Krooninen sairaus

tiivistelmä

Urokinaasimääritys plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) on tärkeä rooli syövän etenemistä ja on ehdotettu kohteena syövän hoitoon. Olemme hiljattain kuvattu kehittää uusia humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine, joka on kohdistettu uPAR ja on tuumorin vastaista aktiivisuutta useissa ksenograftin eläinten kasvainmalleissa. Tämä vasta-aine, ATN-658, ei estä ligandin sitoutumisen (eli uPA ja vitronektiini) ja uPAR ja sen toimintamekanismi on edelleen epäselvä. Ensimmäisessä vaiheessa ymmärtämään antituumorivaikutuksen ATN-658, ryhdyimme tunnistamaan epitooppiin uPAR johon ATN-658 sitoutuu. Opastetut vertailuja kädellisen ja ihmisen uPAR epitooppikartoitus suoritettiin käyttäen useita ortogonaalisia tekniikoita. Systemaattinen sivusto suunnattu ja alaniiniskandeerausmutageneesiä tunnistettu alueella aa 268-275 of uPAR kuin epitooppi ATN-658. Ei tiedossa toiminto on aiemmin katsottu johtuvan tähän epitooppiin rakenne- oivalluksia epitoopin tunnistamisen saatiin rakenteellisiin tutkimuksiin Fab ATN-658 sidottu uPAR. Rakenne osoittaa, että ATN-658 sitoutuu DIII verkkotunnuksen uPAR, lähellä C-päähän reseptorin, joka vahvistaa epitooppikartoitus tuloksia. Kiehtovan, kun sidottu uPAR, komplementaarisuuden määrittävä alue (CDR) alueet ATN-658 tiiviisti matkivat sitovat alueet integriini CD11b (mikrometriä), joka on aiemmin tunnistettu uPAR ligandia ajatellaan olevan osallisena valkosolujen liikkuvan, muuttoliike ja täydentää kiinnityksen ei tiedetä osassa kasvaimen etenemistä kiinteitä kasvaimia. Nämä tutkimukset paljastavat uuden funktionaalisen epitoopin uPAR osallistuvat kasvaimen etenemiseen ja osoittaa aiemmin tunnistamattomia strategia terapeuttisen kohdentamista uPAR.

Citation: Xu X, Cai Y, Wei Y, Lahjoita F, Juarez J, Parry G, et ai. (2014) Identification of a Uusi epitoopin uPAR tavoitteeksi varten Cancer terapeuttinen monoklonaalinen vasta-aine ATN-658, joka on rakenne- homologi uPAR Binding Integriinin CD11b (mikrometriä). PLoS ONE 9 (1): e85349. doi: 10,1371 /journal.pone.0085349

Editor: Francesco Bertolini, European Institute of Oncology, Italia

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 04 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia NIH (HL086584) MH, NCI (CA125564), Harold Chapman (YW) ja (CA151461) ja (TVO ja APM) sekä sekä H Foundation ja Lynn Sage Breast Cancer Foundation (APM). Tätä työtä tukivat palveluja tuumoribiologiassa Core (TBC) Northwestern University, joka hyötyy filantrooppinen tukea Robert H. Lurie Cancer Center ja kemian elintoimintoihin Institute. X-ray Tämän tutkimuksen aineisto mitattiin beamline × 29 National Synchrotron Light Source ja APS SER-CAT beamline 22ID. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Fernando Lahjoita, Jose Juarez, Graham Parry ja Andrew P. Mazar työskenteli Attenuon aikaan tutkimuksen. Andrew Mazar ja Thomas O’Halloranille on pääomaosuuksia ja Andrew Mazar vastaanottaa Konsultointipalkkiot päässä Tactic Pharma, start-up yritys, joka nyt omistaa oikeudet ATN-658. Andrew Mazar on keksijä on myönnetty patentti ATN-658. Useat US-patentit ovat antaneet kattavat ATN-658 sekä epitoopin. Nämä patentit ovat USA # 8101726 ”ligandit sitovat kompleksin urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja sen reseptorin (uPAR), jotka estävät alavirtaan uPAR yhteisvaikutuksia: tunnistaminen ja käyttö diagnosoinnissa tai terapiassa” (Parry ja Mazar) ja USA # 8105602 ”Urokinase plasminogeeniaktivaattorin reseptorin epitooppiin, monoklonaalisia vasta-aineita niistä johdettujen ja menetelmiä niiden käyttöön ”(Parry ja Mazar). Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

etäpesäke ja angiogeneesiä runsaasti yhteisiä fenotyypin ominaisuuksia jotka johtavat hyökkäys ja migraation kasvaimen ja endoteelisolujen. Näitä ovat säätely ylöspäin proteaasin ja integriinin ekspressioon, menetys solu-solu- ja solu-matriisi yhteydet, kasvu reagoida kasvua ja erilaistumista tekijät, ja remodeling soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvon (BM) [ ,,,0],1], [2]. Urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) järjestelmä, joka koostuu uPA, tietyn solun pinnan reseptorin uPA (uPAR), ja serpin inhibiittorit uPA kuten plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1 (PAI-1), on keskeinen merkitys monissa näistä toiminta [3] – [6]. Aktiivisuus tämä järjestelmä on vastuussa aloittamista kaskadissa, joka johtaa siihen, että plasminogeenin aktivoimiseksi ja useita pro-metalloproteaasien (proMMPs) [7], [8], vapautumista ja käsittely piilevän kasvutekijöiden talletetaan ECM, kuten FGF-2, VEGF, HGF, ja TGF-β [9] – [12] ja remodeling komponentit ECM kuten vitronektiinin ja fibronektiini [13], [14]. Nämä toimet ovat yleensä välittämän proteolyyttisen toiminnan uPA sitoutuneina uPAR, voidaan moduloida estämällä uPA PAI-1, ja esiintyy solun ulkopuolelle. Lisäksi uPAR on vuorovaikutuksessa myös monien muiden ligandien lisäksi uPA myös useita integriinit, kuten α5β

1, α3β

1, ja α5β

3 [15] – [17], sekä muut solun pinta ja ECM-ligandit, mukaan lukien vitronektiiniin ja G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien [6]. Useat näistä yhteisvaikutuksista on osoitettu olevan tärkeä kasvainsolujen eloonjäämisen, invaasio ja angiogeneesi [6], ja niihin liittyy uPAR-riippuvaisen signaloinnin.

Näistä syistä, uPAR on ehdotettu terapeuttinen tavoite syövän hoidossa. Kuitenkin, vaikka on runsaasti kirjallisuutta, joka osoittaa, että on tärkeää uPAR etenemisen useimmat kiinteiden syöpien, mukaan lukien rinta- [18], paksusuolen [19], eturauhassyöpä [20], haiman [21], munasarjasyöpä [22], keuhkosyöpä [23] , ja aivot [24] sekä useita hematologisia syöpiä kuten akuutti leukemia ja myelooma [25], ei uPAR kohdennettua terapeuttista ainetta on kehitetty tai arvioitu syövän kliinisissä kokeissa tasalla. Useita vasta-aineita, jotka suoraan inhiboivat uPA uPAR on ehdotettu ja testattu prekliinisissä tutkimuksissa, mutta useimmat näistä ovat ainoastaan ​​osoittaneet vaatimaton antituumorivaikutus, ja sen vuoksi ei ole koskaan kehittynyt klinikalle.

Äskettäin olemme määritelleet ja kehittäneet uuden uPAR suunnattu monoklonaalinen vasta-aine, joka osoittaa vahvaa antituumorivaikutukset useissa eri eläinten kasvainten mallit, mutta ei estä sitoutumista uPA uPAR [22], [26] – [28]. Tämä vasta-aine, ATN-658, on useita ainutlaatuisia ominaisuuksia, jotka erottavat sen edellisistä uPAR kohdennettuja lähestymistapoja. Keskeistä on, että ATN-658 on, että se ei estä uPA sitoutumista uPAR ja pystyy sitoutumaan uPAR, vaikka se on miehitetty uPA, mutta silti estää maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

[22] , [27]. ATN-658 ei ole vaikutusta uPA välittämä plasminogeeniaktivaatioprosessille mutta siinä on useita vaikutuksia signalointipolkujen ja ilmentymistä eri geenien osallistuvat kasvaimen etenemisen kun arvioidaan malleja eturauhas- ja munasarjasyöpä

in vitro

ja

in vivo

[22], [27]. Yksi silmiinpistävä havaintojen ATN-658 on, että farmakologinen kohdentaminen uPAR tämän vasta-johtaa vankka antituumorivaikutukset monilla kiinteän -tuumoriksenografti mallit [22], [26] – [28]. Kasvaintenvastainen vaikutuksia on havaittu riippumatta kasvainhistologiaa näissä malleissa ja lisäksi eston etäpesäkkeiden

in vivo

, kuten voidaan ennustaa varten uPAR kohdennettuja agentti, ATN-658 pystyy myös estää kasvaimen proliferaatiota ja indusoi apoptoosin [22], [26], [28]. Kuitenkin rakenteellinen ja mekanistinen perustan näille antituumorivaikutukset ovat edelleen epäselviä.

Jotta Tämän ongelman me tunnettu epitooppiin uPAR johon ATN-658 sitoutuu. Epitooppi ATN-658 oli aluksi kartoitettiin käyttämällä kohdennettua mutageneesiä ja vahvistettu uusi deuteriumilla vaihto massaspektrometria tekniikkaa (H /D-vaihto massaspektrometria, ExSAR). Tämä epitooppi määritettiin olevan epitoopin, joka ei ole toimintoa uPAR on kuvattu aikaisemmin. Lisäksi määritimme kiderakenteet ATN-658 Fab yksin ja monimutkainen uPAR, aminoterminaalisen (uPAR sitova alue) uPA (ATF), ja somatomedin B domain (SMB) ja vitronektiinin. ATN-658 Fab sitoutuu DIII on uPAR, sopusoinnussa epitooppikartoituksessa tuloksia. Epitooppiin uPAR ATN-658 on lähellä C-päätä, eikä sillä ole päällekkäisyyttä urokinaasin ja vitronektiini sitoutumiskohdista. Tutkimus paljasti myös rakenteellisia homologiaa ATN-658 CDRsilmukoiden ja uPAR sitova alue integriinin mikrometriä. Lisäksi osoitimme, että ATN-658 sitova estää yhdistyksen toisen integriini, α5β1, että uPAR ja siten heikentää integriini α5β1 välittämää adheesiota soluväliaineen. Nämä tulokset viittaavat siihen, aikaisemmin tuntematon mekanismi, jolla uPAR voivat toimia kasvaimen etenemiseen ja uusi epitooppi terapeuttiseen kohdentamista tämän reseptorin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen tuumorin linjat PC-3 (eturauhanen adenokarsinooma), HeLa (kohdunkaulan syöpä), ja ihmisen keuhkosyövän solulinjassa H1299 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Molemmat solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioitu vähintään Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä-streptomysiiniä. Hiiren kasvainsolulinjasta B-16 (melanooma), koira osteosarkooma (D-17) ja ikuisti Afrikkalainen vihreä apina (AGM) munuaissolut (COS-1) todennettiin ilmaista uPAR RT-PCR ja western blot käyttäen kaniinin polyklonaalista uPAR antiseerumia (rD2D3) tiedetään rajat reagoida uPAR useista lajeista kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. uPAR ilmentäviä soluja käytettiin sitten arvioitaessa kykyä ATN-658 rajat reagoida erilaisten ei-ihmisen uPAR. Sekä liukoista yhdistelmä-uPAR (Supar, tähteet 1-277) ja ATF (aminohappotähteet 1-143 uPA) on tuotettu Drosophila S2 soluissa, kuten erittyvien proteiinien

E. coli

[31].

karakterisointi monoklonaalinen vasta ATN-658

ATN-658 nostettiin vastaan ​​kymotryptinen fragmentti liukoisen uPAR (Supar) käsittää DIIDIII (aa 88-283 kypsien uPAR) ilmaistuna

Drosophila

S2-soluja, käyttäen tavanomaisia ​​tekniikoita. Lyhyesti, Balb /c-hiiret immunisoitiin suPARDIIDIII fragmentit konjugoidaan KLH: hon ja suuruus immuunivasteen seurattiin ELISA: lla. Näiden tietojen perusteella, hybridoomia tuotettiin fuusioimalla pernasolut kanssa myeloomasolulinjan P3x63Ag8.653. Jäädytetyt varastot 10 vanhempien hybridoomien tehtiin viisi ja puhdistettiin, kuten on kuvattu [30]. SMB domeenin proteiinia (aminohappotähteet 1-50 ihmisen vitronektiinin) oli ystävällinen lahja Dr. Aiwu Zhou, ilmaistuna hybridoomien suoritettiin rajoittavan laimennuksen. Kudosviljelysupcrnatanteista näistä monoklonaalisista vasta-aineista analysoitiin sitten aktiivisuus ELISA-määritysten ja isotyypin vasta-aineen kukin määritetään IsoStrips (Roche) .ATN-658, isotyyppi IgG1κ, sidottu Supar immobilisoitu muovista, K

D ~ 1 nM ja Jodipitoiset ATN-658 spesifisesti sitoutuneet uPAR pinnalla HeLa-solujen kanssa K

D -5 nM. Kd ATN-658 Supar vahvistettiin myös käyttäen pintaplasmoniresonanssi (BIAcore). Western blot-analyysi osoitti, että ATN-658 oli spesifinen ihmisen uPAR ja eivät ristireagoi hiiren uPAR. ATN-658 puhdistettiin kudosviljelysupernatantista pylväskromatografialla käyttäen proteiini-A-Sepharose, tyypillinen saannot vaihtelivat 60-120 mg /l kudosviljelysupernatantista ja puhtaus lopullisen materiaalin oli 95% HPLC: llä määritettynä. Biotiini-ATN-658 valmistettiin kokosolu-sitoutumismääritykset ja virtaussytometriaa, kuten aiemmin on kuvattu [27].

valmistaminen ATN-658 Fab-fragmentit

ATN-658 Fab-fragmentit valmistettiin laaja proteolyyttisen digestion puhdistettua vasta-ainetta (5 h, 37 ° C), jossa immobilisoitu papaiini (Pierce). ATN-658 Fab-fragmentit erotettiin vasta-aineen Fc-domeeneja, proteiini-A-affiniteettikromatografialla ja puhdistettu Fab-fragmenttien tunnettu siitä, SDS-PAGE: lla. Sen vahvistamiseksi, että puhdistettu ATN-658 Fab-fragmentit säilyttivät kyvyn sitoa uPAR suurella affiniteetilla suoritimme kompetitiomäärityksin käyttämällä biotinyloitua ATN-658 [27] ja immobilisoitua Supar. Proteiini konsentroitiin 5 mg /ml käyttäen Millipore Ultrafree sentrifugisuodattimet proteiinin kiteytyminen.

arviointi sitoutumisen ATN-658 soluihin in vitro

lajikohtaisuus ATN-658 sitoutuminen oli arvioitiin koko solun sitoutumismääritykset tai virtaussytometrialla, kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Koko solun sitoutumisen määritykset suoritettiin solujen (300000 /kuoppa) maljattiin gelatiinilla päällystetty 12-kuoppalevyille (Costar # 3516) ja annettiin kiinnittyä yön yli. Perusteellisen pesemisen jälkeen Hankin puskuroidulla suolaliuoksella (HBSS; Invitrogen, Inc.), joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA; Sigma) tarttuneet solut inkuboitiin vaihtelevilla biotiini-leimattua ATN-658 HBSS: /0,1% BSA: ta 1 h huoneen lämpötilassa. Kun oli pesty 3 kertaa HBSS: llä /0,1% BSA-soluja inkuboitiin HRP-konjugoitua streptavidiinia vielä 0,5 tuntia huoneenlämpötilassa, kuopat pestiin, kuten yllä on kuvattu, ja sitoutunut vasta-aine havaittiin inkuboimalla OPD-substraattia (Sigma). Jälkeen värin kehittyminen 0,1 ml substraattia siirrettiin kustakin kuopasta 96-kuoppaisen levyn, reaktio pysäytettiin lisäämällä 20 ui 1mH

2SO

4, ja absorbanssi OD-490 nm tallennettu. Ennen virtaussytometria tarttuneet solut kerättiin trypsiinillä ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin (2% naudan sikiön seerumia PBS: ssä). -Soluja (2 x 10

6 solua 200 ui FACS-puskuria) inkuboitiin ATN-658 (lopullinen konsentraatio 10 ug /ml), ohjaus hiiren IgG, kanin polyklonaalinen vasta-aine (1:100 laimennos) nostatettu fragmentti ihmisen uPAR (rDIIDIII) tai normaali kanin seerumi (NRS) 1 h ajan 4 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kolme kertaa 1 ml: lla FACS-puskurilla ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan FACS-puskuria, joka sisälsi joko vuohen anti-kani tai vuohi-anti-hiiri-Alexa Fluor 488 konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Invitrogen, Inc.) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut pestiin kuten edellä on kuvattu ja suspendoidaan uudelleen 0,5 ml: aan FACS-puskuria ennen hankintaa virtaussytometrialla tietoja.

mutageneesiä tutkimukset ATN-658 sitova kädellisiin uPAR

Afrikkalainen vihreän apinan ( AGM) Supar kloonattiin COS-1-soluihin PCR, sekvensoitiin, ja ilmennetty proteiini kuten aikaisemmin on kuvattu ihmisen Supar [30], [32]. Kohdennettu mutageneesi, että AGM Supar plasmidia templaattina suoritettiin käyttäen Quikchange mutageneesi (Stratagene, Inc.), mukaisesti valmistajan ohjeiden, tuottaa yhdeksän mutantteja, jossa kukin aminohappo ainutlaatuinen AGM Supar korvattiin vastaavalla ihmisen Supar sekvenssin. Sekvensointi ja restriktiodigestion ja kunkin mutatoidun plasmidia käytettiin sekvenssin vahvistamiseksi muutos, ja että jäljellä oleva sekvenssi säilyi ennallaan. AGM-mutantti Supar cDNA subkloonattiin sitten Drosophila-ekspressiovektoriin (pMT /BiP /V5-HisA), joka sisältää V5-epitoopin lippu ja käytetään transfektoimaan S2-soluihin. Pienimuotoinen (500 ml) ravistin viljelmät perustettiin tuottamaan proteiinia kokeisiin ja proteiinin ilmentyminen vahvistettiin Western blot käyttämällä pAb [29] vastaan ​​uPAR että rajat reagoi kädellinen Supar. Viljelysupernatantit (CS) kunkin kloonin kirkastettiin sentrifugoimalla ja alikvootteja immuuni-saostettiin käyttämällä ATN-658 ja proteiini-G Sepharosea. Sitoutuneet proteiinit havaittiin Western blot käyttäen ristireagoiville kanin anti-DIIDIII polyklonaalista vasta-ainetta on kuvattu edellä. Toinen uPAR MAb, ATN-615, joka on myös lajispesifisiä ihmisen uPAR ja joiden epitooppi on jo tunnettu röntgenkristallografialla tutkimuksia [33], [34], käytettiin kontrollina vahvistaa tämän IP-menetelmällä.

Vaihtoehtoisesti viljelysupernatantit analysoitiin ELISA käyttämällä anti-V5-vasta-aineen ja biotinyloitua anti-uPAR-vasta ATN-658 ja ATN-617. ATN-617 [27] on monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu eri epitooppiin uPAR ja reagoi ristiin AGM Supar. Levyt päällystettiin V5-aineella (1 mg /ml) PBS: ssä (100 ui kuoppa 96 hyvin EIA /RIA korkea sidelaattaa). 3 tunnin kuluttua inkuboinnin huoneenlämpötilassa, kuopat pestiin ja inkuboitiin sitten 1 x kaseiinia /vettä (200 ul /kuoppa) 2 h RT: ssa estää ei-spesifinen sitoutuminen. Kuopat pestiin ja 100 ui supernatanttia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin O /N 4 ° C: ssa. Viljelysupernatanteista arvioitiin sisältävän ~ 3 ug /ml Supar. Biotiini ATN-658 tai biotiini-ATN-617 (1 ug /ml) lisättiin sitten kuoppiin ja inkuboidaan vielä 0,5 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen pesun. Lopuksi, streptavidiini-HRP lisättiin ja sen jälkeen, kun inkubointi ja pesu, väri kehitettiin käyttämällä OPD ja sitoutuneen ATN-658 on sidottu tai ATN-617 havaittiin absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä, kuten aiemmin on kuvattu [27].

epitooppikartoitus ATN-658 H /D-vaihdon massaspektrometriaa (H /D-Ex) B

1,5 mg ATN-658 Fab-fragmentti immobilisoitiin 200 mg POROS AL hartsia (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeita. Pull-down kokeet tehtiin käyttämällä Supar-DIIDIII spesifisyyden varmistamiseksi ja sitomiskyky affiniteettikolonniin. ATN-658 Fab konjugoituja helmiä (353 ui) suspendoitiin uudelleen 700 ul: aan deuteroitua fosfaattipuskuria (50 mM KH

2PO

4, 50 mM NaCl, pH 7,4) ja annettiin tasapainottua 4 ° C.suPAR- DIIDIII uudelleensuspendoitiin 40 ui D 2O, pH 7,4 (Cambridge Isotopes) joko 150, 500, 1500 tai 5000 sekuntia, jotta täydellinen deuterointikohdaksi pinta amidit. Leimattu Supar-DIIDIII ja affiniteetti hartsia sekoitettiin sitten yhdessä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Takaisin vaihto liuotinta alttiina amidien suoritettiin korvaamalla

2 H fosfaattipuskuria H

2O ja inkuboimalla 4 ° C: ssa yhtä suuri merkintöjä vaiheeseen. Verrokkikoe suoritettiin sitomalla leimaamatonta Supar-DIIDIII ja ATN-658 Fab konjugoituja helmiä ja merkinnät sitoutunut materiaali inkuboimalla 700 ui deuteroitua fosfaattipuskurissa ajat yllä. Takaisin vaihto Sitten suoritettiin, kuten on kuvattu. Reaktiot pysäytettiin ja Supar-DIIDIII eluoitu affiniteettipylväästä käyttäen 40 ui 0,8%: ista muurahaishappoa. Sen jälkeen kun lisätty 20 ui 8 M ureaa, 1 M TCEP, pH 3,0 eluoitunut materiaali ruiskutettiin Vety /deuterium Exchange spektrometria (H /D-Ex) alustan (ExSAR, Monmouth Junction, NJ), joka koostuu tandem immobilisoitua pepsiiniä ja C18 erotuspylväät. Pilkotut fragmentit erotettiin ja analysoitiin massaspektrometrialla ja identiteetit jokaisen piikin tunnistaa vertaamalla saatuja tietoja ohjaus kokeita käyttäen deuterium-leimattua ja leimaamatonta Supar-DIIDIII hajotettiin pepsiinillä.

Proteiinin kiteytyminen ja röntgen tiedonkeruu

Supar-ATF kompleksi muodostettiin inkuboimalla ATF kanssa Supar huoneenlämpötilassa 50 mM HEPES ja 100 mM NaCl, pH 7,4, ja puhdistettiin Superdex 75 geelisuodatuspylvästä. Eluoitu kompleksi lisättiin sitten ylimäärä ATN-658 Fab, ja kolmen komponentin kompleksin ATN-658-uPAR-ATF puhdistettiin jälleen Superdex 200 geelisuodatuspylvästä. Ennen kiteytystä, SMB lisättiin kolmen komponentin kompleksin klo 02:01 moolisuhteessa, ja konsentroitiin sitten 10 mg /ml ilman lisäpuhdistusta. Kiteytys suoritettiin käyttäen istuva pisara -hyörydiffusiomenetelmää 22 ° C: ssa. Diffraktoivat laatu ATN-658 Fab kiteitä luotiin käyttäen 20-22% PEG 3350, 0,1 M Tris pH 8,0-8,5. Kiteytykseen ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvaternaarinen monimutkainen, proteiinia 10 mg /ml, sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa säiliön, joka sisälsi 0,1 M HEPES, pH 7,5, 55% (v /v) Tacsimate, ja 2 % (v /v) 2-metyyli-1,3-propaanidioli. Triangle kiteet tyypillisesti ilmestyi parin kuukauden ja kasvoi lopulliseen koko 0,15 x 0,15 x 0,15 mm

3.

ATN-658 Fab kiteet kryosuojattiin lisäämällä 20% glyserolia emäliuokseen. Diffraktio kerättiin 100 ° K: Advanced Photon Sources (beamline 22-ID, SER-CAT) .X Röntgensädediffraktiomittaus tiedonkeruuta kompleksin suoritettiin 100 K annetun NSLS Brookhaven National Laboratory (beam line × 29 ). Useimmat ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvaternaarinen kiteet taipuneen hyvin heikosti, yleensä alle 6 Å. Tämä johtuu oletettavasti suuri liuotinpitoisuus (76% liuotinta), ja kun läsnä on pitkä akseli kiteiden (c = 391,58 A). Kun lukuisat tutkimukset Eri kiteitä, eri tiedonkeruu strategioita ja etsintä eri kylmäpresipitaattien protectant ratkaisuja. Diffraktio kerättiin flash-jäähdytetään kiteen, joka oli kryosuojattiin järjestysnumero liotus tulee emäliuoksen lisääntynyt pitoisuus etyleeniglykolin lopulliseen konsentraatioon 10% (v /v) 4,6 Å resoluutiolla. Diffraktio tiedot sidottaisiin ja käsitelty käyttämällä HKL2000 ohjelmaa [35]. Tietojen keruu ja lopullinen rakenteellinen tarkentaminen tilastot sekä rakenteisiin on integroitu taulukossa 1.

Rakenne määrittäminen ja hienosäätö

rakenteet ATN-658 Fab ratkaistiin molekyylien korvauksella menetelmällä (MOLREP [36] ja CCP4 ohjelmistoon [37]) käyttäen vasta-ainetta rakenne (PDB merkintä 2DDQ) hakuna malli. Mallia tehtiin sitten useita kierroksia ohjeen rakennus käyttäen Coot [38] vuorotellen hillitty hienostuneisuus käyttäen Refmac5 [39]. Lopullisessa sykliä hienosäätö, TLS kahdenkymmenen TLS ryhmät kullekin ketjun (tuottama TLS liikkeen määritys (TLSMD) server [40] sisällytettiin hienostuneisuus.

Tämä ATN-658 Fab rakennetta käytettiin sitten koska molekyylien korvauksella malli ratkaista rakenteen kvaternääristen kompleksin (ATN-658-uPAR-ATF-SMB) molekyylien korvauksella menetelmällä käyttäen ohjelmia MOLREP [36] ja CNS [41]. Supar-ATF malli (ATE merkintä 1fd6 [ ,,,0],33]) lisättiin sitten sijoitettu osaksi kiteiden kvaternäärisen kompleksien molekyylien korvauksella (molrep [36]). Vaikka alhainen resoluutio tämän kiteen (4,5 Å), erittäin vahva molekyylien korvauksella ratkaisuja molemmissa malleissa saatiin. Kun hienosäätö käyttämällä CNS-ohjelma [41], Fo-Fc ero elektronitiheys osoitti elektronitiheys SMB alalla vitronektiinin, joka edelleen varmistaa oikea molekyylien korvauksella ratkaisuja. tuloksena mallit jossa kaikki neljä proteiinia komponentit hiottiin edelleen käyttämällä CNS v1.3 [41] ja REFMAC [39], ja säätää käsin ohjelman O [42] tai Coot [38].

Kaikki lopulliset rakenteet analysoitiin ja vahvistanut PROCHECK [43], PYMOL [44] ja MOLSOFT ICM [45] . Koordinaatit raportoitu rakenne on talletettu Protein Data Bank (PDB). Lopullinen tilastoja, validointi ja stereokemiallinen laatu rakenne on esitetty taulukossa 1.

Co-immunosaostus

HT1099-soluja lyysattiin Triton hajotuspuskuria (50 mMHepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, ja 1% Triton X-100), jota oli täydennetty proteaasi-inhibiittorit ja 1 mM PMSF: ää. Kirkastetut lysaatit immunosaostettiin vasta ATN-615 ja ATN-658. Immunopresipitaatit blotattiin ja uPAR (R2) tai integriinin α5 (pAb).

Soluadheesioanalyysi

soluadheesioanalyysissä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [46]. Lyhyesti, H1299-soluja inkuboitiin DME /0,1% BSA: ta, jossa 500 uM RGD tai RAD-peptidien 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja sitten ne istutettiin fibronektiiniä (5 ug /ml, Sigma) päällystetyille levyille kanssa tai ilman ATN-615 . Pesun jälkeen kiinnittyneet solut kiinnitettiin ja värjättiin Giemsa. Tiedot kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 550 nm: ssä.

Tulokset

ATN-658 ei sitoudu ei-ihmisen uPAR

Alustavat tutkimukset arvioidaan sitoutumisen ATN-658 soluihin eri lajeja, jotka ilmaisivat uPAR. uPAR ilmentyminen varmistettiin kaikissa solulinjoissa aluksi RT-PCR seurasi western blot käyttäen kanin anti-ihmisen uPAR pAb (rD2D3) että rajat reagoi uPAR jyrsijän ja koira. Tämä tutkimus tehtiin tunnistaa mahdollisia eläinlajeja, joita voitaisiin käyttää tulevaisuudessa toksikologisissa tutkimuksissa ATN-658. Biotiini-ATN-658, joka säilytti täyden sitoutumisen aktiivisuus modifioimattomaan ATN-658 [27], käytettiin tässä arvioinnissa. Biotiini-ATN-658 ei sitoudu hiiren melanooma (B16) solut (Fig. 1A) tai Afrikkalainen vihreän apinan (AGM) (Fig. 1 B) kuolemattomiksi munuaissolut (COS-1) kokosolu- saturaatiositoutumisella kokeissa, kun taas kyllästyvän sitoutumisen havaittiin, että uPAR ekspressoivat ihmisen eturauhassyövän solulinjaa PC-3 (Fig. 1A B), kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Nämä tulokset vahvistettiin ja laajennettiin koskemaan koiran osteosarkooma-soluja (D-17) käyttämällä ei-biotinyloitua ATN-658 ja isotooppi sovitettu IgG negatiivisena kontrollina ja arvioitiin virtaussytometrialla (kuvio. 1C).

B. spesifisyys ATN-658 mitattiin suoralla sitoutumismääritykset käyttäen uPAR ilmentäviä hiiren melanooma (B16), ihmisen eturauhasen syöpä (PC-3) ja Afrikkalainen vihreä apina (COS-1) solujen ja biotiini-leimattu ATN-658. B. FACS-analyysi suoritettiin käyttäen HeLa-soluja (jotka ilmentävät ihmisen uPAR), D-17 keuhkokarsinoomasoluja (ilmentävät koiran uPAR ja COS-1-soluissa. Kukin solulinja inkuboitiin normaalin kanin seerumia (NRS), kanin polyklonaalinen vasta-aine on nostatettu fragmentti ihmisen uPAR (rDIIDIII), hiiren IgG: tä (mIgG) tai ATN-658 ja sopivaa FITC-leimatulla sekundaarisella vasta-aineella.

tunnistetiedot epitoopin ATN-658 ihmisen Supar by site-directed mutageneesi

Sekvenssiryhmittely kädellisten DIIDIII uPAR sekvenssit paljasti, että ihmisen ja AGM uPAR erosivat ainoastaan ​​yhdeksän aminohapon asemat (taulukko 2). Nämä yhdeksän aminohapon erot riittivät täysin kumota sitoutumisen ATN-658 AGM uPAR. Niinpä kloonattu ja ilmennetty AGM Supar S2 soluissa ja teki yhdeksän eri mutanttien että peräkkäin korvataan yksi aminohappo AGM järjestyksessä kunkin mutantin vastaavan ihmisen aminohappo (Fig. 2A). alustava arvio näiden mutanttien oli laadulliset jossa kyky ATN-658 immunosaostamaan (IP) erityisesti mutantin viljelmän supernatantti (CS) ilmentävien solujen että mutantti arvioitiin. ATN-615, joka on myös ihmisen uPAR erityisiä mutta joista olimme jo tunnistettu epitooppi [33], [34], käytettiin vahvistamaan tämän menettelyn hyödyllisyyden. ATN-615 pystyi tutkimusajanjaksolle H192R Supar mutantti (klooni 2; Fig. 2A). Tämä on sopusoinnussa kuvattu epitooppi ATN-615, joka koostuu aa 187-192 (Fig. 2A). Itse asiassa ainoa aminohappo ero AGM ja ihmisen uPAR tässä epitooppi on aa 192. Samoin ATN-658 pystyi tutkimusajanjaksolle E268K (klooni 8) Supar mutantti syytetään jäännös osana ATN-658 epitoopin . Alaniiniskandeerausmutageneesiä ympärillä tämän aminohapon kartoittaa sekvenssin aa 268-275 koska epitooppi ATN-658 (S1). Koska IP on laadullinen arviointi sitova, vangita ELISA-määritykset perustettiin mittaamaan todellinen affiniteetti ATN-658 eri AGM Supar mutanttien kuin se oli mahdollista, että ehkä enemmän kuin aa 268 tarvittiin, jotta voidaan palauttaa täysin sitovaa toimintaa ATN-658, kun yhtiökokous Supar sekvenssi mutatoitiin ihmisen sekvenssin. Koska AGM Supar mutantit ilmaistaan ​​Incorporated V5 lipun, anti-V5 flag-vasta-ainetta käytettiin kaapata AGM Supar kiinteän faasin. Sitoutumisaffiniteetti voitaisiin sitten määrittää kullekin AGM mutantti käyttäen kyllästyminen ainesitoutumistutkimukset kuten aikaisemmin on kuvattu ATN-658 [27]. Tätä lähestymistapaa käyttäen sitoutumisen ATN-658 havaittiin vain kloonaamiseen 8 K

d

~ 2 nM, samanlainen kuin K

d

of ATN- 658 ihmisen Supar ja ihmisen uPAR ilmentävien solujen osoittaa, että tämä yhden aminohapon muutos oli vastuussa täydellistä kumoamista ATN-658 sitoutumisen AGM Supar (Fig. 2B). Tämä yhden aminohapon muutos ei kumota ATN-658 sitova maailmanlaajuinen vaikutus Supar konformaatioon, koska sitoutumisen ATN-617, joka sitoutuu DIIDIII ja ei reagoi ristiin AGM Supar, ei ole muutettu (Fig. 2C).

. Yhden pisteen mutantit tuotu AGM Supar siten, että yhden aminohapon oli muuttunut AGM sekvenssin ihmisen uPAR-sekvenssin ja proteiinit ilmennettiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Jokainen klooni tunnistetaan numero (1-9) pistemutaatio tunnistettu alapuolella numero käyttämällä yhden kirjaimen aminohapon koodin. Lukuun ottamatta yhden pisteen mutaatio, loput Supar sekvenssi on AGM. Supar mutantit ilmennettiin S2-soluihin ja supernatantteja inkuboitiin joko ATN-615 tai ATN-658 ja sen jälkeen immunosaostamalla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Supar havaittiin sitten western blot käyttämällä kanin polyklonaalista antiseerumia ihmisen Supar. B. Capture-ELISA-määritykset käytetään mittaamaan sitoutumisaffiniteettia ATN-658 eri Supar klooneja on kuvattu (A). Kaapata ELISA-levyn oli läpi V5 tunnisteen ja havaitsemiseen käytettiin biotiini-ATN-658. C. Biotiini-ATN-617 käytettiin samalla ELISA-formaatissa, kuten on kuvattu (B) vahvistamaan, että käyttöönotto yhden pisteen mutaatio ei ollut maailmanlaajuinen vaikutus Supar conformation.ATN-617 reagoi ristiin apina Supar ja kaikki klooneja ilmestyi säilyttää tämän reaktiivisuus jälkeen mutaation.

Tasaus tämän epitoopin useille lajien uPAR auttaa selittämään lajikohtaisuus ATN-658 sitova (3). Vanhan maailman kädelliset (apinoita, simpansseja) ovat kehityksellisesti lähempänä ihmisen ja ovat homologisia uPAR ihmisten että epitooppi ATN-658. ATN-658 sitoutumisen on havaittu immunohistokemiallisesti simpanssiin kudoksiin sopusoinnussa tämän havainnon. Sen sijaan uuden maailman kädellinen (makakien, AGM) uPAR poikkeaa useimmiten yhdellä jäännöksen, aa 268, ja tämä riittää täysin kumota sitoutumisen ATN-658. UPAR alemman järjestyksen nisäkkäiden eroaa myös tässä asennossa kuten muutkin sopusoinnussa puute sitoutumisen ATN-658 uPAR tai soluihin, jotka ilmentävät uPAR näistä lajeista sekä (taulukko 3).

vahvistus ATN-658 epitoopin Vety /deuterium Exchange spektrometria (H /D-Ex) B

Vety-deuterium (

1 H-D) vaihto on hyödyllinen väline tunnistamiseen sitoutumiskohdista tai rajapintoja. Siirryttäessä vettä deuterium-pohjainen liuotinjärjestelmä (raskas vesi) proteiini kokee kasvu massan proteiini vetyatomia on vähitellen korvattu deuterons. Todennäköisyys vetyä deuteriumia vaihto tapahtuma määrittää pitkälti proteiinien rakenteen ja liuottimelle. Erot määrä amidin vetyvaihtoprosessia sijainnin määrittämiseen epitoopin.