Krooninen sairaus

Siirtogeenisten Hiirillä ja rotilla geneettisesti muunneltuja eläimiä, joiden genomit muutetaan käyttämällä DNA-menetelmin. Geneettisesti muunnetut hiiriä käytetään yleisesti tutkimusta tai eläinmalleja ihmisen sairauksia. Miten nämä tutkijat tekevät ne siirtogeenisiä eläimiä? Yleisesti, tutkijat ensin täytyy rakentaa siirtogeenin, jossa on promoottori ja rakenteellisen geenin. Sitten DNA valmistetaan ja mikroinjektoidaan hedelmöittyneen hiiri munia, ja myöhemmin siirtogeenisiä hiiriä tai rottia ovat syntyneet. Seuraavassa kohdat tarjota lyhyen katsauksen vaiheista tarpeen saada siirtogeenisiä hiiriä tai siirtogeenisiä rottia.

1. Plan ja Valmista Experiment

Yksi on tehtävä selväksi, että mikä tarkoitus on. Sitten hän tarvitsee hankkia tai kloonata haluttu promoottori ja rakenteellinen geeni ja perustaa geeniekspression määritystä varten erityisen tutkimuksen. Kuvaamaan joitakin geenejä on haitallisia eikä ristiriidassa normaalille kasvulle ja kehitykselle alkion. Ilmaus siirtogeenin edellyttää, että sopiva transkription säätelyelementit sisällytetään DNA-rakenne. Alustavat tutkimukset soluviljelmissä voi ottaa yhteyttä tarkistaa eheyden konstruktin ja toiminta promoottorin.

2. Clone ja yhtenäisyyden toteamiseksi siirtogeenin

Useita asioita tulee harkita kloonauksen aikana. Siirtogeenin tulisi sisältää ainutlaatuisia markkereita, niin että sen läsnäolo voidaan helposti havaita hiiren kudosten DNA-näytteitä, ja sen ilmentymistä voidaan analysoida ja erottaa endogeenisen geenin ilmentymistä. Sekvensointi liitoksen fragmenttien tulisi suorittaa vahvistaa, että siirtogeeni on funktionaalinen promoottori, aloituskodoni, ja polyadenylaatiosignaali. Parhaissa olosuhteissa, siirtogeeni pitäisi testata ilmentymistä soluviljelmässä järjestelmään ennen siirtogeenisiä hiiriä tehdään.

3. Muodosta seulontamenetelmä

PCR on erittäin suositeltavaa tunnistaa siirtogeenisiä eläimet. Ennen kuin lähetät DNA mikroinjektio hedelmöittynyt hiiren tai rotan munia, pitäisi valmistella PCR tai Southern blot määritystä käytetään havaitsemaan siirtogeeni kun sitä oli lisätty hännän DNA yhden kopion pitoisuus. Toinen määritys havaitsemaan hiiren endogeenisen geenin tai endogeenisen rotan geeni tarvitaan sen osoittamiseksi, että DNA-valmisteet ovat vapaita PCR-inhibiittoreita. Eläimiä testataan molemmilla määrityksiä niin, ettei siirtogeenistä perustaja on virheellisesti hylätään, koska häntä DNA on saastunut PCR-estäjien.

4. Muodosta Expression Assay

Voidaan käyttää RT-PCR lähestymistapa RNA ilmentymisen in situ -hybridisaatiolla tai RNAasisuojausta määrityksessä RNA-koettimia saavuttaa siirtogeenin ekspressiota. Proteiini voidaan valmistaa on oltava eri proteiineista normaalisti ilmaistu hiirtä. On olemassa useita tapoja tämän saavuttamiseksi, ja yksi voi käyttää reportterigeenin, kuten fluoresoiva proteiini visualisoida prosessin suoraan.

5. DNA puhdistus ja mikroinjektio.

DNA-uutetta kit suositellaan puhdistamiseksi mikroinjektio DNA. Mutta, jos halutaan käyttää suuria DNA-fragmentteja, on erityinen protokolla valmistamiseksi BAC DNA mikroinjektiota. Lukuisat julkaisut osoittavat, että BAC: sisältävien prokaryoottisia vektorin sekvenssit ilmentyvät fysiologisia tasoja siirtogeenisiä hiiriä. Toisin kuin plasmidi, joka perustuu siirtogeenien poisto vektorin sekvenssien ei tarvita BAC siirtogeenien. Siirtogeeniekspressio Sitten konstrukteja kvantitoidaan ja mikroinjisoitiin hiiri munia ja kirurgisesti siirtää vastaanottajille.

6. Southern-analyysi

6 viikon ikäisten Southern blot-analyysi olisi tehtävä selvittää, kuinka monta kopiota siirtogeenin integroitu, ja kuinka monta kromosomikohdissa siirtogeeni työnnetään, ja myös tarkistaa siirtogeenisiä tilan ja onko siirtogeeni on ehjä. Kyseiset tiedot ovat tarpeen varmistaa, että siirtogeenisiä perustajat kanssa hyvät mahdollisuudet lähetyksen ehjän siirtogeenin yhdessä insertiokohdassa voidaan valita intensiivisen jalostukseen.