Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on pahanlaatuinen sairaus, joka syntyy mahalaukun epiteelin. Mahdollinen biomarkkereiden mahasyövän on proteiini anneksiini A4 (ANXA4), solunsisäinen Ca

2 + anturi. ANXA4 esiintyy lähinnä epiteelisoluissa, ja sen tiedetään olevan osallisena erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten apoptoosin, solu pyöräily ja antikoagulaatiotaso. Sen suhteen syövän, ANXA4-yli-ilmentyminen on havaittu syövät eri alkuperää, kuten mahalaukun kasvaimet liittyvät

helikobakteeri

infektio.

H. pylori

indusoi ANXA4 ilmaisun ja solunsisäisen [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset, ja on tärkeä riskitekijä syövän synnyn, joka johtaa syöpään. Tästä huolimatta korrelaatio, rooli ANXA4 etenemisessä mahalaukun kasvaimet jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet, onko ANXA4 voi välittää määrä solujen kasvua ja onko ANXA4 alavirran signaalit kasvaimien syntyyn liittyvien. Todettuaan määrä solujen kasvua reaaliaikaisesti, huomasimme, että ANXA4 edistää solujen lisääntymistä. Transkriptio geeni profiilia ANXA4 yli-ilmentäviä soluja mitattiin ja analysoitiin ihmisen eksoni paneelit. Tämän transkription geenin tiedot, osoitamme, että yli-ilmentyminen ANXA4 säätelee geenien, joiden tiedetään liittyvän syöpään, esimerkiksi aktivoinnin hyaluronaanin välitteisen liikkuvuuden reseptorin (RHAMM), AKT, ja sykliini-riippuvaisen kinaasin 1 (CDK1) sekä tukahduttamista p21. Asetus Näiden geenien lisäksi indusoi syöpäsolun lisääntymistä. Olemme myös löytäneet Ca

2+ voisi säädellä siirto loppupään signaalien ANXA4. Ehdotamme, että ANXA4 laukaisee signalointiryöpyn, mikä lisää epiteelisolujen proliferaatiota, lopulta edistää syövän syntymistä. Nämä tulokset saattavat siksi antaa uutta tietoa mahasyövän hoidossa, nimenomaan kautta muuttamista ANXA4 aktiivisuuden.

Citation: Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) paljastuu Molecular mekanismi mahasyövän Marker anneksiini A4 Cancer Cell Proliferation käyttäminen Exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615

Editor: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 06 elokuu 2012; Julkaistu: 07 syyskuu 2012

Copyright: © Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvoston Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), National Taiwan University Huippuluokan Steering Research Project (10R70602C3) ja National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti ja osoittaa hyvin yleisiä aasialaisilla. Vaikka esiintyvyys mahasyövän on vähenemässä, yleinen 5 vuoden pysyvyys on edelleen alhainen [1]. Määritetään tehokkain mahalaukun syövän hoitomuotoja ja kehittämällä aikaisen vaiheen diagnostiset välineet ovat tärkeitä strategioita, jotka vaikuttavat kliinisiä tuloksia. Kattava tutkimus molekyylitason mekanismeja, jotka ovat pohjana mahasyövän voitaisiin tukea kehitettäessä käyttökelpoisia terapeuttisia strategioita tähän sairauteen.

Helicobacter pylori

on mahalaukun taudinaiheuttaja ja on vallitseva etiologinen tekijä mahasyövän . Noin puolet maailman väestöstä on infektoitunut

H. pylori

, ja yli 60% mahasyövän potilailla on ollut

H. pylori

-positivity [2], [3], [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että

H. pylori

voi aiheuttaa sekä leviämisen mahasyövän solujen ja limakalvojen tulehdusreaktioita [5], [6]. Niinpä, jotta tutkimiseksi molekyylitason mekanismit mahasyövän, on tarpeen tutkia roolia ja mekanismeja

H. pylori

in mahasyövän.

Annexins ovat läsnä kaikissa useimmissa organismeja, kuten eläimiä, kasveja, sieniä ja protists. Se liittyy erilaisiin fysiologisiin toimintoihin [7]. Perustuen rakenteesta konservoituneen ydin domain, annexins pidetään solunsisäinen Ca

2+ anturit ja fosfolipidin sitovia proteiineja. Ne on havaittu stimuloivan kalvokuljetuksessa ja rakkula kokonaan vasteena lisääntyneeseen solunsisäisen [Ca

2 +]

i [8], [9]. Ihmisillä annexins on havaittu olevan useita solutoiminnoille jotka ovat kätkeytyy solun tukirangan organisaatioon, eksosytoosilla, endosytoosin, ionikanavan sääntely, tulehdus, apoptoosin, fibrinolyysin ja hyytyminen [8]. Annexins katsotaan myös olevan osallisena syövän, diabeteksen ja tulehduksen [10]. Viime aikoina yhä useammat tutkimukset ovat nousseet että sotkea osallistuminen annexins karsinogeneesis-, sekä edistää proliferaatiota [11], [12], invaasio [13] ja etäpesäkkeiden [14], [15]. Kuitenkin suhde kaikkien jäsenten annexins perheen syöpä ei ole ominaista.

anneksiini A4 (ANXA4) on jäsenenä annexins perheen liittyvät ruoansulatuskanavan. Se on näkyvästi ilmaistaan ​​epiteelisoluissa [16]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ANXA4 pidetään mahdollisena mahalaukun biomarkkereiden perustuu sen tunnistamiseen kudoksissa mahasyövän potilaiden proteomic tutkimuksissa. Up-regulation ANXA4 on nimenomaan löytyy

H. pylori

infektoiduista tuumorikudoksissa [17], [18]. Lisäksi monet tutkimukset ovat raportoineet suhde ANXA4 ilmaisun ja syöpä. Tämä suhde on raportoitu haiman adenokarsinooma [19], selkeä cell carcinoma munasarjan [20], [21], munuaisen karsinooma [22], kolorektaalisyövän [23] ja eturauhassyövän [24]. Vuonna munuaissolukarsinooma, säätely ylöspäin ANXA4 osallistuu levittämiseen kasvainsolujen, edistää solujen vaeltamiseen [22]. Kolorektaalisyövässä potilailla, korkea ilmentyminen ANXA4 liittyi alhainen eloonjäämisaste ja sitä raportoitiin mahdollisena biomarkkeri kasvaimen diagnoosia [23]. Sikäli kuin solun toiminnan, ANXA4 voivat aiheuttaa kalsiumin signalointi, antikoagulaatiohoito ja kestävyys apoptoosin [25], [26]. Nämä tapahtumat osoittavat, että ANXA4 on kasvaimia toiminto säätelemällä solujen kasvunopeus.

Tässä tutkimuksessa olemme tarkoitus valaista molekyylitason mekanismi, jolla ANXA4 aiheuttaa syövän synnyn. Tämän saavuttamiseksi, me seurataan kasvuvauhti mahasyövän solujen eri ekspressiotasoja ANXA4. Olemme myös arvioineet transkription ilmaus profiilia ANXA4 yli-ilmentäviä soluja ja käyttää eksoni taulukot analysoida alavirran signalointia ANXA4. Näistä tutkimuksista, olemme määritelleet 9 syöpään liittyvien geenien ANXA4 alavirran signaalit käyttämällä kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) tietokantaan. Lisäksi osoitimme, että ANXA4 säätelee aktivointi RHAMM, AKT, CDK1 ja tukahduttaminen p21, ja ehdotti siten ANXA4 säädelty solun proliferaatioreitillä.

Tulokset

aktivoituminen ANXA4 Edistää Cell Proliferation

Olemme aiemmin raportoitu, että ANXA4 yliekspressoituu

H. pylori

tartunnan mahakasvaimen kudoksen [17]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia suhdetta ANXA4 ja karsinogeneesin, pyrimme määrittämään, onko ANXA4 edistää solujen lisääntymistä. Solut transfektoitiin joko täyspitkä

ANXA4

cDNA lisätä ANXA4 ekspression tai tietyn siRNA tarkoitettu hiljentää ANXA4 ilmentymisen. Transfektion jälkeen tarkkailtiin kasvu AGS mahalaukun syövän soluista käyttäen reaaliaikaista solujen analyysi (RTCA) järjestelmä. Solujen lukumäärät kirjattiin soluksi (CI) arvo. Kasvukäyrät AGS soluja muutettu transfektion jälkeen. Yli-ilmentyminen ANXA4 lisäsi merkittävästi solujen kasvu AGS soluissa verrattuna säätökennoja (

P

0,001; kuvio 1A), kun taas ANXA4 Knockdown vähensi merkittävästi kasvuvauhti (

P

kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ANXA4 on mahdollista edistää soluproliferaatiota.

solujen proliferaation mittaamiseen, AGS soluja viljeltiin 16-kuoppaisen mikrotiitterilevyn E-levy. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solun kasvu (A) solut yli-ilmentävät ANXA4, ja (B) soluista, jotka sisältävät

ANXA4

erityisiä siRNA mitattiin. Havaittiin, että ANXA4 säädellään solun indeksi ajasta riippuva tavalla. (A ja B) Data normalisoitiin mittauksista otettu 24 tuntia, joka oli silloin, kun transfektio aloitetaan. Havaitsemisen aika kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty keskiarvona ± SD, n = 3

P

-arvot laskettiin käyttäen kahden näytteen Kolmogorov-Smirnov-testi.

ANXA4 Lisäykset Expression kalvon proteiinit, RHAMM ja LAMP2

tutkittiin myös ero geenin ilmentymisen välillä ANXA4 yli-ilmentäviä soluja ja ohjaus soluissa, jotka ilmentävät tyhjän vektorin. Tutkimme tämän käyttämällä eksonin erilaisia ​​analyysi, joka tarjoaa tarkemman kuvan geenien ilmentymistä käyttämällä neljää koettimia per eksonin, verrattuna tavanomaiseen 3 ”ryhmät [27]. Kuvassa S1,

X

akselilla on sirontakuvaajaan näyttää voimakkuudet koetin ilmaisun mitataan yhdessä kokeessa ja

Y-

akseli näyttää voimakkuudet koetin ilmaisun mitattuna toisessa kokeessa . Nämä tulokset osoittavat myös korrelaation Kummankin kokeen tulokset ja osoittaa, johdonmukaisuus välillä päällekkäisiä mikrosiruja. Geeni-ilmentymisen tasot laskettiin intensiteetit mitattiin koetinsarjojen. Kaiken ilmentymistä 1052-geenien havaittiin olevan merkittävästi erilainen (

P

0,05) välillä ANXA4 yli-ilmentäviä soluja ja kontrollisoluja.

ANXA4 on solukalvon sitova proteiini, joten ehdottaa muita solukalvon proteiineja voidaan säädellä ANXA4 ja yhdessä transduce sen alavirran signalointia. Tutkia signaalitransduktioreittiin säädellä ANXA4, tutkimme solukalvon proteiineihin eksonista erilaisia ​​analyysi. Neljäkymmentä seitsemän solukalvon proteiinien havaittiin olevan ≥1.5-kertainen muutos ANXA4 yli-ilmentäviä soluja (taulukko S1). Näistä hyaluronaaniin välittämää liikkuvuutta reseptorin (

HMMR

) kasvoivat eniten ilmaisun (2,4-kertainen, taulukko S1). Lisäksi meidän edellinen tutkimus osoitti, että solun pinnalla ilmentymistä lysosomaalisen kalvoproteiini 2 (

LAMP2

), lysosomaalista merkki, on ajan säännelty ANXA4 ja osallistuu eksosytoosilla (Kuva S2 ja File S1) . Täällä, transkription ilmaus

LAMP2

myös osoitti kasvua lauseke (1,8-kertainen, taulukko S1) mitattuna eksoni erilaisia ​​analyysi. Tässä tutkimuksessa ANXA4 yliekspressoitui tai vaiennettu (kuvio 2A) ja sitten analysoitiin immunoblottauksella tarkistaa proteiinin ilmentymistä RHAMM ja LAMP2. ANXA4 yliekspressio lisäsi ekspressiota RHAMM (kuvio 2B) ja LAMP2 (kuvio 2C), ja yhdenmukaisia ​​Tämän knockdovvn ANXA4 ilmentymisen vähensivät ekspressiotasoja (kuvio 2B ja 2C).

(A) AGS -solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla (pcDNA3.1), täyspitkä

ANXA4

(pcDNA3.1 /

ANXA4

), ohjaus siRNA (siControl), tai

ANXA4

siRNA (si

ANXA4

). (B-C) RHAMM ja LAMP2 ilmaisuja mitattiin ANXA4 yli-ilmentäviä soluja tai soluja, jotka sisältävät

ANXA4

erityisiä siRNA immunoblottauksella analyysi. (B) ekspressio RHAMM oli merkitsevästi säädelty (

P

0,05) jälkeen yli-ilmentävät ANXA4 ja merkittävästi alassäädetty (

P

0,01) jälkeen hiljentäminen ANXA4 ilme. (C) ilmentymistä LAMP2 oli säädelty jälkeen yliekspressoivia ANXA4 ja merkittävästi alassäädetty (

P

0,05) jälkeen hiljentäminen ANXA4 ilme. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, n = 3 *

P

0,05 vs. kontrolli-käsittelyn.

ANXA4 Yliekspressio säätelee syöpään liittyvien Gene Expression

Käytimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) tietokanta suorittaa geenien toiminnan analyysi eksonin array tiedot ja totesi, että 25 42 geenit olivat oikeutettuja verkko funktioanalyysivalikko (≥2-kertainen ero ilme,

t

testi,

P

0,05) (taulukko 1). Kolme toiminnallista verkot liittyi merkittävästi ANXA4 geenien. Kaikkein liittyy vahvasti verkko oli

solusykliä ja sukuelimiin sairaus

(

P

0,05; kuvio 3A), ja kärkipään sairauksien tai häiriöiden oli

syöpä

(

P

0,05; kuvio 3B). Oli 9 geenejä luokiteltu syöpään liittyvien geenien ANXA4 yli-ilmentäviä soluja lukien 7 geenit, jotka säädellään ylöspäin kokeissa. Nämä geenit ovat eukaryoottitranslaatioon initiaatiofaktoria 4E (

EIF4E

), sukkinaattidehydrogenaasi monimutkainen, alayksikön C, kiinteä kalvo proteiinia, 15 kDa (

SDHC

), sykliiniriippuvainen kinaasi 1 (

CDK1

), poistaa lymfaattisen leukemian 2 (

DLEU2

), kromatiinin muuttamalla proteiinia 5 (

CHMP5

), TIMELESS vuorovaikutuksessa proteiini (

TIPIN

), PDZ- sitova kinaasi (

PBK

). Korion- somatomammotropin hormonin 1 (istukan laktogeeni) (

CSH1

) ja interferoni, alfa 2 (

IFNA2

) on alas-säädellä ANXA4. Tutkimustulosten perusteella ehdotamme, että ANXA4 on toiminto asiakkuutta solujen lisääntymisen. Lisäksi

CDK1

ja

PBK

(kuvio 3B ja taulukko 1) katsottiin mukana ANXA4 leviämisen indusoivan malli. Koska CDK1 aktivointi liittyy solujen lisääntymistä kehittää mahalaukun MALT-lymfooma [28]. Vastavuoroinen aktivointi CDK1 ja PBK on aikaisemmin raportoitu [29]. Tässä tutkimuksessa ylös-säätely

CDK1

ja

PBK

havaittu ANXA4 yli-ilmentäviä soluja vahvistivat kvantitatiivisen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) analyysi (kuva S3) .

(A) 25 42 kandidaattigeenien osoitti merkittävää eroa ilmaisun (a-kertainen ≥2 tai kertainen lasku ≤0.5,

P

0,05 ) ja luokiteltiin joukossa kolme kärkipään verkoissa. (B) Genes luokiteltiin niiden dokumentoitu /perustettu rooleja eri sairaustiloissa ja häiriöt.

ANXA4 Säätelee aktivointi AKT, CDK1 ja tukahduttamiseksi p21

CDK1 aktivointi , joka säätelee p21, estää G2 /M vaiheessa pidätyksen, mikä edistää mitoosia ja solujen lisääntymistä [30]. Se on myös raportoitu, että AKT estää aktivoinnin p21, aiheuttavat sen kerääntyminen sytoplasmassa ja siten edistää soluproliferaatiota [31]. Käyttämällä immunoblot-analyysi, havaitsimme, että yli-ilmentyminen ANXA4 lisääntynyt fosforylaation seriini 473 annetun AKT ja treoniini 161 CDK1 ja vähentynyt ilmentyminen p21 (kuvio 4A). Lisäksi Tämän knockdovvn ANXA4 ilmentymisen pienentynyt fosfo-AKT ja fosfo-CDK1 ja lisääntynyt ilmentyminen p21 (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että fosfo-AKT, fosfo-CDK1 ja p21 säätelee ANXA4 ja ovat alavirtaan signaaleja ANXA4.

(A

–

B) Proteiini tasojen p21, fosfo-AKT ( Ser473) ja fosfo-CDK1 (Thr161) in AGS soluissa, määritettynä immunoblottauksella analyysi. (A) Soluja transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai täyspitkä

ANXA4

. (B) transfektoitiin siControl tai si

ANXA4

. Edustavat tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty keskiarvona ± SD. α-tubuliinin käytettiin sisäisenä kontrollina. *

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli-käsittelyn.

Ca

2+ sovittelee ANXA4 Downstream signaalitransduktioreittiin

karsinogeneesin Ca

2 + on mukana aiheuttaa signaalitransduktion välittävän erilaisia ​​biologisia prosesseja kuten invaasio, proliferaatio, angiogeneesi ja metastaasi [32]. On raportoitu, että annexins voi välittää joitakin fysiologisia mekanismeja Ca

2 +: sta riippuvainen tavalla [9]. Aiemmissa tutkimuksissa, solunsisäinen [Ca

2 +]

i korkeus aiheutettiin

H. pylori

infektio, joka puolestaan ​​up-regulation ANXA4 ilmaisun [17], [33]. Voit selvittää nousu solunsisäisen [Ca

2 +]

i välittää lähetyksen alavirtaan signaalien ANXA4, AGS soluja käsiteltiin ionomysiinillä. Ionomysiini on Ca

2+ ionoforin ja lisättiin viljelyalustaan ​​meidän AGS solussa malli aiheuttaa jatkuvia solunsisäisten [Ca

2 +]

i [34]. Proteiini ilmauksia ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT ja fosfo-CDK1 mitattiin immunoblot-analyysillä (kuvio 5A). Samanlaisia ​​havaintojemme kanssa ANXA4 yliekspressio, lisääntynyt [Ca

2 +]

i tasoja merkitsevästi sääteli ilmentymistä RHAMM (

P

0,01) ja fosfo-AKT (Ser 473) (

P

0,05) ja merkittävästi alassäädetty ilmentymistä p21 (

P

0,01) (kuvio 5B). CDK1 aktivaatio kasvoi hieman [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset. Kuitenkin kohonnut [Ca

2 +]

i tasoilla ei ollut vaikutusta ilmaisun ANXA4 ja LAMP2. Edellisessä tutkimuksessa ANXA4 ja LAMP2 voi paikallistaa sen solukalvon jälkeen

H. pylori

infektio solunsisäisen [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset (kuva S4 ja File S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ca

2+ vain vaihtaa solunsisäisen sijainnin ANXA4 ja LAMP2, mutta ei säätelee niiden ilmaisua.

(A) Soluja käsiteltiin ionomysiinin lisäämiseksi solunsisäistä Ca

2+ tasoilla, ja ekspressiotasot ANXA4, LAMP2, RHAMM, fosfo-AKT (Ser473), p21, ja fosfo-CDK1 (Thr161) ovat osoitti immunoblottauksella. (B) Histogrammi näyttää liittyvän tasoja (A). Suhteellinen ilmauksia RHAMM (

P

0,01), fosfori-AKT (Ser473) (

P

0,05) ja p21 (

P

0,01) olivat merkittävästi erilaiset. Tiedot ovat peräisin kolmen erillisen kokeen (keskiarvo ± SD). *

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli-käsittelyn.

Keskustelu

syöpätutkimukseen tunnistaminen biomarkkereiden ja myöhemmin selventäminen niiden mekanistinen suhteita tumorigeneesin voi edistää hyödyllisiä diagnostisten välineiden ja johtaa optimaalisen terapeuttisen strategioissa. Viime aikoina yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että biomarkkereiden ehdokas proteiinit annexins perhe ovat mahdollisesti avainasemassa etenemistä eri syöpiä; esim ANXA1 selkeitä solun munuaissyövän, ANXA2 mahasyövän ja peräsuolen syöpä, ANXA4 paksusuolisyövän, ANXA8 rintasyövän, ANXA10 varten hepatosellulaarinen syöpä, ANXA11 munasarjasyövän ja peräsuolen syöpä [35]. ANXA4, jäsen annexins perheen, on havaittu yliekspressoituvan mahakasvaimen kudosten ja liittyy myös mahalaukun syöpään liittyvien

H. pylori

infektion [17]. Lisäksi toinen annexins perheenjäsen, ANXA2, on myös havaittu olevan yli-ilmentynyt mahasyövän ja se liittyy huono kliinisistä tuloksista, joten se potentiaalinen ennustetekijä [36]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat osallistumista ANXA4 kasvainten synnyssä; kuitenkin, sen tarkkaa prosessissa jää epäselväksi. Jotta edelleen arvioida solujen toimintaa ANXA4 etenemisessä mahasyövän, selvitimme yhteys näiden kahden välillä ja myöhemmin osoittivat, että ANXA4 voi säädellä syöpään liittyvien geenien ja levittämään polku solujen lisääntymistä.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että syövän synty liittyviä proteiineja, kuten RHAMM, AKT, p21, PBK, ja CDK1 säädellään yliekspressio ANXA4. Kaavamainen esitys ANXA4 aiheuttaman alavirran signaalit, jotka liittyvät soluproliferaation on esitetty kuviossa 6.

HMMR

(RHAMM) on onkogeeni, joka on yli-ilmentynyt useissa syövissä, mukaan lukien mahasyöpä, ja se on yhdistetty moniin solun prosesseja, kuten solun signaloinnin, solun proliferaation ja tuumorigeneesin [37], [38].

ANXA4 sitoutuu solukalvon on Ca

2 + -riippuvaisen tavalla ja indusoi alavirran signaalitransduktioreittiin. ANXA4 up-regulation LAMP2, lysosomaalista merkki mukana eksosytoosilla, ja RHAMM. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että RHAMM aktivoi RAS ja PI3K, joka myöhemmin johtaa induktion AKT. ANXA4 up-regulation AKT ja CDK1 aktivointi, PBK geenien ilmentyminen ja alas-säätelee p21. Ca

2+ myös ajan säätelee RHAMM ja fosfo-AKT, ja alas-säätelee p21. Tämä signaali Cascade saattaa lopulta johtaa solun hyperproliferaatiota. Kiinteät linjat nuolilla ja sininen ympyrä osoittavat vahvisti asetuksen; katkoviivat nuolilla ja violetti ympyrät ilmaisevat viittauksia tai vahvistamaton vuorovaikutuksia.

On raportoitu, että RHAMM indusoi RAS signalointiryöpyn ja aktivoi AKT [39]. RAS signalointiryöpyn transdusoi alavirran signaalit aktivoimalla fosfo- AKT kautta fosfoinositidi 3-kinaasien. Tämä aktivointi AKT on myös raportoitu markkerina mahalaukun syövän etenemisessä [40]. Olemme aiemmin raportoitu, että

H. pylori

infektio liittyy ANXA4 yliekspressio [17].

H. pylori

voi toimittaa Sytotoksiini liittyvän geenin A (CagA) isäntäsoluihin, jolloin AKT aktivointi, ja siten edistää solujen lisääntymistä [41]. Mitä solun selviytymisen, AKT tukahduttaa apoptoosin stimuloimalla NF-KB [42]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että ANXA4 vuorovaikutuksessa p105 (NF-KB: n p50-esiasteproteiinin) ja estää transkriptionaalista aktiivisuutta NF-KB: n indusoimaan anti-apoptoottinen vaikutus [25]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että ANXA4 on tärkeä rooli solujen eloonjäämistä ja solujen kasvua.

CDK1-sykliini B1 kompleksit säätelevät solusyklin G2 /M-vaiheeseen, ja on myös liitetty edistää kasvaimien syntyyn [43]. Tuore tutkimus osoitti, että lisääntynyt ilmentyminen CDK1 liittyy etenemistä

H. pylori

-associated gastriitti limakalvoon liittyvä imukudokseen lymfooma [28]. Tässä tutkimuksessa CDK1 aktivointi oli ajan säännelty ANXA4. Nämä tapahtumat osoittavat, että ANXA4 voisi välittää alavirran signaalireitin, mikä johtaa kasvaimien syntyyn mahasyövän potilailla, joiden

H. pylori

infektio.

lisäksi osallistumisensa etenemistä syöpä, ANXA4 on myös yhdistetty hankittu chemoresistance sen syöpälääkkeiden [44], [45], [46]. Kun paklitakseli-resistenttejä solulinja (H460 /T800), ANXA4 ilmentyminen lisääntyy ja tumassa [44]. Selvästi solun munasarjasyöpä ja mesoteliooma soluja, ANXA4 ilmentyminen on koholla ja resistenssiin liittyvä hoitoon karboplatiinin, ja pidetään biomarkkeri alttius sisplatiinin [45], [46]. Lisäksi ANXA4 on solunsisäinen Ca

2+ anturi, ja Ca

2+ tärkeä rooli neurotoksisuuden ja sydämen vajaatoiminta [47], [48]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt määrä ANXA4 ei ole vain liittyy syövän vaan myös Alzheimerin taudin, sydämen vajaatoiminta ja solujen leesio etanolin aiheuttamaa [49], [50], [51].

Ca

2+ messenger järjestelmä tarvitaan myös solujen lisääntymisen prosessia ja voi säädellä solusyklin [52], [53]. On raportoitu, että Ca

2 + voi aktivoida AKT ketjussa edistäen solujen eloonjäämistä [54]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ilmaisua RHAMM, fosfo-AKT ja tukahduttaminen p21 kasvatti merkittävästi [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset (kuva 5).

H. pylori

infektio liittyy ANXA4 yliekspressio ja solunsisäisen [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset (kuva S4 ja File S1) [17], [33]. Nämä tulokset osoittavat, että

H. pylori

-infektio voi aiheuttaa joitakin alavirran signalointia ANXA4 stimuloimalla solunsisäisen [Ca

2 +]

i korkeusmuutokset. Kuitenkin yksityiskohtaisesti mekanismi prosessi saattaa olla monimutkainen ja epäselvä. Näitä voisivat tarjota selvittäminen mahalaukun tumorigeneesin prosessin taustalla

H. pylori

stimulaatiota. Yhdessä tämä näyttö viittaa siihen, että Ca

2+ voivat auttaa ANXA4 transduktion signalointi ja edistää tuumorigeneesiä mahalaukun potilaalla on

H. pylori

infektio.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että hiljentäminen ANXA4 pienenee epiteelisolujen proliferaatiota, kun taas sen yliekspressio kasvaa leviämistä. Lisäksi ANXA4 indusoi myötävirtaan signaaleja, jotka edistävät solujen kasvua. Oletamme, että nämä loppupään signaaleja ja aktivoituminen isäntäsolun jakamalla voi olla patogeeninen tapahtumia

H. pylori

n aiheuttamaa syövän synnyn. Tämänhetkisessä kliinisessä terapiassa, AKT, p21 ja CDK1 on käytetty syöpälääkkeen tavoite. AKT-estäjällä, Perifosine, on suullinen syöpälääke ja on anti-leviämisen aktiivisuutta useissa kasvainmuodoista [55], [56], [57]. Paklitakseli (Taxol) ja vinkristiini voi aiheuttaa ja lisätä p21 ilmaus pienentää G2 /M pidätyksen ja lohko solujen lisääntymistä [58], [59], [60], [61]. Flavopiridoli on inhibiittori useita CDK: iden, mukaan lukien CDK1 apoptoosin indusoimiseksi ja anti-angiogeneesiä [62]. Nämä tutkimukset osoittavat, että korkeus ANXA4 potilailla voidaan pitää lääkkeen kohteena mahalaukun syövän hoidossa. Useiden lääkkeiden yhdistelmä voisi tarjota tehokkaampia hoito estää signaalien kautta. Yhdessä tämä tutkimus voisi tarjota uusia oivalluksia terapeuttisten strategioiden kehittämisen mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen mahan adenokarsinooma AGS soluja (CRL-1739, ATCC) kasvatettiin 90% RPMI 1640 väliaine (Biological Industries, Bet-Haemek, Israel), joka oli täydennetty 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (Biological Industries, Bet-Haemek, Israel) . Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kontrolloidussa kosteutetussa ilmakehässä inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

Plasmidit ja Transfektiot

Täyspitkä

ANXA4

was monistettiin PCR: llä käyttämällä alukeparia

ANXA4

-F (5 ’atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3’) ja

ANXA4

-R (5 ’gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3’), ja monistettu tuote insertoitiin HindIII /EcoRI-kohtiin pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA).

ANXA4

erityisiä siRNA ja negatiivinen kontrolli Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Soluja viljeltiin kuuden kuoppalevyillä tai päällystetyt peitinlasit 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin ohimenevästi pcDNA 3.1 (+) /

ANXA4

(8 ug kuudeksi kuoppalevylle; 0,4 ug /ml 96-kuoppaisella E-levy) tai

ANXA4

siRNA (100 pmol kuudeksi kuoppalevylle, 10 pmol varten 96 kuopan E-levy) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Tehokkuutta ekspressiovektoriin ja siRNA transfektio analysoitiin immunoblottauksella. Transfektion jälkeen 48 tuntia, ero proteiinien ekspression ja geenien havaittiin.

Vasta-aineet

hiiren monoklonaalisia vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: CDK1 p34 (sc-51578) Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) ja RHAMM (ab67003) peräisin Abcam (Cambridge, UK); ja α-tubuliinin (T5168) Sigmalta (Dorset, UK). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita olivat seuraavat: ANXA4 (sc-28827), p21 (sc-397), ja pCDK1 p34 (Thr 161, sc-101654) Santa Cruz Biotechnology; ja AKT (9272) ja Pakt (Ser473, 9271S) Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

immunoblottauksella

Solulysaatit valmistettiin AGS-soluja, jotka oli ohimenevästi transfektoitu ekspressiovektoreiden pcDNA 3.1 (+) /

ANXA4

(8 ug) tai

ANXA4

siRNA (100 pmol). Voit selvittää erot proteiiniekspressiossa olosuhteissa suuren solunsisäisen [Ca

2 +]

i, ionomysiini (5 uM) lisättiin soluille 1 h. Vaikutusten tutkimiseksi inhibition Akt-fosforylaation, solut ravinnotta 1,5 h jälkeen 48 tunnin transfektion ja käsiteltiin 5 uM AKT-estäjällä VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) 1 tunnin ajan. Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa ja tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa kevyesti keinutuoli, seuraavat ensisijaiset vasta-aineet levitettiin: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-Pakt (Ser473, 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500), ja anti-RHAMM-vasta-aine (1:400). Membraanit inkuboitiin sekundäärisen vuohen anti-hiiri-konjugoitu IgG-vasta-aineita (Sigma) tai vuohen anti-kani-konjugoitua lgG: tä (Rockland, Gilbertsville, PA), vastaavasti. a-tubuliinin-vasta-aine (1:4000) käytettiin sisäisenä kontrollina. Immunoblotit kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesens- (ECL) havaitseminen kit (Millipore) ja visualisoidaan röntgenfilmit. Intensiteetti havaittu bändejä normalisoitiin intensiteetin α-tubuliinin band. Densitometri-analyysi suoritettiin käyttäen Kodak 1-D Image Analysis ohjelmistoversio 3.6 (Eastman Kodak, London, UK).

eksoni Array Hybridisaatio ja analyysi

Tutkia loppupään geenejä ANXA4 vertasimme geeniekspressioprofiilien välillä transfektoitujen solujen pcDNA3.1 (+) /

ANXA4

ja ohjaus, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla käyttäen eksonin array. Solun totaali-RNA uutettiin käyttäen TRIzol® reagenssia (Invitrogen), ja RNA: n puhtaus varmistettiin spektrofotometrisesti (A260 /A280-suhde) sekä kapillaarielektroforeesilla (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNA käsittely ja hybridisaatio suoritettiin käyttäen Affymetrix Human eksoni 1.0 ST paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) valmistajan protokollan. Jokainen järjestelmä on 28869 hyvin selityksin geenien kanssa 764885 eri antureista. Array sisältää noin 26 koettimia kutakin geeniä. Affymetrix koetin asetetaan tietoa näkyvät NetAffx verkkosivuilla (https://www.affymetrix.com) [63]. Mikrosiruanalyysi (n = 2 per ryhmä) suoritettiin käyttäen Partek Genomics Suite versio 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Raakadata (CEL-tiedostot) normalisoitiin käyttäen vankka multichip keskiarvon (RMA) algoritmin ja analysoitiin

t

testejä. Analyysi toiminta ja biologinen mekanismi differentiaalisesti ilmentyvien geenien suoritettiin käyttäen kekseliäisyyttä Pathway analyysi (IPA) ohjelmistoversio 7.5; pistemäärä 3 tai enemmän pidettiin tilastollisesti merkitsevä (

P

0,01) käsinkirjoittaa tiedot. Olemme esittäneet array tiedot GEO tietokantaan, ja sarja ennätysmäärä on GSE33620.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

eksoni array saadut tiedot käyttämällä Partek ohjelmistoja ja IPA tietokanta varmistettiin qRT-PCR. pylori

infektio.