Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA: n metylaatio on epigeneettisestä ilmiö tiedetään olevan tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen ihmisen syövän. Vastaava entsyymi tämä prosessi on DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1), joka säilyttää muuttuneen metylaatiokuvion kopioimalla se vanhemmalta tytär DNA säikeiden jälkeen replikaation. Poikkeava metylaatio promoottorin alueiden geenien kriittinen normaalille solun toimintoja on potentiaalisesti palautuva. Näin ollen, inaktivointi DNMT1 näyttää olevan arvokas kohde syövän kehittymisen hoitoja. Tällä hetkellä suosituin DNMT estäjät (DNMTi) ovat sytidiinianalogeja, kuten 5-atsasytidiini, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (decitabine) ja pyrimidin-2-oni ribonukleosidi (zebularine). Kolorektaalisyövässä, epigeneettiset muutokset on tärkeä rooli jokaisessa vaiheessa syövän. Näin ollen, olemme käsitelleet hypoteesia, että DNA-metyylitransferaasin estäjien voi voimistaa estäviä vaikutuksia klassisen kemoterapeuttisten aineiden, kuten oksaliplatiini ja 5-fluorourasiilin (5-FU), jota käytetään yleisesti ja peräsuolen syövän hoidossa. Täällä meidän raportti osoittaa, että DNMTi voi olla myönteisiä yhteisvaikutuksia standardin kemoterapeuttisten peräsuolen syövän hoidossa. Käyttämällä farmakologinen malleja Lääkeaineinteraktioita analyysi, olemme paljastaneet, että yhdistelmä decitabine 5-FU tai oksaliplatiini näyttää houkuttelevin vuorovaikutus (synergia), kun taas vaikutus zebularine yhdistelminä kemoterapeuttisten on kohtalainen ja se voidaan riippui geneettinen /epigeneettiset taustalla solulinjan tai toissijainen huume käyttää yhdistelmänä. Tuloksemme viittaavat siihen, että DNMTi antaa yhdessä standardin kemoterapeuttisten voisi parantaa potilaiden hoitoon peräsuolen syöpiä.

Citation: Flis S, Gnyszka A Flis K (2014) DNA metyylitransferaasi estäjät parantaa vaikutus Solunsalpaajalääkeaineet SW48 ja HT-29 peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (3): e92305. doi: 10,1371 /journal.pone.0092305

Editor: Caterina Cinti laitos Kliinisen fysiologian, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italia

vastaanotettu: 18 lokakuu 2013; Hyväksytty: 20 helmikuu 2014; Julkaistu: 27 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Flis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan no. N405 139139 National Science Center Puolan (https://www.ncn.gov.pl/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi yleisin syöpä on savuton väestö kaikkialla maailmassa. On arvioitu, että yli 600000 ihmistä kuolee siihen vuosittain maailmanlaajuisesti [1]. Se tarkoittaa, että paksusuolen ja peräsuolen syöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien. Valitettavasti CRC kehittää pitkään ilman mitään oireita; Siksi tauti kirjataan myöhemmissä vaiheissa. Yleensä riski CRC kasvaa iän ja johtuu paitsi geneettiset muutokset, joihin onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille, vaan myös ohjaa epigeneettisellä muutokset, joihin liittyy muutoksia geenien ilmentyminen malleja, jotka eivät ole riippuvaisia ​​muutoksista DNA-sekvenssin. Yksi epigeneettisiä tapahtumia johtuu DNA: n metyylitransferaaseja (DNMTs), jotka katalysoivat kovalenttisen lisäämällä metyyliryhmä on 5-asemassa sytosiini CpG luovuttajalta

S

-adenosylmethionine. Sytosiini metylaatio tapahtuu genomialuetta kutsutaan CpG-saarekkeiden ja tiedetään muuttavan kromatiinirakenteeseen johtaa geenien. Aikana peräsuolen syövän etenemistä sekä globaali genomi demetylaatio yhdistettynä selektiivinen hypermetylaatiota tuumorisuppressorien, solusyklin sääntelyviranomaisten ja proapoptoottiset geenien havaitaan [2]. Koska epigeneettiset muutokset ovat potentiaalisesti palautuvia, ne muodostavat mielenkiintoisen terapeuttisen strategian käyttöä DNMT estäjien (DNMTi).

desitabiinista ja zebularine ovat DNMT estäjiä, jotka saattavat kääntää epigeneettiset muutokset johtavat aktivoituminen vaiennettu geenien esto syöpä solujen lisääntymisen ja /tai apoptoosin indusoimiseksi [3], [4]. Molemmat aineet näyttävät olevan erittäin mielenkiintoinen ja arvokas kiinteiden tuumorien hoidossa. Desitabiinista, sytidiinianalogi, on hyväksynyt Yhdysvaltojen Food and Drug Administration (FDA) hoitoon hematologisten maligniteettien [5], kun taas zebularine verrattuna muihin syti- analogien on vakaampi, vähemmän myrkyllisiä ja voidaan suun kautta [6 ].

näyttää olevan järkevää käyttää demetyloivan aineita yhdessä kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Mielenkiintoista, rohkaisevia tuloksia saatiin yhdistelmällä decitabine ja karboplatiinin potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia [7]. Tekijät päättelivät, että decitabine yhdistää turvallisesti karboplatiinin ja että hoito aiheuttaa epigeneettiset muutokset. Toisessa vaiheessa I tutkimuksessa yhdistelmä sisplatiinin kanssa decitabine johti yksi osittainen vaste potilaalla kohdunkaulan syövän ja kaksi pienempää vastaukset: yksi potilas ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja muita potilaan kanssa kohdunkaulan syövän [8]. Huolimatta riviä näyttöä siitä, että demetyloidaan aineet saattavat parantaa syövän vastaista aktiivisuutta klassisen kemoterapeuttisten aineiden, tieto niiden käyttämiseksi kiinteitä kasvaimia on edelleen riittämätöntä, ja sitä on arvioitava edelleen.

siis testata tätä hypoteesia, CRC solulinja selviytymisen malli valittiin tutkimaan näitä vuorovaikutuksia. Avulla tätä mallia ja farmakologinen analyysi olemme suunnitelleet tutkimuksessa selvittää tulosten vuorovaikutuksen DNMT estäjiä, decitabine tai zebularine, ja klassinen syövänvastainen kemoterapia-hoidossa käytettyjen CRC kuten oksaaliplatiinista, välinen ja sisäinen DNA silloitusainetta, ja 5-fluorourasiilin, tymidylaattisyntaasin inhibiittoria. Tutkimukset vuorovaikutuksen kemoterapeuttisten aineiden ja DNMTi aineet näyttävät olevan kohtuullinen, koska kaikki nämä yhdisteet on testattu niiden sytotoksisia ominaisuuksia vastaan ​​normaaleissa soluissa [5], [9], [10] ja ne kaikki paitsi zebularine hyväksyy US FDA lääketieteelliseen käyttöön.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

Koska malli koolonkarsinoomasoluissa, HT-29 ja SW48 paksu- syöpäsolu linjat, saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), käytettiin. Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco), 2 mM glutamax (Gibco), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 250 ng /ml amphoterycin (Gibco) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, kuten 5% CO

2. Soluja inkuboitiin lääkkeiden 24, 48 ja 72 tuntia, mutta vain tulokset havaittu käytettäessä 72 h hoito esitetään niiden positiiviset voimistuvat.

Drugs

Seuraavat lääkkeet tutkittiin 5-fluorourasiili (5-FU), oksaliplatiini, zebularine ja decitabine (Sigma, St. Louis, MI, USA). Pitoisuudet huumeiden olivat alueella 100 uM. Kaikki aineet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin Hybri-Max (DMSO, Sigma) ja laimennettiin sitten median kokeita varten. Lopullinen DMSO-pitoisuus, vaikuttamatta solujen eloonjäämistä, pidettiin 0,2%. Kaikissa kokeissa, ohjaus soluja inkuboitiin DMSO.

MTT-määritystä

Määritys perustuu kykyyn elävien solujen aineenvaihdunnan vähentää keltaisen tetratsoliumsuolan violetti formatsaanituotteeksi. Tämä reaktio edellyttää aktiivista mitokondrioiden reduktaasin entsyymejä.

Soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä (1 x 10

4 solua /200 ul /kuoppa). Inkubaation jälkeen reagenssit, elatusaine poistettiin ja soluja käsiteltiin 50 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi-liuosta (MTT, Sigma) 4 tunnin ajan 37 ° C. Seuraavaksi 150 ui liukenemisen liuosta (10% natriumdodekyylisulfaattia, SDS) lisättiin ja seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Liuotettu formatsaanituote spektrofotometrisesti kvantitoitiin käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa, Power Wave XS (Bio-Tek, Winooski, VT, USA), 570 nm aallonpituudella.

Analyysi lääkeyhteisvaikutusten

Cells of SW48 ja HT-29 solulinjat samanaikaisesti inkuboitiin 72 h kemoterapia-aineiden ja DNMT estäjiä tai kunkin aineen yksinään. Luonne välisen vuorovaikutuksen huumeiden tutkittu analysoitiin avulla izobologram [11] ja yhdistelmä-indeksi (CI) menetelmät, jotka ovat peräisin mediaani-vaikutuksen periaate Chou ja Talalay [12], [13]. Saadut tiedot sytotoksisuus kokeissa käytettiin matemaattisia ja kvantitatiivinen arviointi lääkeaineinteraktioita.

isobolit määriteltiin vaikutusten pariksi huumeiden tutkittu. Vaikutukset saatu puoleen maksimaalisesta estävä pitoisuus (IC

50) kummankaan lääkkeen sisällä pari muodosti perustan summautuvat rivi; synergiasta tai antagonismi oli läsnä, kun sama vaikutus saatiin yhdistämällä lääkkeiden alempia tai korkeampia annoksia, vastaavasti.

Kaupallista ohjelmistopaketti, CalcuSyn- ver. 2.0 (Biosoft, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta), käytettiin mediaani-vaikutus analyysin. Laskimme CI arvot perustuu kaavaan: CI = (D)

1 /(D

x)

1 + (D)

2 /(D

x)

2 toisensa poissulkevia huumeita. Vuonna nimittäjä, (D

x) on D

1 ”yksin”, joka estää järjestelmän

x

%, ja (D

x)

2 on D

2 ”yksin”, joka estää järjestelmän

x

%. Vuonna osoittajat, (D)

1 + (D)

2 ”yhdistelmänä” myös estävät

x

%. Cl-arvot syntyi eri vaikutus tasoilla (Fa, osa vaikuttaa D, eli inhibitioprosentti /100) 0,05-0,95 (5-95% solukuoleman). Synergia osoitetaan CI arvojen 1, additiivisuuteen CI arvot = 1 ja antagonismi CI arvot 1.

Virtaussytometrianalyysi

solusyklianalyysiä varten soluja (~ 1 x 10

6) suspendoitiin 4 ml: aan 80% etanolia (-20 ° C) ja inkuboitiin -20 ° C: ssa 24 tuntia, pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja 100 ug /ml RNaasi 0,1% PBST-liuoksella (PBS, johon oli lisätty 0,1% Triton X-100) 30 minuutin ajan pimeässä 4 ° C: ssa. Sitten näytteet mitattiin käyttämällä BD FACSCalibure -virtaussytometriä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). DNA-histogrammit analysoitiin käyttämällä ModFit ohjelmistoa (BD Biosciences).

apoptoosia solujen mitattiin, mukaisesti valmistajan ohjeiden, käyttämällä anneksiini V-FITC Kit (BD Biosciences). Solut kerättiin käsittelyn jälkeen, pestiin kahdesti PBS: llä ja sentrifugoitiin. Solupelletti suspendoitiin uudelleen jääkylmään sitomispuskuria. Anneksiini V-FITC: llä ja PI-liuokset lisättiin solususpensioon ja sekoitettiin kevyesti. Näytteitä inkuboitiin sitten 15 min pimeässä ennen virtaussytometria-analyysi.

immunofluoresenssivärjäyksellä, solut kiinnitettiin 1,5% formaldehydillä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT) ja läpäiseviksi kylmällä metanolilla 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin halu primaarisen vasta-aineen (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) vastaan ​​fosfo-ATR [(P) -Ser428, Cat. Nro 2853] ja fosfo-ATM [(P) -Ser1981, Cat. No. 5883] 1: 100 laimennus 0,5% BSA /PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, sopivan sekundäärisen vasta-aineen konjugoituna FITC: tä (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) lisättiin 1: 500 laimennus 0,5% BSA /PBS: llä ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrillä.

kaikki sovellukset 10000 tapahtumaa näytettä kohti analysoitiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS).

Puolikvantitatiivinen RT-PCR-

mRNA-tasot on

CCNE1

,

ATM

ja

GAPDH

analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen kokonais-RNA: HT-29 ja SW48 solut eristettiin käyttämällä GenElute ™ Mammalian Kokonais-RNA Miniprep Kit (Sigma), kuten valmistaja on kuvannut. Sata ng kokonais-RNA käytettiin käänteistranskriptio reaktio Omniscript käänteistranskriptaasia (Qiagen, Hilden, Saksa) ja oligo (dT)

18 pohjamaali (Fermentas, Vilna, Liettua). PCR-monistukset suoritettiin 50 ul: n kokonaistilavuudessa mukaisesti valmistajan ohjeiden avulla HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 3 ui cDNA: ta templaattina ja seuraavia alukkeita paria:

CCNE1

(5′-AACTCAACGTGCAAGCCTCG-3 ’, 5′-CATCTCCTGAACAAGCTCCA-3’),

ATM

(5′-GCCTTGAGTCTGTGTATTCG-3 ’, 5′-CCACTCAGAGACTCCACAGC-3’) ja

GAPDH

(5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3 ’, 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’).

GAPDH

mRNA käytettiin sisäisen valvonnan. Monistetut fragmentit erotettiin 2% agaroosigeeleillä, värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-valossa.

valmistaminen proteiinin lysaateista ja Western blotting

Solut pestiin kylmällä PBS-puskurilla ja sitten proteiinien viidestä soluosastoihin eristettiin käyttäen Subsellulaariset Protein ja fraktiointi Kit Viljellyt solut (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiinipitoisuus näytteissä mitattiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Näytteet, jotka sisälsivät 60 ug proteiinia denaturoitiin ja fraktioitiin 7, 12 tai 15% SDS-PAGE. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja koetettiin anti-ihmis-spesifisiä vasta-aineita: sykliini A1 ja D1, PARP, kaspaasi-3- ja -8 (Santa Cruz Biotechnology); p21 (Cat. No. 554228), p53 (Cat. No. 610183), Bax (Cat. No. 610982, BD Biosciences); β-aktiini (Cat. No. A1978, Sigma); ja DNA Damage Vasta Sampler Kit (fosfori-Chk1 [(P) -Ser296], fosfori-Chk2 [(P) -Thr68], fosfori-histoni H2A.X [γH2A.X, (P) -Ser139], fosforia p53 [(P) -Ser15], ja fosfori-BRCA1 [(P) -Ser1524]; Cat. No. 9947; Cell Signaling Technology). Kaikki vasta DNA Damage Vasta Sampler Kit tunnistavat tavoitteensa proteiinien vasta kun muokattu ilmoitettuina sivustoja. Näin ollen, vasta-aineita modifioimatonta proteiineja ei käytetty.

Anti-Bax-vasta-aine tunnistaa ihmisen Bax-α muodossa. Vaihtoehtoinen silmukointi Bax esi-mRNA tuottaa kiinteä membraanimuodon Bax-α ja kaksi sytosolin muodot p ja γ. Tämä vasta-aine on suositeltavaa BD yhtiön havaitsemiseen apoptoosin. Anti-p53-vasta-aine tunnistaa C-terminaalisen alueen proteiinin (jäljempänä 195-393 aminohapot käytettiin antigeeni) ja pystyy tunnistamaan sekä villityypin ja R273H muotoja p53. Tämä vasta-aine on myös suositeltavaa BD yritys havaitsemiseksi apoptoosin.

Signaali blotteja havaittiin kolorimetrisellä menetelmällä käyttäen CN /DAB Substrate Kit (Pierce) ja SignalBoost Immunokemiallisen Enhancer Kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA).

Mitokondrioiden kalvon potentiaali (ΔΨ

m) mittaus

Δ

Ψ

m

mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä 10 mg /ml 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolo- carbocyanine jodidia (JC-1 väriaine, Sigma), joka värjää mitokondriot elävissä soluissa. Vuonna terveitä soluja, väriaine kerääntyy mitokondrioissa muodostavat aggregaatteja, jotka lähettävät punaista fluoresenssia, kun taas apoptoottiset solut väriaine pysyy monomeerisessä muodossa sytoplasmassa ja emittoi vihreää fluoresenssia. Soluja käsiteltiin kemoterapeuttisten aineiden, DNMT inhibiittorit tai niiden yhdistelmät 72 tuntia ja värjättiin kuten on kuvattu Mahyar-Roemer

et al.

[14], ja sitten tutkittiin FACSCalibure -virtaussytometriä. Mitokondriot sisältää punaista JC-1 aggregaatit terveissä soluissa oli havaittavissa FL2-kanavalla, kun taas vihreä JC-1 monomeerien apoptoottisia soluja havaittavissa FL1 kanavalla.

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvona arvot ± SD. Tilastollinen vertailut Blandgrupp suoritettiin Studentin t-testillä tai yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukey

post hoc

testi. Merkitys laadittaessa oletettiin

P

0,05 (merkitty tähdillä kuvaajiin).

Tulokset

Kasvu tutkimuksia ja vaikutusten yhdistelmähoidot solunsalpaajalääkeaineiden kanssa DNMTi

Koska ensimmäinen askel, tutkimme vaikutus agentit sovelletaan yksin SW48 ja HT-29 solujen elinkykyä. Soluja käsiteltiin 10-100 uM arvioidaan aineita. Tulokset MTT solujen elinkelpoisuuden määritys osoitti, että CRC-soluja inkuboitiin oksaliplatiinia ja 5-FU osoitti tehokkain solujen kasvun esto seuraavan 72 tunnin inkuboinnin aikana (kuvio 1). Estovaikutukset kemoterapeuttisten olivat annoksesta riippuvia ja korrelaatiokertoimet (arvioituna inhiboiva annos-vaste-käyrät) oli yli 0,9. Demetyloimalla aineet, decitabine ja zebularine, ovat osoittaneet eri liikennemuotojen esto: decitabine oli jo estävää alkukonsentraatio (20 uM) ja zebularine osoitti estävä vaikutus 80 ja 40 uM SW48 ja HT-29-solujen, vastaavasti.

soluja käsiteltiin yksittäin tai yhdistelminä kanssa syytteeseen annoksia tekijöille 72; 5-FU, 5-fluoriurasiili; DAC, decitabine; ja ZEB, zebularine. Jokainen piste edustaa keskiarvo ± SD (n = 5), tähdellä osoittavat merkitys on

P

0,05 verrattuna oksaliplatiinin tai 5-FU yksin.

Testasimme myös hoidon kemoterapeuttisten aineiden yhdistelmänä DNMTi CRC-solujen eloonjäämiseen (kuvio 1). Desitabiinista voimisti inhiboivia vaikutuksia oksaliplatiiniannoksella pitoisuuden 20 uM 100 uM, kun taas sen vaikutus 5-FU aktiivisuus alkaa 80 uM. Zebularine testattiin pitoisuuksilla aina 100 uM hieman voimisti estäviä vaikutuksia joko kemoterapeuttisten (kuva 1).

tyyppi lääkeyhteisvaikutusten kahden arvioitiin yhdisteen ryhmää analysoitiin avulla isobolographic ja mediaanivaikutus menetelmiä. Isobologrammit osoittavat tulokset yhden 50% vaikutusta sekä osoittaa, että vuorovaikutus decitabine kemoterapeuttisten aineiden tuloksia synergistinen vaikutus, kun taas antaminen zebularine oksaliplatiinin tai 5-FU johtaa synergistisiä tai hieman lisäaineen vaikutuksia (kuvio 2A).

. Isobologrammit at 50% vaikutus tasolla. Pitoisuudet tiettyjen lääkkeiden on merkitty x ja y-akselilla. Isobologrammit rakennettiin kytkemällä IC

50-arvot demetyloivan aineiden (ordinaatalla) IC

50 oksaliplatiinia tai 5-FU piirretään abskissana. Kun annoksina kaksi tekijöiden yhteisvaikutuksesta ovat alhaisemmat tai korkeammat kuin lisäaineen annokset, synergiaa tai antagonismia on läsnä, vastaavasti. B. Yhdistelmä indeksin arvot (CI) ja 95%: n luottamusväli kaikilla vaikutus tasoilla laskema CalcuSyn ohjelmisto. CI-arvo on selvästi alle 1 osoittaa synergiaa, CI-arvo hyvin lähellä 1 osoittaa lisäksi, ja CI huomattavasti suurempi kuin 1 osoittaa antagonismia.

Analyysi suoritetaan millä mediaanivaikutus menetelmän vahvisti, että yhdistelmä decitabine ja kemoterapeuttisten aineiden molemmissa solulinjoissa tuotetut synergiavaikutuksen 50% solukuolema tasolla (Fa = 0,5) tiukempi, CI (Combination Index) arvot 0,9 (kuvio 2B).

yhdistelmä zebularine ja kemoterapia Fa = 0,5 merkitsivät lievää synergistisiä tai additiivisia vaikutuksia.

analyysi DNA-vaurioita

Valaistaan ​​mekanismi apoptoosin olemme analysoineet fosforylaatiota aseman valkuaisaineet ovat suuria signalointi tarkistuspisteitä vastauksena DNA vaurioita.

Havaittuaan DNA-vaurio, sarja solusignalointi tapahtumia, eheys ja toimivuus solujen ja biologiset reitit ovat mukana. Proteiinit valittu testattavaksi Western blottauksella aloittaa päällekkäisiä tapahtumia, jotka estävät solusyklin etenemisen joko antaa aikaa korjata vioittuneita DNA tai aktivoida solukuolemareittejä jos liikaa vahinkoa ole aiheutunut. Fosforyloitua histoni H2A.X paikantuu kohtiin DNA-vaurioita ja aktivoi ATM /ATR-kinaasien, keskeinen välittäjiä DNA-vaurioita vastaus. Puolestaan ​​ATM /ATR-kinaasien aloittaa kaskadeja, jotka estävät etenemistä mitoosiin kautta aktivointi Chk kinaasien (Chk1 ATR ja Chk2 varten ATM) tai tuumorisuppressoriproteiinia p53, mikä johtaa joko solusyklin pysähtymiseen ja DNA: n korjaukseen tai apoptoosin kautta asetuksen p53 loppupään efektorien. BRCA1 valvojana perimän vakautta, on myös fosforyloituu ATM, ATR, ja Chk2 vastauksena DNA-vaurioita ja voivat tehdä yhteistyötä paikallistaa muiden proteiinien DNA vaurioita sivustoja [15].

Havaitsimme merkittävän fosforylaatiota histoni H2A.X at Ser139 vastauksena kemoterapia-aineiden ja niiden yhdistelmien kanssa DNMTi, erityisesti HT-29-soluja. Alempien γH2A.X (fosfo-H2A.X) havaittiin soluissa, joita käsiteltiin DNMTi aineilla vain. Havaitsimme myös kohonneet proteiinien fosforylaatio, kuten ATR at Ser428, ATM Ser1981, p53 Ser15, BRCA1 on Ser1524 sekä kinaasien Chk1 ja Chk2 at Ser345 ja Thr68, vastaavasti (kuvio 3A ja B). Fosforylaatiotilaa kinaasien Chk1 ja Chk2 oli huomattavampi HT-29 sitten SW48 soluissa. Vuonna SW48 soluissa, fosforylaation tasoja Chk1 ja Chk2 kinaasien oli korkeampi, kun yhdistetyn hoidon oxaliplain ja decitabine verrattuna hoitoon sekä kemoterapeuttisten aineiden ja DNMTi soveltaa yksittäin (kuvio 3B).

. Kvantitointi ATR ja ATM fosforylaation tasolla seuraavat 72 (MFI) käytettiin. Data edustaa keskiarvoa ± SD (n = 3). Merkittävää eroa

P

≤0.05 on merkitty tähdellä (*). B. Analyysi proteiinin fosforylaation tasoa käyttäen Western blotting menetelmällä. Havaitseminen β-aktiini käytettiin geelilatauspuskuria ohjaus. Oksa, oksaliplatiini; 5-FU, 5-fluoriurasiili; DAC, decitabine; ZEB, zebularine; au, mielivaltaisia ​​yksiköitä.

yhdistelmät kemoterapia-aineiden DNMTi vaikuttaa solusyklin etenemisen ja apoptoosin

kontrolliviljelmässä, solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin oli vakaa, kun taas testatuista yhdisteistä oli erilaisia ​​vaikutuksia solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Hoito kemoterapia-johti johdonmukainen lisääntyminen solujen S-vaiheeseen kustannuksella G1 vaiheessa. Desitabiinista pidätettiin solusyklin G2 /M tai S vaihe SW48 ja HT-29-solujen, vastaavasti. Zebularine ei aiheuttanut tilastollisesti merkittäviä muutoksia sekä solulinjoissa, verrattuna kontrolleihin.

Yhdistelmä decitabine oksaliplatiinin tai 5-FU indusoi solukierron pysähtymisen S /G2 /M vaiheessa rajan ja S-vaihe, vastaavasti, sekä solulinjoissa (kuvio 4). Yhdistelmä zebularine oksaliplatiini lisääntynyt prosenttiosuus HT-29-soluja S /G2 /M-faasin rajan, kun taas yhdistelmä zebularine 5-FU lisääntynyt prosenttiosuus näiden solujen S-vaiheessa 12%: sta 36% verrattuna ohjaus. Siinä tapauksessa SW48 solujen yhdistelmät zebularine kanssa kemoterapeuttisten aineiden aiheuttama pidätyksen solujen G2 /M tai S-vaiheeseen (kuvio 4A).

. Muutokset solusyklin jakautumista SW48 ja HT-29-soluissa, sen jälkeen 72 h hoidon arvioitiin aineita. Solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin käyttäen ModFit LT ™ (versio 3.0). Kukin pylväs esittää keskimääräistä ± S.D. (N≥4). Merkittävää eroa

P

0,05, on merkitty tähdellä (*). B. Analyysi

CCNE1

ja

ATM

-mRNA-tasojen semikvantitatiivinen RT-PCR-menetelmällä sen jälkeen, kun 72 tunnin inkuboinnin CRC solujen solunsalpaajilla DNMTi ja niiden yhdistelmät pitoisuuksina kuin ilmoitettu. M, merkki [kp];

GAPDH

, transkriptio koodaus glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, joka on konstitutiivisesti geenin, käytettiin sisäisenä kontrollina. C. Western blotting-analyysi solusyklin säätelyproteiineja. Β-aktiini käytettiin geelilatauspuskuria ohjaus. Oksa, oksaliplatiini; 5-FU, 5-fluoriurasiili; DAC, decitabine; ZEB, zebularine.

analyysi geenien ilmentymistä paljasti, että yhdistelmä decitabine oksaliplatiini, verrattuna oksaliplatiini yksin, lisääntynyt mRNA taso

ATM

molemmissa solulinjoissa sekä kuten

CCNE1

in SW48 solulinjassa (kuva 4B). Yhdistelmät demetyloimalla aineiden kanssa 5-FU oli samanlainen suuntaus, mutta alemmalla tasolla kuin yhdistelmät oksaliplatiinin. Analyysi proteiinien spesifinen solusyklin etenemisen paljasti, että yhdistelmä DNMTi kanssa kemoterapeuttisten verrattuna oksaliplatiini /5-FU yksin, lisääntynyt taso sykliini A1 ja proteiinia p53 ja vähensi taso sykliini D1 (mutta ei SW48 -solut) (kuvio 4C ja 5B). Yhdistelmä zebularine kanssa kemoterapeuttisten lisääntynyt taso p21 SW48 soluissa (kuvio 4C).

. Havaitseminen apoptoosin anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) /porpidium jodidia (PI) analyysi. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. (N≥4). Tähdellä (*) osoittaa, että apoptoosin induktio, joita arvioidaan aineet oli merkittävä verrattuna yhdistelmä kemoterapia-aineiden ja DNMT estäjät

vs.

kemoterapia-aineita, joita käytetään yksinään (

P

0,05 ). B. Western blotting-analyysi pro-apoptoottisen proteiinin tason. Β-aktiini käytettiin geelilatauspuskuria ohjaus. C. edustaja sytogrammeja virtaussytometrian kokeet osoittavat muutokset Δ

Ψ

m

CRC soluissa linjat 72 tunnin kuluttua inkubaation kemoterapia-aineiden, DNMT inhibiittorit ja niiden yhdistelmät. Solut värjättiin JC-1. Solut R2 neljänneksessä laskettiin soluiksi riistää mitokondrion kalvon potentiaalia. Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa koeryhmään ja kontrolliryhmään osoitteessa

P

0,05. Oksa, oksaliplatiini; 5-FU, 5-fluoriurasiili; DAC, decitabine; ZEB, zebularine.

Koska pitkäaikainen hoito kemoterapeuttisten tai DNMTi saattavat aiheuttaa solukuoleman, varhainen apoptoottinen markkeri oli siis analysoitiin. Tätä varten käytimme anneksiini V, joka tunnistaa fosfatidyyliseriini (PS). Aikana apoptoosin induktion, kalvo epäsymmetria on menetetty ja translokaatiota PS solunsisäisen ulkoisiin seloste solukalvon tapahtuu. Kuten odotimme, hoitoon CRC solujen oksaliplatiinin tai 5-FU yksin aiheutti apoptoosia -30% soluista, kun taas yhdistelmät arvioitiin aineilla on yleensä määrä kasvoi apoptoottisten solujen ~45%: sta 60% (kuvio 5A ) lukuun ottamatta HT-29-solujen inkuboitu demetyloivan aineiden ja oksaliplatiini yhdessä. Tällöin apoptoosin oli alemmalla tasolla kuin muut yhdistelmät, mutta silti tilastollisesti merkitsevä verrattuna oksaliplatiinin soveltaa yksin. Lisäksi, apoptoosin induktion, että CRC-soluissa yhdistelmä kemoterapia-aineiden demetyloivan aineiden vahvisti muutoksia proteiinin tason pro-kaspaasi-3 ja -8. Proteolyyttisen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) täydennettiin inkuboinnin jälkeen solujen kemoterapeuttisten aineiden ja demetyloidaan aineet (kuvio 5B).

muutokset mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m)

Vuoden alussa apoptoosin häiriöitä mitokondrion kalvon potentiaalia Δ

Ψ

m

saattaa esiintyä johtaen nopeaan romahtamiseen sähkökemiallisen gradientin. Tässä työssä selvitimme vaikutus DNMTi, kemoterapeuttisten tai niiden yhdistelmiä Δ

Ψ

m

värjäämällä solut JC-1 väriaine. Analyysi sytogrammeja osoittavat valvonnan solut emittoiman punaisen fluoresenssin johtuen korkeasta Δ

Ψ

m

, kun taas solut, joita käsiteltiin kemoterapeuttisten ja DNMTi aineet ilmeni kohonneita kalvo Depolarisaatio, havaita vihreän fluoresenssin, ja vaikutus säilyi (oksaliplatiini + DNMTi HT-29 solulinja) tai vahvempia soluja yhteistyössä inkuboitiin näiden yhdisteiden (kuvio 5C).

keskustelu

90-luvulla se on vahvistettu että CRC tulokset paitsi kertymistä geneettisten mutaatioiden, vaan myös seurauksena epigeneettisten korjauksilla solun genomiin, joka muuntaa normaalin rauhasepiteelin osaksi adenokarsinooma. Se on vakiintunut, että laajimmin tunnettu epigeneettiset muutos CRC on geeni promoottori hypermetylaation, jota esiintyy CpG saarilla, jotka ovat usein läsnä 5 ’alueella noin 60% geeneistä. Tämä ilmiö johtuu lisääntyneestä aktiivisuudesta DNMT entsyymin, jonka yli-ilmentyminen on ominaista lähes kaikki transformoidut solut [16]. Kasvava määrä geenejä, jotka ilmentyvät paksusuolessa on nyt osoitettu olevan hypermetyloitunut ja vaientaa kolorektaalisyövässä. Näitä ovat geenit osallistuvat solusyklin kontrolli, kasvu, erilaistuminen, angiogeneesi, adheesio, metastaasi tai DNA: n korjaukseen [17]. Koska epigeneettiset muutokset ovat potentiaalisesti palautuvia, ajatus oli syntynyt, että työllistymistä DNMT estäjät saattavat parantaa hoitoa CRC, varsinkin kun klassinen kemoterapeuttisia aineita ovat rajalliset tehokkuuden peräsuolen syövän hoidossa. Siksi kehittää joitakin uusia strategioita hoitoon tällaisen kasvaimia on haaste onkologian [18]. Siksi olemme esittäneet tuloksia

in vitro

tutkimus yhteisvaikutuksista standardin sytotoksisten lääkkeiden, 5-FU: hun ja oksaliplatiinia [19], jossa DNA metyylitransferaasin estäjien (DNMTi) kuten decitabine ja zebularine.

DNMTis ovat viime aikoina saaneet paljon huomiota aineina estämällä syövän kasvua myös kolorektaalisyöpää [20]. Kuitenkin rooli niiden terapeuttista potentiaalia voidaan kunnolla arvioida vain yhdessä klassista käytetyt aineet CRC hoidossa, koska kaikki uudet terapeuttiset aineet käyttöön lisäosa vaihtoehtoja. Koska 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia muodostavat selkärangan hoidossa CRC [19], tutkimme vaikutuksia CRC soluissa selviytymisen lisäämällä decitabine tai zebularine – DNA metyylitransferaasi inhibiittorit – näihin kemoterapeuttisia.

Olemme varmistaneet alle

in vitro

olosuhteissa, että tutkittu aineet annetaan yksinään kykenevät indusoimaan kasvun inhibitio syöpäsolut vertailukelpoisia tehokkaiksi laskettu prosenttiosuus solujen eloonjääminen (kuvio 1). Lisäksi olemme havainneet, lisääntynyt esto CRC-solujen kasvua, kun hoidon syövän vastaisia ​​aineita käytetään yhdistelmänä (kuvio 1). Isobologrammit, rakennettu pohjalta IC

50-arvot, merkitty synergistisiä tai additiivisia vuorovaikutuksia kemoterapeuttisten ja DNMTi aineita. Desitabiinista oli suotuisinta vuorovaikutukset (synergia) yhdessä kemoterapeuttisten molemmissa solulinjoissa; kun taas vuorovaikutus analyysi zebularine osoitti kohtalainen synergistisiä tai additiivisia vaikutuksia ja parhaat tulokset saavutettiin yhdessä oksaliplatiinin (kuva 2).

havaituista molempien DNMTi aineiden ja kemoterapeuttisten olivat annoksesta ja solulinjan riippuvaista.