Krooninen sairaus

tiivistelmä

pahanlaatuiset Pleuraeffuusiot (MPE) saattaa olla hyödyllinen malli tutkia hierarkkinen etenemisen syövän ja /tai kasvaimeen heterogeenisyys. Vahvistaa perustelut kehittää MPE-mallin näitä tarkoituksia varten, ryhdyimme löytää näyttöä siitä, onko syövän kantasoluja (CSC) MPE ja osoittaa kykyä ylläpitää kasvaimensisäisenä heterogeenisyyden MPE-primääriviljelmien. Tutkimuksemme osoittavat, että

ehdokas

keuhko CSC-ilmentyminen allekirjoituksia (PTEN, Oct4, hTERT, Bmi1, EZH2 ja SUZ12) ovat ilmeisiä solupelletteihin eristetty MPE, ja MPE-sytopatologialle myös tarrat

ehdokas

-CSC (CD44, cMET, MDR-1, ALDH) alapopulaatiot. Lisäksi primaariviljelmiä, jotka käyttävät MPE lähteenä sekä kasvainsolujen ja kasvaimen mikroympäris- (TME),

ehdokas

CSC säilyvät ajan kuluessa. Tämä antaa meille mahdollisuuden elää lajitella

ehdokas

CSC-fraktiot MPE-kasvain mix perusteella pintamerkkiaineita (CD44, c-MET, uPAR, MDR-1) tai erot xenobiotic aineenvaihdunnassa (ALDH) . Siten MPE-primaariviljelmiä tarjoavat avenue poimia

ehdokas

CSC populaatioita yksittäisistä (isogeenisistä) MPE-kasvaimia. Näin voimme testata, ovatko nämä solut voidaan erottaa toiminnallisesti biotesteissä. Kasvain heterogeenisyys MPE-primääriviljelmissä on osoituksena vaihteleva immunoleimaus, erot pesäkkeitä morfologia, ja erot leviämisen hinnat solualapopulaatioiden. Yhdessä nämä tiedot perustella jatkuvaa kehittämistä MPE-mallin tutkinnan kasvaimensisäisiä heterogeenisyys, kasvaimeen TME vuorovaikutusta, ja fenotyyppinen validointi

ehdokas

keuhko CSC, lisäksi tarjoaa suunnan prekliinisen kehityksen rationaalisen hoitomuotoja.

Citation: Basak SK, Veena MS, Oh S, Huang G, Srivatsan E, Huang M, et al. (2009) pahanlaatuinen pleuraeffuusio mallina tutkimiseen kasvaimensisäisenä heterogeenisuus Lung Cancer. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10,1371 /journal.pone.0005884

Editor: Mauricio Rojas, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 joulukuu 2008; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2009; Julkaistu: 12 kesäkuu 2009

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Rahoitusta tutkimuksen antamat Veterans Affairs Biomedical Research Funds. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään kuolleisuus maailmassa. Nykyinen hoito on suhteellisen tehoton, ja 5-v eloonjäämisaste on noin 15%. Kasvaimensisäistä heterogeenisyys mahdollisesti taustalla vastus keuhkosyövässä nykyisiin hoitoihin; Näin osuus kasvaimensisäistä heterogeenisyys voi olla tärkeä avain kehittää onnistuneen hoidon strategioita keuhkosyöpään. Valitettavasti nykyiset mallit keuhkosyöpään ovat rajattuja opiskelemaan kasvain heterogeenisuus. Pahanlaatuinen Pleuraeffuusiot (MPE) tarjoavat ainutlaatuisen mahdollisuuden kulttuurin monenlaisia ​​syöpäsolujen yhdestä yksilöstä, jotta hahmotella ja luonnehtia erilaisia ​​kasvaimensisäisenä heterogeenisyys löytyy kehittynyt keuhkosyöpä.

tuotteiden valintaa MPE, alueellisesti pitkälle keuhkosyöpään että ennakoi huono ennuste, mallina tutkia kasvaimensisäisenä heterogeenisuus on kaksijakoinen. Ensin evoluutiomallin syövän ennustaa, että kehittyneet tautitiloja ovat todennäköisemmin kuvata heterogeenisuus [1]. Toiseksi, joka perustuu henkilökohtaiseen havaintojen useiden vuosien opiskelua MPE [2], [3], [4], [5], tiesimme, että saatuja primääriviljelmiä MPE aluksi näkyy selvästi kulttuurin heterogeenisyys matkalla perustamisesta morfologisesti homogeenisen syöpä solulinjat. Emme kuitenkaan ollut aikaisemmin tutkittu biologisen tai ajallisen Näiden havaintojen prospektiivisessa tavalla.

Ei ole olemassa vakiintuneita kulttuuriin MPE, jonka tavoitteena on ylläpitää kasvaimensisäisenä heterogeenisyys. Niinpä ryhdyimme kehittämään primaariviljelmää malli

de novo

. Tämä malli sisältää MPE-neste komponentti ja uutetaan strooman solujen kasvaimen mikroympäris- (TME), joka tarkasti jäljittelee

in situ

miljöössä. Tuloksemme osoittavat, että sisällyttäminen näiden elementtien näyttää säilyttää kasvain heterogeenisuus. Koska kasvaimen heterogeenisyys voi aiheutua hierarkkinen etenemistä transformoitujen epiteelin [6], [7], me arveltu, että mukana yhdistelmä kasvainsolujen MPE ovat soluja, jotka voivat toimia syövän kantasolut tai esi. Tämä käsikirjoitus todiste siitä, että

ehdokas

CSC voidaan fraktioida MPE primääriviljelmien. Nämä todisteet oikeuttaa edelleen kehittämistä MPE mallin tarkasteluun kasvaimensisäisenä heterogeenisyys ja tutkimus

ehdokas

CSC-fenotyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

MPE eristäminen, jalostus ja kulttuuri

Kaikki koehenkilöt kävivät kirjallinen suostumus menetelmällä hyväksymä Institutional Review board klo Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Kaikki koehenkilöt olivat veteraaneja ja aktiivinen tai entisiä tupakoitsijoita, ja MPE-näytteitä hankittiin suuri määrä thoracenteses. Näytteet käsiteltiin kuten on kuvattu kuviossa 1. Lyhyesti, sentrifugoinnin jälkeen (200 x g, 20 minuuttia, huoneenlämpötila), solupelletit suspendoitiin uudelleen Ficoll tiheysgradienttia. Suurin sallittu virhe-supernatantti steriilisuodatettiin ja käytetään muotoiluun

p

rimary

c

ulture

m

Edium [PCM; DMEM-H (HyClone, UT) + 30% v /v suodatettiin steriilisti MPE-nesteen komponentti + penisilliini-G /streptomysiini 1000 U /ml ja amfoterisiini B: tä 0,25 ug /ml (Omega Scientific, CA)]. Valinta 30% v /v osa MPE-nesteen komponentti johdetaan empiirisesti. Koska avain liukeneva ja /tai solujen komponentteja, jotka edistävät ylläpito kasvaimen heterogeenisyys MPE-primääriviljelmissä (joihin) ei tunneta, ja sillä on effuusio-to-nestekertymä vaihtelua pitoisuuksia liukoista tekijöiden valintaan 30 % v /v MPE-neste komponentti perustuu havaintoihin primääriviljelmien valomikroskoopilla. Lyhyesti, tarkkailtiin kolme erilaista suurimmat sallitut virheet primaarisissa viljelmissä, jotka sisälsivät joko 100%, 70%, 50%, 30% ja 10% MPE-nesteen komponentti. Arvioimme kulttuuri eheys ja vaihtelevuus mikroskoopilla, ja mittasi jakeet kelluvien kuolleita soluja (trypaanisini värjäys) jokaisessa kunnossa usean päivän. Ei ollut mitään ilmeistä laadullisia eroja kulttuurin eheyttä tai vaihtelua, ja mitään määrällisiä eroja kelluva kuolleiden solujen keskuudessa 70%, 50%, ja 30% v /v MPE-neste olosuhteissa. 100% ja 10% v /v MPE-olosuhteissa nousu oli solukuoleman kaksi kolmesta effusions. Tämä havainto yhdistettynä käytännön huomioon, että MPE-neste komponentti oli

rajoittava tekijä ajaksi kokeilu primääriviljelmissä, johti meidät käyttämään 30% v /v MPE muissa tapauksissa.

MPE uutettiin keuhkopussiontelosta keuhkosyöpäpotilaiden. Kerätty MPE oli

sedimentoidusta (200 x g) B ja

Solupelletti

erotettiin MPE nestettä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen minimum essential väliaineessa, joka sisältää MPE-nestettä ja kerrostettu

Ficoll-gradientilla

. Tumallisten solujen fraktio, joka oli suurelta osin vailla punasolujen useimmissa tapauksissa kerättiin sanoa väliin Ficoll kaltevuus ja Suspensioväliaineena ja käsitellään värjäystä (

H Ensisijainen leimaamatonta anti-cMET (hiiren IgG2a, Abcam # 49210), ensisijainen leimaamatonta anti-MDR-1 (hiiri monoklonaalinen, Chemicon # Mab4338), ja anti-uPAR (Santa Cruz Biotech # 13522). Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin tutkimuksessa: Goat F (ab ’) 2 anti-hiiri-IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratoriot # M35018) ja vuohen anti-hiiri-F (ab’) 2-IgM (Jackson Immuno- ).

sytopatologialle sekä immunoleimaus

Soluryppäät tutkittiin käyttäen faasikontrastimikroskopialla (Leica – Leitz DMRBE) on katettu lasilevyille, tai valomikroskoopilla seuraavat kiinnitys ja värjäys. Jälkimmäisessä solut kiinnitettiin etanolissa (Fischer Scientific, PA) tai Z-fix (Anatech, MI) sedimentoitiin tuottamaan solun painike, joka parafiiniin. IHC, kohdissa (5 pm) poistettiin parafiini ja niihin lisätään ksyleeniin ja etanoliin. Antigeeni haku [10 mM sitruunahappo (pH 6), 70 ° C, 30 min, kaksi kertaa välissä vesipesun) suoritettiin, minkä jälkeen kalvot jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja peräkkäin huuhdeltiin deionisoidulla vedellä ja PBS. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin (PBS + 2% vetyperoksidia), ja näytteet peräkkäin estetty [1% naudan seerumin albumiinia /PBS, huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen hiiren seerumia (Santa Cruz Biotechnology), 30 min, huoneen lämpötila] . Kudosleikkeet pestiin sitten kahdesti PBS: llä, inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (HRP-konjugoitu vuohen anti-hiiri, Santa Cruz Biotechnology, 30 min, huoneen lämpötila), huuhdeltiin PBS: llä ja altistettiin DAB substraattipakkausta (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Negatiiviset kontrollit hyödynnetään tyypillisesti toissijainen vasta-aine yksinään ilman merkintöjä, jonka ensisijaisena. Värjätyt leikkeet havaittiin mikroskoopilla (Leica – Leitz DMRBE tai Olympus IX71) ja otettujen kuvien analysoitiin käyttämällä Openlab ohjelmistoa. Positiivisesti värjätään solualueisiin arvioitiin käyttäen Image Pro Plus ohjelmisto. Soluklusterien manuaalisesti määritelty vaihe kuvien ja epäsäännöllinen AOI työkalu ja tuloksena ryhmät segmentoitu perustuvat empiirisesti määritetty positiivista värjäytymistä kynnys. Prosenttia positiivisesti värjäytyneiden solujen arvioitiin perustuen murto alueelle värjäys sisällä koko klusterin alueella.

käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) B

RNA eristettiin ensisijaisen MPE ja kulttuuri isolaatit käyttäen Trizol reagenssia ja Fast Track 2,0 mRNA eristäminen (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). 500 ng mRNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen RT (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) noudattaen valmistajan suosituksia. Kaksi xl: n näyte syntetisoitu cDNA: ta käytettiin PCR: n monistamiseen PTEN, Oct4, Bmi1, hTERT, SUZ12 ja EZH2 geenejä. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat:

PTEN

Forward – 5 ’GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3’, käännetyn 5 ’TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3’,

Oct4

lähetetään edelleen 5’CAACTCCGATGGGGC CCT-3 ’, ja Reverse -5 ”CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3 ’

Bmi1

Forward – 5′ AATCTAAGGAGGAGGTGA 3 ’, käännetyn 5’ CAAACAAGAAGAGGTGGA 3 ’,

hTERT

Forward -5′ GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3 ’, käännetyn 5’ CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3 ’,

SUZ12

Forward – 5 ’GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3’, ja Reverse 5 ’- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA – 3’,

EZH2

Forward 5 ’TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3’, Reverse 5 ’TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3’. Sillä

PTEN

monistuksen olosuhteet olivat seuraavat: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 4 minuuttia, jonka jälkeen 32 sykliä 94 ° C: ssa for1 minuutin, 57,5 ​​° C: ssa 1 minuutti ja 72 ° C: ssa 3 min. Lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan käytettiin. Amplification olosuhteet

Oct4

olivat alkudenaturaation 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, mitä seurasi 32 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekuntia lopullisen pidennys 72 ° C: ssa 5 min. Amplification olosuhteet

Bmi1

: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 4 min, jota seurasi 32 sykliä 94 ° C 1 min, 53 ° C 1 min, 72 ° C 1 min ja lopullinen laajennus 7 min 72 ° C: ssa. Sillä

hTERT

monistuksen olosuhteet olivat: aluksi denaturointi 94 ° C: ssa 4 minuutin ajan, minkä jälkeen 32 sykliä 94 ° C: ssa 50 sekunnin ajan, 52 ° C: ssa 50 sekunnin ajan, 72 ° C 1 min, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Sillä SUZ12 ja EZH2 vahvistus: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 sekunnin kuluttua; 55 ° C 30 sekuntia; 72 ° C: ssa 30 s, ja 7 minuutin lopullinen pidennys 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin 8% TBE (50 mM Tris boraattia, pH 8,0, 1 mM EDTA), geelit, jota seuraa etidiumbromidivärjäyksellä. Geelit analysoitiin käyttämällä Kodak 1D-ohjelmisto.

Virtaussytometria ja Aldefluor määritys

FACS-analyysit ensisijainen viljellyistä MPE-soluissa suoritettiin standardin mutichannel FACS-analyysillä käyttäen FACSCalibur-sytometrillä (Becton Dickinson, San Jose , CA) ja FCS Express analyysi ohjelmisto (De Novo Software, Ontario, Canada). Sekä tarttumattomat ja tarttuneet solut kerättiin ja yhdistettiin. Solut primääriviljelmässä irrotettiin käyttäen trypsiinikäsittelyllä /Versine, pestiin PBS: llä, joka sisälsi 2% BSA, ja leimattu suoraan fluorokromileimattuja tagged ensisijainen vasta-aineita tai leimaamatonta primaarinen vasta-aine, jossa fluorokromileimattuja sekundääriset vasta-aineet (kuten alla). Sekä ensisijainen ja toissijainen vasta-ainepitoisuudet olivat johdonmukaisesti pidettiin 1 ug /1 x 10

6 solua; -solut leimattiin 45 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja se pestiin peräkkäin kolme kertaa PBS: ssä, joka sisälsi 2% FBS: ää, suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja pidettiin jäissä ennen FACS-analyysit. Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) määritys, joka mittaa aldehydidehydrogenaasin (ALDH) aktiivisuus, suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. MPE-soluja primäärisestä viljelmästä suspendoitiin Aldefluor määrityspuskuriin, joka sisälsi ALDH-substraatti, BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA; 1,5 mM), ja inkuboitiin 50 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tarkistaa, spesifisyys, joka on yhdensuuntainen näytteen inkuboitiin identtisissä olosuhteissa, mutta kun läsnä on 10-kertainen molaarinen ylimäärä ALDH-inhibiittoria, diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Tämä pienenemisestä fluoresenssin voimakkuus ALDH-positiivisten solujen käytettävä kompensoimaan virtaussytometriin analyysit.

Tulokset

MPE-ominaisuudet, jalostuksen ja primääriviljelmässä

kehittää malli tutkia keuhkosyöpä endophenotypes primääriviljelmässä, fraktioimme solun ja nesteen osastoihin MPE (kuvio 1). Kliiniset ominaisuudet effusions, joita käytetään tuottamaan tämän aineisto olivat tyypillisiä MPE (taulukot 1 ja 2, katso alla). Seitsemän yhdeksästä effusions oli pahanlaatuinen perusteella cytopathological diagnoosin (taulukko 1). Kahdessa MPE, lopullinen sytopatologialle tulkintaa 100 ml näyte näyte oli ”erittäin epäilyttävä, mutta tuloksettomia”; Tapauksia mukaan, koska kasvu kasvain näkyi primääriviljelmissä (mukaan lukien

in vivo

yhdessä tapauksessa, tuloksia ei ole esitetty). Aiemmat tutkimukset olivat pitkään osoittivat, että pinnoitus tehokkuutta ja johtaminen primääriviljelmien kliinisistä keuhkosyöpä yksilöitä on huono, ja on riippuvainen sekä viljelyolosuhteet ja isäntä liittyvät tekijät [8], [9], [10], [11]. Kuitenkin nämä tutkimukset eivät täydentää primaarikasvaimen viljelmiä komponentteja

in situ

kasvaimen mikroympäris- (TME), mahdollisesti siksi, että ensisijainen tai ainoa tavoite oli luoda kuolematon tuumorisolulinjoissa. Itse asiassa, jotta voidaan määritellä ”puhdas kasvain” solulinjoja määritellyissä olosuhteissa, kaikki aikaisemmat lähestymistavat ryhtyivät toimiin minimoida ”saastuminen” kulttuurien kanssa TME-elementtejä. Näin ollen, jos erillinen kasvaimen solualapopulaatioiden olemassa yksittäisiä kasvaimia, jotka riippui TME elementtejä hengissä, sitten käyttämällä keinotekoisia TME saattanut koitui kasvun etua yksittäisille kasvain solualaryhmiä jatkuvassa viljelyjärjestelmässä. Näin ollen, on mahdollista, että syöpäsolu malleja ”valittu”, jonka viljelmä TME, jota käytettiin johtamaan kasvainsolulinjat.

perusteltu, että täysi kasvainsolun endophenotypes olisi parasta tutkittu primääriviljelmissä että sisällytetty autologiset TME. Siten yritetään ylläpitää kasvaimensisäisenä heterogeenisuus

ex vivo

, sekä kasvaimeen liittyvässä tumallisten solupopulaation ja nesteen komponentti MPE käytettiin rikastuttaa primääriviljelmässä-TME. Voittamiseksi aikaisemmin kirjattu tehottomuus perustamisesta primaarikasvaimen kulttuureissa, ja jotka perustuvat empiiriset havainnot on kuvattu menetelmiä, valitsimme ”optimaalinen” kunnossa olevan 30% MPE-neste komponentti sekoitetaan v /v peruskuormitus- alustassa, joka sisälsi antibiootteja (ensisijainen viljelyalusta tai pCM). Vuonna

PCM

, sekä primääriviljelmässä ja sarja kohtia pysyivät korkeampia monimuotoisuutta morfologia, ja viljelmät näytti olevan vakaampi (verrattuna rinnakkain kasvun sikiön seerumia, tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi hyödyntäminen 30% v /v-osa MPE-nesteen pystyimme säilyttää tämä rajoittava reagenssi pidempiaikaisen kokeilu primääriviljelmien. Käyttämällä tätä menetelmää, perustimme primääriviljelmien MPE-kasvainten kaikki seitsemän yritystä.

Alustavat analyysit osoittivat, että supernatantti korkeasti rikastettua tulehdussytokiinejä, jossa pitoisuudet interleukiini (IL) 1, IL 6, CXC-kemokiini ligandin 10 (IP10), CC-kemokiini-ligandi 2 (MCP1), ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), joka arvioitiin olevan 10 ng /ml. Nämä ja muut tekijät, jotka todennäköisesti peräisin kasvain, strooman ja /tai verenkierrossa olevien solujen MPE (taulukko 2), vaikuttivat monimutkainen yhdistelmä sytokiinien, kemokiinien ja kasvutekijät MPE-neste komponentti. Mitä tulee solujen MPE-komponentteja, nukleoiduissa solumäärät vaihteli 1,3 × 10

8-2,5 x 10

9 solua litrassa effuusio. Hallitseva kiertävä solutyyppi TME olivat lymfosyytit (keskiarvo ± StDev: 60 ± 26% pois koko 681 ± 560 WBC /ul), jolla on huomattava ( 1%) fraktioita PMN, makrofagien, monosyytit ja mesoteelisolut (taulukko 2) lähes kaikissa effusions. Siten mitä tulee niiden kiertävien solujen koostumus ja biokemia (ne olivat kaikki eritteet) [12] effusions tutkittiin olivat tyypillisiä MPE.

Todisteet kasvaimensisäisenä heterogeenisyys uutettu MPE-kasvain näytteet

Kuva 2A näyttää edustavan H E kasvaimen yksilöitä peräisin MPE esittää ryhmiä ja järjestäytynyttä pallosia vaihtelevia morfologia, ja solu /strooman koostumuksia (20 × tai 100 x). (B) IHC varten ehdokas CSC merkki ilme. Kasvain näytteet peräisin MPE oli immunolabelled varten

ehdokas

CSC markkereita, mukaan lukien CD44 (40 x ja 400 x), cMET (100 x ja 400 x), MDR-1 (100 x ja 400 x), ja ALDH -1 (40 x ja 200 x).

MPE-kasvaimet ilmentävät CSC-markkereita osallisena kantasolujen laajentamiseen tai pluripotenttisuus ohjelmia

yleensä kasvaimia syntyy, koska epänormaali pidätys aikana kudoksen erilaistumisen [29], [30]. Yksi ensimmäisistä ilmentymiä erilaistumisen pidätys on, että laajennus kantasolujen allas. Täten molekyyli allekirjoitukset progenitorisolujen voivat toimia

ehdokas

CSC-biomarkkerit. Tältä osin eläinkokeissa oli sekaantunut PTEN asianmukaisesta ylläpitoon ja erilaistumista reuna keuhkojen progenitorisolupopulaatioon [31]. PTEN promoottori hiljentäminen on osoituksena ihmisen keuhkosyövän [32], syytetään tämän reitin sen kehittämiseen ja /tai etenemistä. Telomerase (hTERT) aktivointi edistää keuhkosyövän synnyssä [33], ja hTERT yleisesti aktivoidaan keuhkosyöpä. Yhdessä p16 (INK4a), hTERT näyttää olevan tarpeen solujen kuolemattomia, joka luonnehtii sekä kantasoluja ja kasvainsoluissa [34], ja sen ilmentyminen voi osoittaa dynaamisen muutoksen osa kuolemattomaksi fenotyypin [35], [36]. Jaettu merkkiaineiden välillä

ehdokas

CSC ja kantasolut myös väyliä, jotka välittävät solujen itseuudistumisen ja pluripotentti-. Oct4 on alkion markkeri, joka liittyy pluripotenssia, ja on yleisesti käytetty leimaamiseen CSC-fenotyyppi [21], [37]. Vastaavasti sääntelyä pluripotenttien tila epigeneettiseltä ohjataan rakenteelliset muutokset kromatiinin [38], [39], [40]. Transkriptionaalisen säätelyn aikana pluripotenssissa tilassa on soveltavat Polycomb (PCG) proteiinien, jotka toimivat muokata kromatiinirakenteeseen. SUZ12, EZH2, ja Bmi1 ovat komponentteja PcG komplekseja, ja koska niiden ilmaisun kehittäminen on ominaista kudosten kantasolujen, ne on myös käytetty leimaamiseen

ehdokas

CSC-fenotyyppi [6], [7] , [41]. Testata, jos nämä molekyyli signaalit

ehdokas

CSC voitiin havaita MPE-kasvaimissa, RNA uutettiin tumallisten solufraktiois- ja RT-PCR näiden merkkiaineiden suoritettiin. Olemme havainneet, että nämä

ehdokas

CSC-biomarkkerit ilmaistiin eri MPE-kasvaimissa (kuva 3). Nämä tiedot osoittivat, että keuhkojen CSC-fenotyyppi säilyi MPE huolimatta tulehduksellinen miljöö MPE-TME, vaikka sellaisia ​​tavanomaisia ​​pääperiaatetta koskien CSC kapealla ympäristöä. Ehkä tämä johtui siitä, että CSC oli suojattu (kuten on kuvattu) liukoisesta TME kasvaimen ryhmittymien jotka yleensä todisteena MPE. Vielä tärkeämpää on, nämä tulokset myös asettaa vaiheessa dynaamisesti seuraamalla näitä molekyyli signaalit kokeellisia muutoksia osaksi viljelyolosuhteet käyttöön pyrkimyksissä rikastamiseksi CSC-fenotyyppi.

Expression profiilit PTEN, Oct4, hTERT, BMI1 , SUZ12, ja EZH2 tutkittiin käänteistranskriptaasi-PCR: llä. RNA uutetaan tumalliset solupelletti MPE käänteistranskriboitiin ja cDNA: ta käytettiin PCR-monistuksen vastaavat geenit. PCR-tuotteet erotettiin 10% TBE geelit, minkä jälkeen etidiumbromidivärjäyksellä, ja analysoitiin käyttäen Kodak 1D-ohjelmisto. PTEN, hTERT, SUZ12, EZH2 olivat tasaisesti ilmentyy kaikissa MPE, kun taas BMI1 ja Oct4 ilmentymistä ei havaittu yksittäisten näytteiden. Beta tubuliinia käytettiin latauskontrollina.

Todisteet kasvaimensisäisenä heterogeenisyys MPE-primääriviljelmissä

MPE-ensisijainen viljelmät perustettiin PCM. Näissä olosuhteissa, ensisijaisen kulttuureissa näkyvät monipuolinen morfologit (kuvio 4A), ja vaihtelevasti kasvuvauhti hidasta. Ensisijainen viljelmät tyypillisesti kesti useita viikkoja ”kypsä” (kuten määritelty kasvu viljelyastias- lähestyy 70-80% yhtymäkohta). Yli tämä väli, klustereiden ja pallomaisia ​​rakenteita, jotka havaittiin alkuperäisessä MPE-sytopatologialle eivät olleet hyvin konservoituneita. Kuitenkin primaariviljelmiä näytetään fenotyyppinen heterogeenisyys, joka ei ollut aiemmin tutkittu. Aikana kehitys, ensisijainen viljelmiä aina koostuu pesäkkeitä vaihtelevalla morfologit (kelluva aggregaatit poissulkevia trypaanisinistä, giant cell pesäkkeitä, fibroblastit ja cobblestoned klusterit), vaikka se samaan pulloon, jossa on ilmeisesti samat TME (kuvio 4A). Nämä pesäkkeet näyttivät laajentaa vaihtelevilla hinnat, mikä viittaa siihen, että heillä oli eri proliferatiivinen indeksejä, vaikka se on ”yhteinen” ympäristössä. Me perusteltu, että jos CSC, kuten kudoksen progenitorisolujen oli alentunut liikevaihto, niin erot leviämisen antaisi meille mahdollisuuden eristää jakeet rikastettu CSC. Testata, onko tällainen strategia oli toteutettavissa MPE- primääriviljelmiä kehitimme elävien solujen lajittelua strategiaa, käytetään Karboksifluoresenssimerkintä sukkinimidyyliesteriä (CFSE) testissä-merkintäjärjestelmä fraktioida solujen perustuu eri replikointi indekseihin. CFSE on kalvon läpäisevä reagenssi, joka pilkkoutuu solunsisäisten esteraasien, jolloin saadaan fluoresoiva amiini-reaktiivinen metaboliitti, joka pysyy sytoplasmassa viikkoja. Joka kerta soluja tehdään jako, määrää CFSE läsnä jokaisessa tytärsolu puolittuu. Solut, jotka eivät jäljittelevän säilyttää etiketti. Siten

jos

CSC ovat hitaasti jäljittelevän,

sitten

etiketin säilyttäen väestö olisi rikastettu CSC. Vaikka solulinjat, jotka muodostavat etiketin säilyttäen osajoukko täytyy määritellä paremmin, nämä pilotti, proof-of-concept tutkimukset ehdotti, että MPE-kasvain fraktiointi perustuu eroihin leviämisen indeksit oli toteutettavissa (ks tarran pidättävän solupopulaation-M1 syntyy ajan mittaan

pCM;

kuva 4B). Yhteenvetona erot morfologiassa, leviämisen, pintamerkkiaine ja metaboliset ominaisuudet mahdollisesti heijastaa erillisiä endophenotypes syöpäsolujen MPE. Vaikka toiminnallinen korreloi liittyvät kunkin näistä ominaisuuksista on vielä tutkittava tarkemmin, tuloksemme osoittavat, että MPE-primääriviljelmissä, tutkinnassa kasvaimensisäisenä heterogeenisuus on mahdollista.

(A) Morfologiset heterogeenisyys primaariviljelmän. Kolme erilaista MPE (näyte A, näyte B ja näyte C) viljeltiin PCM arvioitiin pesäkemorfologiaa. Jokainen sarake (A, B, ja C) edustaa erillistä näytettä. Edustavia mikrovalokuvia pesäkkeitä heterogeenisyys by faasikontrastimikroskopiaan päivinä 3, 15 ja 20 primaariviljelmää (rivit 1, 2 ja 3, tässä järjestyksessä) esitetään. Valomikroskooppikuvat riveissä 1, 2 ja 3 ovat suurennoksia 40 x, ​​100 x ja 400 x, vastaavasti. (B) MPE-osajoukkojen primääriviljelmässä voidaan fraktioida perusteella eroista leviämisen: edustaja virtaus histogrammit Päivä 1 vs. päivä 9 a CFSE-leimatun primaariviljelmän. Paisuntakaari, alapopulaatiot jotka ovat proliferatiivisen menettää CFSE etiketti, ja ne, jotka ovat lepotilassa pitää etiketti. Tässä esimerkissä

päivänä 1, 96,14%

Kreivien sijaitsevat alueella aidatulla mukaan M1; on

päivän 9, 8,36%

Kreivien sijaitsevat alueella aidatulla mukaan M1.

Rationaalisesti fraktioimalla MPE-primääriviljelmissä lajitella otaksuttu CSC-subpopulaatio

kun molekyyli allekirjoitusta viittaa siihen, että CSC ovat läsnä MPE, me seuraavaksi testata, jos voisimme kaapata

ehdokas

CSC MPE-kasvaimia. On kypsyminen, MPE-ensisijainen viljelmät lajiteltu perusteella

ehdokas

CSC-markkereita. Mielenkiintoista on, että kussakin tapauksessa tähän mennessä testatuissa pinta immunofenotyyppi solujen primääriviljelmässä yleisesti merkitty ilmeinen laajennus CD44 + fraktio (kuvio 5). Kun taas solut olivat lähes kauttaaltaan positiivisia CD44 ilmaisun jakeet olivat vaihtelevasti positiivisia cMET, CD166 [42], ja uPAR [43] lauseke (kuva 5). Lisäksi käyttäen fluoresoivaa määritystä, joka oli raportoitu lajitella otaksuttu CSC keuhkosyöpä, rintasyöpä, ja useita myelooma [26], [27], [28] perusteella ero ALDH toimintaa, pieni osa MPE johdettujen primaarikasvaimia esitellyt ALDH

hi /CD44

+ fenotyyppiä (kuva 6). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että

ehdokas

CSC-jakeet voitaisiin erillään primääriviljelmien MPE-kasvain.