet verrattiin käyttämällä Wilcoxonin-rank-testi. Spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin laskettiin arviointiin korrelaatio ilmaisun ja metyloinnin DACH1. Suhde ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ja DACH1 metylaatiostatuksen analysoitiin chi-neliö testi.

p

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 15.0 ohjelmistolla.

Tulokset

DACH1 Expression on alaspäin säätelemä promoottorialue hypermetylaation in ESCC Cell Lines

DACH1 ilmentyminen säädeltiin promoottorialue hypermetylaation ihmisen peräsuolen ja maksasyövän. [12], [13] Tavoitteena on tutkia sääntelyn

DACH1

vuonna ESCC, ilmaisun ja metylaatiostatuksen

DACH1

havaittiin RT-PCR ja MSP ruokatorven syöpään solulinjoissa. Kuten kuviossa 1A, Loss of DACH1 ekspressio havaittiin KYSE150, KYSE510, TE1 ja TE3 solut, pienennetään DACH1 ilmentymistä esiintyi TE8 soluissa, ja ekspressio DACH1 havaittiin KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 ja KYSE410 solujen . MSP Tulokset on esitetty kuvassa 1B.

DACH1

oli täysin metyloitu KYSE150, KYSE510, TE1 ja TE3 soluja, osittain TE8, ja metyloitumaton vuonna KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 ja KYSE410 soluja. MSP tuloksia vielä vahvistanut bisulfiitti sekvensointi (BSSQ) in KYSE150, KYSE510, TE8 ja KYSE140 soluja (Fig. 1 C). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että promoottorialue hypermetylaation korreloi menetys /vähentäminen

DACH1

ilme. Re-ilmentyminen /lisäämällä ilmaus

DACH1

indusoitiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) in

DACH1

denaturoidulla ruokatorven syöpä solulinjoja (KYSE150, KYSE510, TE8, kuva 1A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että

DACH1

ilmentymistä säätelee promoottori-alueen metylaation ESCC solulinjoissa.

(A)

DACH1

ekspressiotaso havaittiin RT-PCR ruokatorven syöpäsolujen linjat. (B) metylointi asemaa promoottori alueella; IVD:

in vitro

metyloituja DNA, käytettiin metylointi valvonta; NL: normaali veren lymfosyyttien DNA, käytettiin unmethylation valvonta; U: metyloitumattomat alleelit; M: metyloitu alleeleja. (C) BSSQ on

DACH1

promoottorialue (-426 bp -140 bp) in KYSE150, KYSE510, TE8 ja KYSE140 soluja; kaksipäinen nuoli: MSP PCR-tuotteen, joka ulottuu 130 emäsparia. Täytetyt ympyrät: metyloitu CpG sivustoja; avoimet ympyrät: metyloimattoman CpG sivustoja.

DACH1 on usein metyloitu in Human ruokatorven syöpä

Tutkimaan edelleen metylaatiostatuksen

DACH1

aikana ihmisen ESCC kehitys, 10 tapauksissa normaali ruokatorven limakalvo, 51 tapauksessa eri laatuja dysplasia ja 104 tapausta ensisijaisen ESCC havaittiin MSP. Kuten kuviossa 2A ja 2B, 18,8% (6 32) ruokatorven luokan 1 dysplasia (ED1), 42,1% (8 19) luokan 2 ja 3. asteen dysplasia (ED2,3), ja 61,5% (64 104) invasiivisen ruokatorven syöpä (EY) olivat metyloituja, mutta yksikään niistä 10 tapausta normaali ruokatorven limakalvo oli metyloitu. Taajuus

DACH1

metylaatio nostettiin etenemistä taipumus aikana ruokatorven syövän synnyn (

P

0,01).

DACH1

metylaatio liittyy huono erilaistumiseen (

P

0,05) ja myöhäinen kasvain vaiheessa (

P

0,05) merkittävästi. Ei assosioitunut

DACH1

metylaatio ja ikä, sukupuoli, etäpesäke tai kasvaimen kokoa (

P

0,05, taulukko 1). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että

DACH1

metylaatio on varhainen tapahtuma ruokatorven syövän synnyn ja metylaation

DACH1

on kertynyt aikana etenemisen ruokatorven syöpään. Ilmentyminen DACH1 arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC) 30 tapauksessa sovitetun ruokatorven syöpä ja viereisen kudosnäytteistä. Ilmaisu väheni merkittävästi syöpänäytteissä (

P

0,01, Fig. 2C ja 2D). Se ehdottaa, että

DACH1

on mahdollista tuumorisuppressori ruokatorven syöpään. Jos haluat nähdä DACH1 ilmentymistä säätelevät DNA: n metylaation ihmisen ensisijainen syöpä, yhdistys DACH1 ilmaisun ja promoottorialue hypermetylaation analysoitiin. Vähentynyt ilmentyminen havaittiin 19 syöpätapausta kudosten ja 15 tapausta metyloitiin (Fig. 2E). Vähentäminen DACH1 ilmaisun liittyi promoottorialueen hypermetylaation merkitsevästi (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DACH1 ilmentymistä säätelee promoottori-alueen hypermetylaation ihmisen primaarisissa ESCC.

(A) edustaja MSP tulokset

DACH1

metylaatiostatuksen normaalin ruokatorven limakalvon (NE), ruokatorven dysplasia ( DE) ja ruokatorven syöpä (EY). (B)

DACH1

metylaation esiintymistiheys NE, ED1, ED2 ja ED3, ja EY. Taajuus metyloitu

DACH1

piirrettiin mukaan histologisia laatu ja analysoitu Chi-neliö testi. **,

P

0,01. (C) edustaja IHC tulokset DACH1 ilmentymisen ensisijainen ruokatorven syöpä (vasemmalla) ja viereisten kudosten (oikealla); Ylempi faasi, X200; alempi faasi, X400. (D) DACH1 ilmentymistaso 30 tapauksessa Hyväksytty ensisijainen syöpä ja viereisen kudosnäytteiden; rasiakuvaaja: edustaa DACH1 ilmaisun tasolla; vaakasuora viiva: edustavat mediaani tasolla; ylä- ja alarivillä laatikot edustavat 75% ja 25% ilmaisun tasolla, vastaavasti; pystypalkit edustavat eri ekspressiotason. **,

P

0,01 versus viereiseen kudosnäytteiden käyttämällä Wilcoxonin-rank-testi. (E) yhdistys

DACH1

metylaatio ja menetys /pienentää ilmentymisen 30 tapauksessa ESCC. **,

P

0,01, spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin.

Palauttaminen DACH1 Expression vaimentaa ruokatorven syövän kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

nähdä vaikutuksen

DACH1

ESCC soluproliferaatioon, KYSE510 ja KYSE150 solujen, jotka ilmentävät stabiilisti

DACH1

tai tyhjän vektorin vahvistettiin lentiviruksen transduktio. Solujen elinkelpoisuus ja pesäkkeiden muodostuminen analysoitiin

DACH1

vakaasti ilmaisseet soluja ja uusia, ohjaus. Re-ilmentyminen

DACH1

esti solujen lisääntymistä (

P

0,01, Fig. 3A) ja pesäkkeiden muodostuminen (

P

0,05, Fig. 3B) in näistä solulinjoista. Toiminto on

DACH1

ruokatorven syöpä tutkittiin myös vierassiirrekokeissa hiirimallissa (Fig. 3C). Kasvain koko oli pienempi

DACH1

ilmaisi KYSE510 soluja kuin verrokeilla (104,23 ± 21,38 mm

3 vs. 494,65 ± 81,98 mm

3

P

0,01, kuvio . 3D), ja kasvaimen paino oli vähemmän

DACH1

ilmaisi KYSE510 soluissa kuin kontrolliryhmässä (78 ± 28 mg vs 182 ± 37 mg,

P

0,01, Fig. 3E ). Ilmentyminen DACH1 validoitiin IHC vierassiirrekokeissa (Fig. 3F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

DACH1

tukahduttaa ruokatorven syövän kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

.

(A) kasvukäyrät ovat CCK-8 määritys tulokset

DACH1

ilmaistaan ​​soluja ja uusia, cells.Points, keskiarvo neljästä riippumattomasta kokeesta; baareja, SEM. **,

P

0,01, Studentin

t

testiä. (B) edustaja tulokset pesäkkeenmuodostusta

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 ja KYSE150 solulinjoissa. Pylväät, keskiarvo neljästä riippumattomasta kokeesta; baareja, SEM. *,

P

0,05 vs. kontrollit, käyttämällä Studentin

t

testiä. (C) edustajat tulokset ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä, ja

DACH1

ilmaistaan ​​ja uusia, KYSE510 soluja. (D) kasvukäyrät edustavat kasvaimen kokoon

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 solujen ksenograftin hiirten eri ajanjaksoina. Points, keskiarvo 5 hiirillä; baareja, SEM. *,

P

0,01, Studentin

t

testiä. (E) edustavat tulokset kasvaimen paino

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 solujen ksenograftin hiirten eri ajanjaksoina. Pylväät, keskiarvo 5 hiirillä; baareja, SEM. *,

P

0,01, Studentin

t

testiä. (F)-edustajalta DACH1 ekspressiotulokset havaitaan IHC varten

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 solujen ksenograftin. DACH1 ekspressio havaittiin

DACH1

ilmaistuna KYSE510 solun ksenograftin. (Oikealla). Suurennus: Ylempi faasi, X200; alempi faasi, X400.

Palauttaminen DACH1 Expression Lisääntynyt G

1 vaiheen ja alennetulla S Phase Cells

vaikutus

DACH1

solusyklin oli analysoitiin virtaussytometrialla on KYSE510 ja KYSE150 solulinjat. Kuten kuviossa 4A, suhde G1 vaiheen solun oli 51.05 ± 2,28% ja 38,56 ± 1,64% vuonna

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 solulinjoissa (

P

0,05). Suhde S-vaiheessa oli 25,72 ± 0,99% ja 37,09 ± 1,49% vuonna

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE510 solulinjoissa (

P

0,05). Suhde G1 vaiheen solun oli 65,46 ± 2,84% ja 44,41 ± 2,87% vuonna

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE150 solulinjoissa (

P

0,05). Suhde S-vaiheessa oli 12,34 ± 0,10% ja 32,06 ± 1,32% vuonna

DACH1

ilmaistaan ​​ja ilmaisemattoman KYSE150 solulinjoissa (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

DACH1

lisää G1 vaiheeseen ja vähentää S-vaiheen solujen ruokatorven syöpään.

(A) Virtaussytometria tulokset osoittavat: solun vaihe jakelun DACH1 ilmaisemattoman ja ilmaisi KYSE510 ja KYSE150 solujen . Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baareja, SEM. *,

P

0,05; **,

P

0,01, Studentin

t

testiä. (B) Western blot tulokset osoittavat: ilmentymistä G1 /S Check Point liittyvien geenien DACH1 uusia, ja ilmaisi KYSE510 ja KYSE150 soluja, β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

lisääntynyt ilmentyminen CDK2 , CDK 4, cyclinD1 ja cyclinE1 yleensä edustaa edistää solukierron välillä G1 vaiheesta S-vaiheeseen. Kuten kuviossa 4B, ilmaus CDK2, CDK 4, cyclinD1 ja cyclinE1 vähenivät ilmeisesti

DACH1

ilmaisi KYSE510 ja KYSE150 soluja verrattuna uusia, solujen. Se ehdottaa, että

DACH1

tukahduttaa solujen lisääntymistä estämällä G

1 /S tarkastuspiste ruokatorven syöpään. Vaikutus

DACH1

solun apoptoosi analysoitiin myös virtaussytometrialla on KYSE510 ja KYSE150 solulinjoissa, mutta ei apoptoosin muutoksia todettiin ennen ja jälkeen palauttamisen

DACH1

ilmentymistä näissä kahdessa solulinjassa (tuloksia ei ole esitetty).

palauttaminen DACH1 Expression Aktivoi TGF-β Signaling in ESCC

edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että

DACH1

suoritettiin anti-leviämisen vaikutus aktivoimalla TGF β signalointi ja estämällä c-Myc ilmentymistä ihmisen maksasyövän solulinjoja. [13] Sen määrittämiseksi, onko TGF-β-signalointi säätelee

DACH1

in ESCC, dual-lusiferaasireportteri määrityksessä käytettiin tutkimaan SBE4 lusiferaasiaktiivisuuden KYSE510 ja KYSE150 solulinjat. Kuten kuviossa 5A on esitetty, SBE4 promoottorin aktiivisuus kasvoi yli 3-kertaiseksi KYSE510 ja 2,6-kertaisesti KYSE150 solujen palautumisen jälkeen

DACH1

ilmaisun, ja aktiivisuus kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla palauttaminen

DACH1

ilme yhdistettynä TGF-β1 hoitoa. Edelleen ymmärtää mekanismia

DACH1

TGF-β signalointi, taso fosforyloidun Smad2 (p-Smad2) ja fosforyloitu Smad3 (p-Smad3), ja sen loppupään tavoitteet, p21 ja c-Myc arvioitiin in

DACH1

ilmaisemattoman ja ilmaisi KYSE510 ja KYSE150 solulinjoissa. Taso p-Smad2 ei muuttunut ennen ja jälkeen uudelleen ilmentäminen

DACH1

, kun taas taso p-Smad3 nostettiin jälkeen uudelleen ilmentäminen

DACH1

. Taso p-Smad2 ja p-Smad3 korotettiin lisäämisen jälkeen TGF-β1. p-Smad3 lisääntyi ilmeisesti kun lisätään TGF-β1 ja

DACH1

uudelleen ilmaisi KYSE510 ja KYSE150 soluja. Ilmaisu myötävirran geeneistä olivat erilaiset. p21 sääteli ja c-Myc oli alassäädetty jälkeen uudelleen ilmentäminen

DACH1

(Fig. 5B). Se vihjaa, että TGF-β signalointi aktivoidaan

DACH1

ja TGF-β1 tehostaa tätä vaikutusta. Edelleen vahvistaa vaikutuksen

DACH1

TGF-β signalointi, siRNA knockdown tekniikkaa käytettiin. Taso p-Smad2 eivät muutu, kun kaatamalla

DACH1

in

DACH1

ilmaisi KYSE140 soluja, mutta taso p-Smad3 aleni kun kaatamalla

DACH1

. Sekä p-Smad2 ja p-Smad3 korotettiin lisäämisen jälkeen TGF-β1. p-Smad3 lisääntyi hieman lisäämällä TGF-β1 ja siRNA transfektoituja KYSE140 soluja verrattuna vain kaatamalla

DACH1

. Vähentynyt p21 ja lisääntynyt c-Myc ilmentyminen havaittiin jälkeen kaatamalla

DACH1

vuonna KYSE140 soluissa (Kuva. 5C ja 5D). Edellä olevat tulokset viittaavat lisäksi siihen, että TGF-β signalointi aktivoidaan

DACH1

ihmisen ruokatorven syöpään.

(A) Smad-sitovia elementtejä (SBE) -4 Luc reportteri toimintaa KYSE510 ja KYSE150 solujen . Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baareja, SEM. (B) ekspressiotaso TGF-β signaloinnin alavirran geenien

DACH1

ilmaistaan ​​soluja ja uusia, solujen, β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) tehokkuus siRNA: iden kohdistaminen on

DACH1

in KYSE140 soluissa. (D) ekspressiotaso TGF-β signaloinnin alavirran geenien

DACH1

-siRNA KYSE140 solujen ja kontrolliryhmän, β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

ilmentyminen DACH1 väheni rinta-, eturauhas-, keuhko-, kohdun limakalvon, peräsuolen ja hepatosellulaarista karsinoomaa, mutta se kasvoi munasarjasyöpä. [7] – [13], [21] DACH1 ilmentyminen säädeltiin promoottorialue hypermetylaation endometriumin, peräsuolen ja maksasyövän. [11] – [13] Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että DACH1 ilmentyminen väheni ja ilmentymistä DACH1 säädeltiin promoottorialue hypermetylaation ihmisen ruokatorven syöpä. Olimme raportoitu, että monet tuumorisuppressoreilla olivat metyloituja kanssa etenemistä taipumusta aikana ruokatorven syövän synnyn. [15], [16], [22], [23] Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet metylaatiostatuksen

DACH1

normaalissa ruokatorven limakalvon, eri laatuja dysplasian ja kohdunkaulan syöpä.

DACH1

oli usein metyloitavaa ruokatorven syöpä ja taajuus nostettiin etenemistä ruokatorven syövän synnyn normaalista ruokatorven limakalvon kohdunkaulan syöpä. Se ehdottaa, että

DACH1

on ruokatorven syöpä varhaisen havaitsemisen merkki. Yhdistyksen köyhien erilaistumisen ja myöhäisessä kasvaimen vaiheessa

DACH1

metylaatio viittaa siihen, että

DACH1

metylaatio saattaa olla ruokatorven syöpään ennustetekijöiden merkki.

DACH1

oli pidetään tuumorisuppressorina tai onkogeenin erilaisia ​​syöpä. [7] – [13], [21] Tutkimuksessamme

DACH1

todettiin tukahduttaa ruokatorven syövän kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

. TGF-β-superperheen on joukko monitoiminen sytokiinien, jotka säätelevät solujen kasvua, erilaistumista, apoptoosin, muuttoliike ja angiogeneesiä. [24] – [27] Normaalissa epiteelisolujen, TGF-β signalointi käsittää transkriptionaalisen aktivaation sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjä p21Cip1, ja tukahduttaminen kasvua edistävää transkriptiotekijä c-Myc. Yhteistyöhaluisesti, nämä geeni vasteet välittävät solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa. [28] – [30] TGF-β signalointi on kriittinen mutta paradoksaalista rooli eri syöpiä [31] – [33]. Rintasyövässä TGF-β signalointi estää solujen kasvua alkuvaiheessa ja edistää syövän invaasio myöhään vaiheessa. [34] Edellinen tutkimus rintasyöpään osoitti, että DACH1 esti TGF-β signalointi sitomalla Smad4. [20] Vaikka hepatosellulaarinen syöpä, löysimme DACH1 aktivoitu TGF-β signalointi lisäämällä p-Smad3. Se parantaa tukahduttaminen c-Myc ilmaisun ja solujen lisääntymistä. [13].

Tukeakseen Edellisen raportin, joka DACH1 indusoi p21-proteiinin runsauden ja antagonisoi Myc aiheuttama onkogeenisen fenotyypin rintasyövän, [35] me täällä että ektooppinen ilmentyminen DACH1 yksin ruokatorven syöpäsoluja kasvoi p21 ja laski c-Myc-proteiinin taso (kuvio. 5B). Lisäksi DACH1 synergized TGF-β parantaa induktion p21 ja tukahduttaminen c-Myc; vastaavasti, kaatamalla DACH1 tukahdutettu TGF-β signalointi KYSE140 soluissa. TGF-β signalointi voi ylikuulumisongelmissa monien muiden polkuja. p53 ja Smad: ien fyysisesti vuorovaikutuksessa ja synergisesti coregulated TGF-β kohdegeenien, kuten p21 ja p15. [36] Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että DACH1 liittyvät p53 ja parannettu p53-toiminto apoptoosin ja estää kasvaimen kasvua. Lisäksi tutkimus osoitti, että DACH1 yhteinen täyttöaste -15% p53-sidottu geenien piiritekniikan sekvensointi. [7], [9] DACH1 aktivoitu TGF-β signalointia (Fig. 5A), ja indusoitu fosforylaatio Smad2 /3 (kuvio. 5B), joka on mahdollinen selitys on aktivaatio ja stabilointi Smad2 /3-proteiinin kompleksin DACH1 kuten p53 . Kuitenkin yksityiskohta mekanismi on osoittautunut.

Yhteenvetona

DACH1

usein metyloitu ihmisen ruokatorven syöpä ja metylaation

DACH1

osallistuu alkuvaiheessa ruokatorven syövän synty. DACH1 ilmentymistä säätelee promoottorialue hypermetylaation.

DACH1

tukahduttaa ruokatorven syövän kasvua aktivoimalla TGF-β signalointi.

Kiitokset

Kiitos Dr. Cvekl tarjota DACH1 ekspressiovektoreiden.