Krooninen sairaus

tiivistelmä

galektiini-9 on laajalti ilmaisi proteiini, joka on mukana immuuni asetus ja tumorpathogenesis ja toimii markkerina huonoon ennusteeseen eri syöpiä. Kuitenkin kliininen vaikutus ja tarkka mekanismi, jolla tämä proteiini osallistuu paksusuolen kasvaimen etenemistä ovat epäselviä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet ekspressiota galektiini-9 ja CD56-soluihin käyttäen immunohistokemia. Spearmanin listalla korrelaatio käytettiin selvittämään yhdistyksen välillä galektiini-9 ilmaisun ja (NK) solujen tunkeutuminen. Vaikutus galektiini-9 NK-92 solumigraatio arvioitiin in vitro käyttäen siirtokuoppaan kemotaksismäärityksiä. Rooli rh-galektiini-9 in F-aktiini polarisaation NK-92-soluissa tutkittiin Laserskannauksella konfokaalimikroskopia. Osoitimme, että galektiini-9 ilmentyi 101 (78,91%) paksusuolen kasvain kudosten ja jotka ilmaistiin alemmilla tasoilla näissä kudoksissa kuin para-tuumorikudoksissa. Alhainen galektiini-9 ilmentyminen korreloi positiivisesti huonon histologinen arvosana ja imusolmuke etäpesäke (P 0,05). Kaplan-Meier menetelmällä ja Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysi osoitti, että kokonaiselossaoloaika oli pidempi potilailla, joilla on korkea galektiini-9 ilmaisun 8 vuoden seurannan (P 0,05). Spearmanin listalla korrelaatio osoitti, että oli lineaarinen korrelaatio galektiini-9 ilmaisun ja CD56

+ NK-solujen infiltraatiota (R

2 = 0,658; P 0,0001). Galektiini-9 kannustanut maahanmuuttoa ihmisen NK-92-solujen vaikuttamalla F-aktiini polarisaation kautta Rho /ROCK1 signalointireitin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että galektiini-9 ilmaisun mahdollisesti edustaa uutta mekanismi kasvainten paeta immuunivalvonnan paksusuolen kasvaimissa.

Citation: Wang Y, Sun J, Ma C, Gao W, Song B, Xue H, et al. (2016) Vähentynyt ilmentyminen galektiini-9 edistää Huonon lopputuloksen Colon Cancer estämällä NK Cell Kemotaksia Osittain läpi Rho /ROCK1 signalointireitin. PLoS ONE 11 (3): e0152599. doi: 10,1371 /journal.pone.0152599

Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

vastaanotettu: 21 joulukuu 2015; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2016; Julkaistu: 30 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) ja Xun Qu (No. 31470885, 31270971, 81.072.406); National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) Jintang Sun (nro 31300752); National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) ja Qianqian Shao (nro 81300510); ja National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) ja Meixiang Yang (nro 30901326).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Joka vuosi noin 1,2 miljoonaa potilasta kehittää peräsuolen syöpä (CRC) ja 600000 yksilöiden kuolee tähän tautiin ympäri maailmaa [1]. Huolimatta siitä, että on tapahtunut myönteistä parannuksia kirurgisten ja lääkealan strategioihin, CRC vielä läheskään terapeuttinen ohjaus [2]. Esillä niukasti tietämyksen immunologista ja molekyylitason syitä CRC on merkittävä este parantamiseen hoitoja tähän disease.Hence tunnistaa uusia biomarkkereita on tarpeen tulevan kehityksen kohdennettuja CRC hoitoja.

syövän kehittymisen on monivaiheinen prosessi, jota ohjaa paitsi lukuisat solun sisäisiä piirteitä, mutta myös ulkoisten tekijöiden kasvaimen mikroympäristössä [3, 4]. Koska tärkeä osa kasvaimen microenvironment, tietyntyyppisten valkosolujen vaikuttaa taudin etenemiseen ja ennusteeseen [5-7]. Luonnollisten tappajasolujen (NK-solut) ovat yksi tärkeimmistä solutyyppejä luonnollinen immuniteetti. CRC, laaja kasvaimeen infiltraatio NK-solujen liittyy parempi ennuste, riippuen niiden sytotoksisia vaikutuksia syöpäsolujen [8, 9]. Kuitenkin viime tutkimuksessa todettiin, että NK-solut ovat yleensä vähenevät CRC microenvironment kuin viereisissä normaalin limakalvon läsnäolosta huolimatta suhteellisen paljon NK solun vastaamisen kemokiinien tuumorikudoksissa [10]. Tämä ristiriita ehdotti, että kemokiinien ei välttämättä yksin riitä rekrytoida NK-soluja kasvaimen.

Galectins ovat liukoisia jäseniä lektiinin superperheen, joille on tunnusomaista, että läsnä on hiilihydraatin tunnustamista domeenin ja β-galaktosidaasi-sitoutumisaffiniteetti. Kaikkiaan 15 nisäkkäiden galectins ole toistaiseksi tunnistettu [11]. Näistä galectins, galektiini-9 esittelee immunoregulatorisia vaikutuksia, joiden kautta se häiritsee toiminta ja biologista käyttäytymistä eri immuunisolujen, mukaan lukien T-solut, dendriittisolut ja NK-solujen [12, 13]. In on kasvain, galektiini-9 lisäsi NK solujen vatsakalvon eritteen [14], mikä osoittaa, että sillä on potentiaalia sääntelyrooli, johon NK-solujen aikana syövän etenemiseen. Erityisesti alhaisempi galektiini-9 on havaittu useimmissa syöpäsolujen, mukaan lukien suun okasolusyöpä [15], melanooma [16], rintasyöpä [17] ja mahasyövän [18], kuin normaalia kollegansa . Koska tiiviin galektiini-9 ilmaisun ja NK-solujen määrä, on kohtuullista spekuloida, että määrää alennetaan galektiini-9 kasvaimen edistää huono tunkeutuminen NK-solujen kasvaimeen microenvironment. Koska läsnäolo ja merkitys galektiini-9 ilmaisun ei ole vielä osoitettu paksusuolensyöpä kudoksissa, jää epäselväksi, onko tämä yhdistys esiintyy paksusuolen syövän ja mitä sääntelymekanismeja ovat mukana, jos sellainen on.

esillä olevassa tutkimuksessa havaittiin, että galektiini-9 ilmentyminen väheni paksusuolen tuumorikudoksissa, joka liittyy huonoon ennusteeseen näillä potilailla. Tarjoamme myös näyttöä käyttämällä

in vitro

tutkimuksissa että galektiini-9 tehostaa NK migraatiota kohdistamalla vaikutukset F-aktiini polarisaation kautta Rho /ROCK1 signalointireitin. Nämä tulokset ovat mahdollinen uusi mekanismi, jonka avulla kasvaimet saattavat paeta immuunivalvonnalta.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosten

Tutkimuksessa oli mukana tiedot, jotka on saatu 128 potilasta histologisesti vahvistettu paksusuolen syövän joille tehtiin leikkaus Qilu sairaalan Shandongin yliopistossa tammikuusta 2004 joulukuu 2011 (Jinan, Shandong, Kiina), tämä myös yksi ryhmä 38 potilasta, joilla vertasimme para-kasvain kasvainkudoksen ja toinen ryhmä 90 potilasta osallistui selviytymisen analyysiin. Kerääminen ja käyttö kudosnäytteiden noudatettu asiaa koskevien suuntaviivojen ja institutionaaliset käytännöt eettisen komitean Qilu sairaalan Shandongin yliopistossa, ja kirjallinen hyväksyntä saatiin jokaisessa tapauksessa ennen kudosnäyte kokoelma. Eettinen komitea Qilu sairaalan Shandong University hyväksynyt tämän tutkimuksen (Kyll-2013-069). Keskeiset kliinis tiedot on esitetty taulukossa 1 ja täydentävä Materiaalit ja menetelmät (S1 File).

immunohistokemia ja arviointi

pääluokat (4 pm) formaliinilla kiinnitetyt parafinoidut paksusuolen kasvain kudosnäytteitä poistettiin vaha, vedettömät, ja inkuboitiin seuraavat primaaristen vasta-aineiden: kanin polyklonaalista anti-ihmisen galektiini-9 (sc-366141, 1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ja hiiren monoklonaalinen anti- ihmisen CD56 (3576, 1:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Leikkeitä jälkeen värjättiin vastaavaan toissijaisen vasta-aineita. Kaksi itsenäistä patologia jotka sokaissut kliinisten tietojen, arvioitiin immunohistokemiallisella tuloksia. Menetelmää käytetään arvioimaan kudosten on kuvattu täydentävä Materiaalit ja menetelmät (S1 File).

Solut ja hoitoja

Soluja inkuboitiin standardin mukaisesti kuvatut ATCC kulttuurin opas. Ihmisen paksusuolen kasvainsolulinjat SW480, SW620 ja HT29 kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Invitrogen, USA), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FCS) (Bio International, USA). Ihmisen NK92 solulinja oli lahja toinen Military Medical University (Shanghai, Kiina) [19] ja viljelty Alpha Minimum Essential Medium (Gibco, USA), joka sisälsi 2 mM L-glutamiinia ja 1,5 g /l natriumbikarbonaattia mutta ilman ribonucleosides ja deoksiribonukleosidit, ja eri osien lisättiin saada täydellistä kasvualustaa: 0,2 mM inositolia (17508, Sigma, USA); 0,1 mM 2-merkaptoetanoli (ES-007E, Merck Millipore, Saksa); 0,02 mmol foolihappoa (F8758, Sigma, USA); 100-200 U /ml yhdistelmä-DNA-IL-2; ja säätö lopulliseen konsentraatioon 12,5% hevosen seerumia (16050, Gibco, USA) ja 12,5% naudan sikiön seerumia. Kaikki soluja inkuboitiin 5% CO

2 standardin mukaisesti menettelyjä ATCC kulttuurin opas.

eristäminen ihmisen NK-solujen

Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) saatiin sen jälkeen, kun sentrifugoimalla Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Ruotsi). NK-solut eristettiin käyttäen NK Cell Isolation Kit (MiltenyiBiotec, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Puhtaus CD3

-CD56

+ solujen johdonmukaisesti yli 95%, mitattiin virtaussytometrianalyysin.

RNA-interferenssi

transfektoitiin siRNA ihmisen galektiini-9 (siRNA # 378 ja siRNA # 690, GenePharma, Shanghai, Kiina) tai scramble siRNA osaksi HT-29-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Knockdown tehoa siRNA: iden kohdistaminen galektiini-9 tutkittiin käyttäen RT-PCR, western blot-analyysi ja ELISA 36 h transfektion jälkeen. Seuraavat siRNA sekvenssit kohdistaminen ihmisen galektiini-9 käytettiin:

siRNA378: sense, 5′-GGAAGACACACAUGCCUUUTT-3 ’; antisense, 5’-AAAGGCAUGUGUGUCUUCCTT-3 ’; ja siRNA 690: sense, 5’-CCAUUACCCAGACAGUCAUTT-3 ’; antisense, 5’-AUGACUGUCUGGGUAAUGGTT-3 ’.

migraatiokokeessa

Käytimme siirtokuoppaan kammiot on 5 mm: n huokosten kalvo (Costar, Corning, NY, USA). NK-92 soluja tai ensisijainen NK solut levytettiin alkuun kammioissa. Colon kasvain soluviljelmäsupernatantissa tai vaihtelevia pitoisuuksia rh-galektiini-9 (2045-GA-050, R 0,001, kuvio 1 D).

galektiini-9 ilmaisun paksusuolen kasvain ja para-kasvain kudosnäytteet havaittiin käyttäen immunohistokemiallisesti käyttäen isotyyppikontrolli (A) tai anti-galektiini-9-vasta-ainetta (B). (C), edustaja galektiini-9

korkea (vasemmalla) ja galektiini-9

pieni (oikealla) ilmentyminen kasvainten ja para-tuumorikudoksia. (D), graafinen kuva tilastollisen jakauman galektiini-9 ekspressiotasot 38 paksusuolensyöpä kudokset ja niiden vastaavia normaalin limakalvon näytteitä. Ilmaisu intensiteetti edustettuna histologinen pistemäärä (Σpi), jossa p on prosenttiosuus galektiini-9 positiiviset syöpäsolut (pisteytettiin 1, 1-10%, 2, 11-50%, 3, 51-80%; tai 4, 81-100%) ja i edustaa värjäyksen intensiteettiä (pisteytettiin 0, mitään värjäytymistä, 1, heikkoa värjäytymistä, 2, kohtalainen värjäytyminen tai 3, voimakas värjäytyminen). Strong (++++), kohtalainen (+++), lievä (++), heikko (+) ja negatiivinen (-) värjäys olivat 10-12, 7-9, 4-6, 1-3 ja 0, vastaavasti.

galektiini-9 ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin paksusuolen syöpäpotilaiden

selvitimme ennustetekijöiden arvo galektiini-9 paksusuolensyöpä. Kaikkiaan 90 paksusuolensyöpä tapaukset ja niiden osakkuusyritysten kliiniset ja selviytymisen tietoja analysoitiin määrittämään roolia galektiini-9 ilmaisun. Joka perustuu mediaani havaittu tasojen galektiini-9, paksusuolen kasvain potilaat jaettiin alhainen (0-1, n = 39) ja korkea (2-4, n = 51), joka ilmaisee ryhmiä. Merkittäviä eroja havaittiin galektiini-9 ilmentymistä mukaan TNM, imusolmuke etäpesäke, ja histologisia laatu, mutta ei sukupuoleen, ikään, ordistant etäpesäkkeitä (taulukko 3).

Univariate analyysi kliinis tekijöiden ilmoitti, että varhainen TNM (I /II) eikä imusolmuke etäpesäke (N-) liittyivät merkittävästi hyviä tuloksia (P = 0.001and P = 0,001, tässä järjestyksessä). Erityisesti korkean galektiini-9 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä hyvään säilymiseen (riskisuhde (HR): 0,483; 95%: n luottamusväli (CI): 0,269-0,867; P = 0,015) (taulukko 4). Mediaani elossaoloaika potilailla, joilla galektiini-9

korkea ja galektiini-9

alhainen olivat 87 ja 34 kuukautta. Eloonjäämiskäyrät on esitetty kuviossa 2A (log-rank-testi, P = 0,012). Tulokset Kaplan-Meier analyysit olivat yhdenmukaisia ​​yhden muuttujan analyysi (kuvio 2B ja 2C). Lisäksi kokonaiselossaoloaika oli parempi potilailla, joilla on hyvin maltillinen eriyttäminen oli parempi kuin huonosti eriytetty tapauksissa, mutta tämä yhdistys ei saavuttanut merkitystä (kuvio 2D, P = 0,051).

Kaplan-Meier -käyrät näkyvät kuvaamaan suhdetta galektiini-9 ilmaisun ja kokonaiselossaolo (A), imusolmuke etäpesäke ja kokonaiselossaolo (B), TNM ja kokonaiselossaolo (C), ja histologinen erilaistumista ja kokonaiselossaolo (D). Näytettä (n = 90). Galektiini-9

korkea ilme, ei imusolmuke etäpesäke ja TNM-luokitus (I /II) todettiin ennakoida pidempiä elossaoloaika (P 0,05, log-rank-testi).

Lisäksi riippumattomiin parametreihin, todettiin merkittäviksi yhden muuttujan analyysiin, kuten TNM ja galektiini-9 ilmaisun, käytettiin sitten toisessa monimuuttujamenetelmin. Tulokset viittasivat siihen, että galektiini-9 ilmentymisen paksusuolen kasvaimen kudoksissa (HR: 0,549, 95% CI: 0,303-0,995, P = 0,048) ja TMN vaihe (HR: 2,371, 95% CI: 1,306-4,304, P = 0,005) olivat riippumaton prognostisia markkereita, jotka osoittavat, että galektiini-9 ilmentymisen paksusuolen kasvaimen kudokset on positiivinen prognostinen tekijä eloonjäämiseen (taulukko 4).

suhde tiheyden CD56

+ NK-solut ja galektiini-9 ilmentymisen CRC kasvainsoluissa

vieressä tutkineet soluttautuminen CD56

+ NK solut paksusuolensyöpä kudoksissa ja sen yhdessä galektiini-9 ilmaisun. CD56

+ soluja havaitaan paksusuolisyöpäsolulinjassa pesiä, paksusuolen rauhaset ja strooman (kuvio 3A). Mediaani määrä CD56

+ soluja oli 0,3 (vaihteluväli 0,0 ~ 26,6) per yksi korkean tehon kenttä (HPF) paksusuolen kasvainkudoksessa ja 16,25 (vaihteluväli: 0,0-42,4) para-tuumorikudoksissa.

(A), CD56 ekspressiota havaittiin paksusuolessa kasvaimen ja para-kasvainkudoksen näytteitä (38 tapausta), käyttäen immunohistokemia, jossa on anti-CD56-vasta-aineen tai isotyyppikontrolli. Nuoli osoittaa NK-solut; Paneelit viittaavat numerot CD56

+ NK-solut, jotka havaittiin jokaisessa mikroskooppisen alalla kasvain ja para-tuumorikudoksia. (B), edustaja kuvia ilmentävien kasvainten korkea tai matala määriä galektiini-9 (ylhäällä) ja CD56 (alla) samassa paikassa. (C), Paneelit osoittavat numerot CD56

+ NK-solut, jotka havaittiin jokaisessa mikroskooppisen alan galektiini-9

korkea tai galektiini-9

alhainen kudosnäytteitä. (D), korrelaatio galektiini-9 ja CD56 ilmaisun kudosnäytteistä.

Sitten analyysi kliinistä merkitystä NK-solujen 38 paksusuolensyöpä potilaille. Joka perustuu mediaani NK-solujen infiltraatio paksusuolen kasvain potilaat jaettiin negatiivisia ja positiivisia ryhmiä. Merkittäviä eroja havaittiin NK-soluissa soluttautuminen mukaan TNM (taulukko 5).

määrä CD56

+ solutunkeutumisen oli merkitsevästi korkeampi para-kasvain kudosten kuin kasvainkudoksissa (P alue 0-42,4 vs. 0-0,8; P 0,0001) (kuvio 3B ja 3C). Galektiini-9 ilmentyminen korreloi merkitsevästi CD56

+ NK-solujen tunkeutuminen paksusuolen syövän ja para-kasvain näytteet (P 0,0001, R

2 = 0,658, kuvio 3D) B

galektiini-9 lisääntyi kemotaksista ihmisen NK-solujen

Näiden tulosten perusteella voidaan yhdistää toisiinsa galektiini-9 ilmaisun ja NK-solujen tunkeutuminen paksusuolen syövän kudosta. Vaikutukset galektiini-9 NK-solut seuraavaksi tutkittiin in vitro. Ensin tutkitaan, onko eritystä galektiini-9 kasvainsoluista oli kemotaktinen vaikutus maahanmuuttoon NK-soluissa. Näissä kokeissa, määritimme tason galektiini-9 ilmentymisen 3 koolonsyöpäsolulinjoissa, mukaan lukien SW480, SW620 ja HT29, käyttäen qRT-PCR: ää ja western blot-analyysi. Tulokset osoittivat, että HT29-solujen oli korkein galektiini-9-ilmentymisen määrä näistä 3 solulinjoissa (kuvio 4A ja 4B), ja nämä solut valitaan näin ollen seuraavan testin. Suunnittelimme siRNA kaataa galektiini-9 ilmaisun HT29. Kuten on esitetty kuviossa 4C-4E, galektiini-9 mRNA: n, ja proteiinin tasot ja pitoisuus galektiini-9 viljelmän supernatantissa laski merkittävästi kahden eri siRNA-sekvenssejä, siRNA # 378 ja siRNA # 690. Mielenkiintoista on, että HT-29 viljelmäsupernatanteista indusoi merkittävästi parannettu kemotaksista NK-92-soluja, jotka ovat CD56

+ ihmisen NK-soluja [19]. Nämä vaikutukset HT-29-supernatantteja NK-92 kemotaksista merkittävästi kumota lisäämällä galektiini-9 siRNA: t # 378 ja # 690 ryhmien (kuvio 4F) .Tämän jälkeen käyttäen toista koolonkarsinoomasolulinja SW620, me jatkuvasti havainneet, että galektiini-9 erittyy SW620 oli myös kemotaktinen vaikutus NK-92-solujen muuttoliike (S1 Kuva).

galektiini-9 ilmentymistä tutkittiin paksusuolen tuumorisolulinjoja (HT29, SW480 ja SW620) käyttäen qRT- PCR (A) ja western blot-analyysillä (B). HT29 jaettiin 5 ryhmään: kontrolliryhmään (viljeltiin vain väliaine), joka on lipo ryhmä (käsitelty Lipofectamine 2000), NC ryhmä (transfektoitu negatiivisen controlsiRNA), joka on galektiini-9-siRNA (# 378) ryhmä ja galektiini-9-siRNA (# 690) ryhmässä. Knockdown efficacies siRNA: iden kohdistaminen galektiini-9 tutkittiin käyttäen qRT-PCR (C) ja western blot-analyysi (D). * P 0,05 vs. kontrolli. (E), galektiini-9 eritys tasot mitattiin eri ryhmiin käyttämällä galektiini-9 ELISA. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ja SEM neljänä kokeissa. * P 0,05 vs. kontrolli. (F), kemotaksiksen NK-92-solujen vasteena HT29 supernatantteja käsiteltiin galektiini-9 siRNA; * P 0,05 vs. kontrolli, ja # P 0,05 vs. NC. Analysoimme kemotaksista NK-92-solujen vasteena eri pitoisuuksilla galektiini-9 (G). Siirtymästrategia indeksi (MI) käytettiin muodostavat suuren määrän satunnaisesti muuttoliikkeen joka tapahtui NK-soluissa. IL-12: ta käytettiin positiivisena kontrollina aloittamista kemotaksista NK-92-soluja. * P 0,05 vs. kontrolli, ** P 0,001 vs. kontrolli. Edustavat tiedot esitetään ainakin 3 kokeesta.

Seuraavaksi tutkittiin, galektiini-9 on kemoattrak- NK-soluja. Näissä kokeissa eri annoksilla rh-galektiini-9 analysoitiin sen määrittämiseksi, galektiini-9: n kemotaktinen vaikutus NK-92-soluja. Tulokset osoittivat, että 25 ja 50 ng /ml rh-galektiini-9 indusoi kemotaksista NK-92-soluissa mutta ero ei ollut merkitsevä. Pitoisuutena 100 ng /ml, NK-92 solumigraation on erityisesti lisääntynyt koko transwell kalvon noin 2-kertaisesti (P ​​ 0,001, verrattuna kontrolliin, kuvio 4G).

galektiini-9 edistää F-aktiini uudelleenjärjestelyjä NK-soluissa tehostamalla Rho perhe ilmentymistä NK-soluissa

Lymfosyytit vuosina suuria tukirangan uudelleenjärjestelyjä aikana solu migration.The pieni GTPaasina Rho on keskeinen säätelijä aktiinisytoskeletonin, ja Rho-kinaasi, joka on myös tunnettu Rho liittyvän kiertynyt kierre kinaasin (ROCK), on Rho efektoriproteiini. Arvioida osallistuminen Rho /ROCK on transmigraatioon NK-solujen kemotaksis määritykset suoritettiin, kun läsnä on hyvin tunnettu ROCK estäjä, Y27632, ja toinen Rho-spesifinen estäjä, C3 transferaasin. Tulokset osoittivat, että Y27632 ja C3 transferaasin esti merkittävästi NK-92 solumigraation (kuvio 5A).

(A), Kemotaksia inhiboi Rho ja ROCK estäjillä NK-92-soluja. NK-92-soluja stimuloitiin käyttäen pelkästään väliainetta 4 h tai alustassa, joka sisälsi Y27632 (20 uM) tai C3 transferaasin (2 ug /ml) 1,5 tuntia. Siirtymästrategia indeksi (MI) käytettiin muodostavat suuren satunnainen migraation havaittiin NK-soluja. * P 0,05 vs. kontrolli. (B), ekspressio RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ ja RhoT1 mRNA käyttäen RT-PCR: NK-92-solut, jotka inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa rh-galektiini-9 konsentraationa 100 ng /ml: ssa 4 h; * P 0,05 vs. kontrolli. (C), ilmentyminen ROCK1 proteiinin NK-92-solut, jotka inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa rh-galektiini-9 konsentraationa 100 ng /ml 24 tuntia. (D), edustaja micrographs NK-92-solut, jotka inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa rh-galektiini-9 konsentraationa 100 ng /ml: ssa 4 tuntia. F-aktiini värjättiin rodamiinileimattu phalloidin (punainen), ja solujen tumat leimattiin DAPI (sininen) (630 x). Edustavat tiedot esitetään ainakin 3 kokeesta.

Edellä esitetyt tulokset osoittivat, että galektiini-9 säätelee NK solujen vaeltamiseen. Siksi tutkimme seuraavaksi vaikutuksia rh-galektiini-9 Rho lähisuhdeväkivallan molekyylien NK-soluissa. Tulokset osoittivat, että rh-galektiini-9 lisäsi merkittävästi ekspressiota useiden jäsenten Rho perheen, mukaan lukien RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, ja RhoT1 (kuvio 5B). Kuten on esitetty kuviossa 5C, ROCK1 proteiinin tasot olivat merkittävästi säädelty NK-soluissa, jotka oli stimuloitu rh-galektiini-9 24 h.These tulokset viittasivat siihen, että galektiini-9 säätelee erilaisia ​​Rho perheen molekyylien NK-soluissa.

seuraava tutki galektiini-9 vaikutteita uudelleenjärjestelyjä F-aktiinitukiranka NK-92-soluja. NK-92-soluja käsiteltiin rh-galektiini-9 konsentraationa 100 ng /ml: ssa 4 tuntia, ja muutokset F-aktiini polymerointi NK-92-soluja sen jälkeen tutkittiin. Kontrolliryhmässä, F-aktiini NK-92 solut muodostivat erillisen phalloidin petsattu rengas solukalvon. Käsittelyn jälkeen rh-galektiini-9, F-aktiini tuli yhteen toiseen päähän solun, kuten on esitetty kuviossa 5D.

galektiini-9 vahvistaa ensisijainen NK-solujen kemotaksista

Jotta edelleen vahvistaa tuloksemme, teemme tärkein kokeissa ensisijainen NK-soluissa. Tulokset osoittavat, että migraatio ensisijaisen NK-solujen voidaan vaikuttaa molempien galektiini-9 erittämä HT29 (kuvio 6A) tai rh-galektiini-9 (kuvio 6B). Rho ja ROCK-inhibiittorit estävät kemotaksista ensisijaisen NK-solujen (kuvio 6C). Lisäksi, rh-galektiini-9 myös lisätä ilmentymistä Rho perhe (kuvio 6D) ja ROCK1 (kuvio 6E).

Kemotaksia primaaristen NK-solujen vastauksena HT29 supernatantteja käsiteltiin galektiini-9 siRNA (A ) tai vaihtelevia konsentraatioita galektiini-9 (B). Siirtymästrategia indeksi (MI) käytettiin muodostavat suuren määrän satunnaisesti muuttoliikkeen tapahtuneen ensisijainen NK-soluja. IL-12: ta käytettiin positiivisena kontrollina aloittamista kemotaksista ensisijaisen NK-soluja. * P 0,05 vs. kontrolli. Ja # P 0,05 vs. NC. (C), kemotaksiksen inhiboitui Rho ja ROCK-inhibiittorit ensisijainen NK-soluja. Ensisijainen NK-soluja stimuloitiin käyttäen pelkästään väliainetta 4 h tai alustassa, joka sisälsi Y27632 (20 uM) tai C3 transferaasin (2 ug /ml) 1,5 tuntia. * P 0,05 vs. kontrolli. (D), ekspressio RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ ja RhoT1 mRNA käyttäen RT-PCR: llä ensisijainen NK-solut, jotka inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa rhGalectin-9 konsentraationa 100 ng /ml 4 h; * P 0,05 vs. kontrolli. (E), ilmentymistä ROCK1 proteiinin ensisijainen NK-solut, jotka inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa rhGalectin-9 konsentraationa 100 ng /ml 24 tuntia. Edustavat tiedot esitetään ainakin 3 kokeesta.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että galektiini-9 ilmaisu on pienempi paksusuolen kasvainkudoksessa kuin vastaavissa normaaleissa kudoksissa ja galektiini-9 arvot liittyvät NK-solun infiltraatiota ja potilaan selviytymistä. In vitro tutkimukset osoittivat, että galektiini-9 lisääntyi NK-solujen rekrytointi kohdistamalla vaikutukset Rho /ROCK1 ilmaisun ja F-aktiini polarisaatio. Siksi olemme tunnistaneet uuden mekanismin, jolla galektiini-9 vaikutteita NK-solujen rekrytointi aikana paksusuolen kasvainten kehittymiseen, ja tämä lisää nykytietomme molekyyli- osallistumista galektiini-9 kasvaimen immuniteetin.

galektiini-9 on havaittiin olevan alassäädetty erilaisissa kasvaintyypeissä, kuten melanooman [16], kohdunkaulan okasolusyöpä [23], rintasyövän [24] ja maksasyövän [25], ja se mahdollisesti toimii kliinisesti merkitsevä biomerkkiainevaste ennustamaan tuloksia näillä potilailla. Kuitenkin vähän tiedetään liittyvät yksityiskohdat ilmentymisen galektiini-9 paksusuolensyöpä kudoksissa. Tuloksemme osoittavat, että vaikka suurin osa koolonkarsinoomasoluissa ilmentävät galektiini-9 sekä positiivisia korko ja ilmentymisen taso on alhaisempi näissä kudoksissa kuin normaalissa paksusuolen kudoksiin. Kasvaimissa, suurempi galektiini-9: n ilmentyminen liittyy varhaisen TNM-luokitus, ei imusolmuke etäpesäke, hyvä histologisia erilaistumista, ja pidempi elinaika kertaa. Mikä tärkeintä, nämä tulokset viittaavat siihen, että tämä proteiini saattaisi olla lupaava biomarkkereiden selviytymisen potilailla, joilla on paksusuolen kasvaimia.

The effects of galektiini-9 kasvaimissa ovat monimutkaisia, jotka ovat sekaantuneet monessa suhteessa myös kasvainsolujen tarttumisen [15] , apoptoosin ja solusyklin [16], muuttoliikettä [26], ja angiogeneesi [27]. Lisäksi on raportoitu, että galektiini-9 kohdistama immunoregulatorisia rooleja kasvaimen mikroympäristössä. Tulokset osoittivat, että galektiini-9 aiheuttama makrofagien erilaistumaan plasmasolumaisiin dendriittisolujen kaltainen makrofageissa [14, 28], mikä lisäsi Tim-3

+ dendriittisolujen ja CD8

+ T-solujen [29].