Krooninen sairaus

tiivistelmä

merkitys uudissuonittumisen ala- ja metastaattista kasvaimen kasvua edistetään useissa kliinisissä tutkimuksissa angiogeneesiestäjät joko yksinään tai yhdessä tavanomaisten antineoplastisten hoitojen. Yksi haaste, jossa käytetään molekulaarisesti kohdennettujen aineita on ollut katkaisun välillä pienentäminen ja kasvaimen biologinen käyttäytyminen, joko silloin, kun lääke on tehokas tai kun kasvain vastus syntyy. Täällä raportoimme synteesi ja karakterisointi

64Cu-NOTA-bevasitsumabi kuin PET kuvantamisen agentti kuvantaminen kasvaimensisäistä VEGF pitoisuus in vivo.

64Cu-NOTA-bevasitsumabi innokkaasti kertynyt 786-O munuaisten ksenografteja melko pienet isännän elimissä. RAD001 (everolimuusi) selvästi heikennettyä

64Cu-NOTA-bevasitsumabi kertymistä sisällä 786-O munuaisten ksenografteja. Kasvainkudoksen ja solujen molekyylitason analyysi validoitu PET kuvantaminen, jotka osoittavat vähenemistä kokonais ja erittävät VEGF sisältöä ja VEGFR2 aktivointi. Erityisesti

64Cu-NOTA-bevasitsumabi PET kuvantaminen oli yhtäpitävä kasvun pidättämiseen RAD001 kasvaimia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että immunoPET kohdistaminen angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF voisi olla uuden luokan sijaismarkkereiden täydentää RECIST kriteerit saaneilla potilailla molekyylirakennetta suunnattu hoitoja.

Citation: Chang AJ, Sohn R, Lu ZH, Arbeit JM , Lapi SE (2013) havaitseminen Rapalog välittämää terapeuttinen vaste Munuaisten Cancer ksenoqraftit käyttäminen

64Cu-bevasitsumabi ImmunoPET. PLoS ONE 8 (3): e58949. doi: 10,1371 /journal.pone.0058949

Toimittaja: Alexander J. Annala, City of Hope, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 11 helmikuu 2013; Julkaistu: 14 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI R01CA159959, Beatrice Roe urologian Research Fund, ja Mallinckrodt laitos radiologia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Angiogeneesi, kasvua uusien verisuonten, on tunnusmerkki syövän edistää kasvaimen kasvua, invaasio, ja etäpesäkkeiden [1]. Orastava kasvaimet tukevat happea ja ravinteita läheisiltä verisuonia, mutta koska kasvain kasvaa, verenkiertoa tulee riittämättömäksi ja useat signalointireitteihin stimuloida uudissuonittumisen laajennus [2]. Neovessels voivat myös toimia kasvaimen metastaattinen kanavien [2]. Näennäinen merkitys uudissuonittumisen ala- ja metastaattista kasvaimen kasvua edistetään lukuisia angiogeneesinestäjän kliinisissä tutkimuksissa joko yksinään tai yhdistelmänä tavanomaisten antineoplastisten hoitojen [3], [4]. Nämä aineet viivästynyt kasvaimen kasvua alkuvaiheen parannuksia terapeuttisen tehon verisuonitauteihin liittyvän verkon normalisoitumisen [4]. Kuitenkin kaikki potilaat reagoi antiangiogeenisen hoidon ja kestävyys lähes poikkeuksetta kehittyy huolimatta alkuperäisen parannus. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että angiogeneesi-inhibiittorit lisäävät kasvainten invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [5], vaikka tämä kliininen aggressiivisuus parannus on vielä selvästi havaittavissa potilailla. Sinänsä ymmärtää paremmin rajoitukset ja hankitun resistenssin angiogeneesiin estäjien on tarpeen. Testaus hoito aiheuttama angiogeenisen tekijän erityksen väheneminen tarjoaa lupaus varhaisen tunnistamisen vastaavista potilaista, ja nopea havaitseminen agentti-ominaisvastus syntymistä.

endoteelikasvutekijä (VEGF) on keskeinen rooli angiogeneesissä ja on tullut merkittävä terapeuttinen tavoite. VEGF: n ilmentyminen indusoidaan maligniteettien useilla mekanismeilla. Transkriptio- tasolla, VEGF on tärkeä tavoite heterodimeerisen hypoksian indusoima tekijä (HIFs) [6]. HIFs koostuvat, epävakaa alfa (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α) ja konstitutiivisesti beeta (HIF-1β) alayksiköstä [6]. Normaaleissa happiolosuhteissa, prolyyli ja asparaginyylitähteiden hydroksylaasit luoda sitoutumiskohdat E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla von Hippel Lindaun (VHL) proteiinin ja estävät HIF transkriptionaalisen aktiivisuuden, vastaavasti. Aikana hypoksia, happi-riippuvainen hydroksylaaseja estyy, HIF1 /2 transkriptiotekijöitä tasaantumisen ja angiogeeninen, aineenvaihdunnan, ja kantasolujen kohde- geenejä aiheuttama. Lisäksi VEGF, HIF transkriptiotekijöiden upregulate useita angiogeenisten tekijöiden [7]. Kuitenkin viime aikoina datan nondisease malli HIF-1 voitto toiminto osoittaa, että VEGF on tärkeintä uudissuonimuodostuksen induktion [8]. Kuten menetys VHL funktion taustalla selvää solun munuaissyöpä kehittäminen [9], nämä kasvaimet ovat erityisen hypervascular johtuvat HIFα-välitteisen induktion useiden angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien VEGF [6].

Lisäksi transkriptiotekijän yliekspression, The fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) reitti on rinnakkainen moduuli säätelevä HIF- ja VEGF-riippuvaista kasvainsolun angiogeenisen tekijän tuotanto [10]. PI3K reitti on hyperactivated useimmissa ihmisen syövissä, koska useita mekanismeja, [11]. Nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on seriini-treoniini-kinaasi myötäsuuntaan PI3K. mTOR asuu kahden komplekseja lokalisoitu erillisiä solunsisäisiin osastoihin ja jokainen jolla tiettyjä toimintoja [12], [13]. mTORC1 säätelee proteiinisynteesiä eri tasoilla kuten translaation aloitus- ja ribosomin biogeneesin [14]. HIFα alayksiköt ja VEGF ovat mTORC1 translaation tavoitteet, ja ovat toiminnallisia normoxic pahanlaatuisten solujen PI3K aktivointi [15]. mTORC2 moduloi useita solun ja toisen microenvironmental toimintoja kuten solujen eloonjäämistä, liikkuvuuteen, leviämisen, ja angiogeneesin välityksellä tavoitteensa AKT, SGK, ja PKC ja HIF-2α. Kuten PI3K ja mTOR ovat myös alavirtaan VEGFR2- pääasiallinen VEGF-reseptorin signalointi endoteelisoluissa [16], mTOR on potentiaalinen kaksi uudissuonittumisen toiminto sekä kasvaimen ja endoteelisolujen.

Koska sen lähellä kaikkialla voimistumista, siellä on ollut voimakasta kliinistä merkitystä mTOR koulutusjakson kohdistaminen kiinteässä syöpäsairauksia. Rapamysiini ja sen analogit, everolimuusille, temserolimus, ja deforlimus, (rapalogs), sitoutuvat syklofiliini, FKBP-12, joka muodostaa kompleksin estävää mTORC1 [17]. mTORC2 inhiboi pitkittyneen rapalog altistus joissakin solulinjoissa [18], mikä johtuu todennäköisesti juuri syntetisoidun mTOR sitominen aktiivinen rapalog komplekseja. Alkuvuodesta prekliinisissä tutkimuksissa, rapamysiini osoitettiin vähentävän sekä kasvaimen kasvua ja uudissuonittumisen [19]. Muissa prekliinisissä tutkimuksissa everolimuusi esti kasvaimen kasvua ja VEGF ilmaisun [17]. Johtuen lupaavia vaiheen III tehokkuutta koskevien tietojen, rapalogs on hyväksytty hoitoon metastasoituneen munuaissyövän (RCC) [20]. Kuitenkin terapeuttinen vastus joko on läsnä puhkeamista tai kehittää myös aikana rapalog hoidon [21]. Useat viimeaikaiset ja viime julkaisuissa on korostettu joko ohitusleikkaus signalointi, tai geneettinen voitto funktio mTOR loppupään tavoitteet [22] – [24].

Koska VEGF on alavirtaan mTOR aktivaatiomerkkiaine ja merkittävä tekijä angiogeneesin, sen ilmentymistaso voisi kelvata rapalog herkkyys merkki. Bevasitsumabi on humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu kaikkiin VEGF isoformien [25]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että radioleimattu bevasitsumabi voivat invasiivisesti kuvan ja määrällisesti VEGF ilmaisun [26] – [28]. Vaikka

64Cu-DOTA (1,4,7,10 tetra-1,4,7,10-tetraetikkahappoa) -bevacizumab osoitti lupaavia tuloksia prekliinisissä VEGF ksenografti kuvantamisen [28], tehostettu maksan kertyminen liittyy tunnettuja vivo epävakaus kupari-DOTA, motivoi meitä tutkimaan vakaampi kupari kelaatin. Viimeaikaiset työ Zhang

et al.

Käyttäen NOTA (1,4,7,10 tetraazacyclonoane-N, N ’, N ”, – trietikkahappo) kuin kelaatin

64Cu-bevasitsumabi kuvitettu paremmuuden tämän monimutkaisen PET kuvantamisen [29]. Täällä käytetään ja arvioidaan VEGF erityinen PET merkkiaineen

64Cu-NOTA-bevasitsumabi seurata muutoksia rapalog hallinnon. Me testattiin ensin kuvantaminen teho

64Cu-NOTA-bevasitsumabi munuaisten ksenografteja, kasvain on selviä VEGF yli-ilmentymisen. Seuraavaksi testasimme

64Cu-NOTA-bevasitsumabi kuin mTOR esto kasvaimen vastausindikaattorialueen. Tutkimuksemme osoittaa, että tämä vasta-aine konjugoituna PET merkkiaineen saattaa lopulta olla hyötyä sekä valita ja jatkaa potilailla molekyyli- hoitoja kohdistaminen erittyvän angiogeenisten kasvutekijöiden.

Materiaalit ja menetelmät

synteesi

64Cu -NOTA-bevasitsumabi

64Cu tuotettiin kautta

64Ni (p, n)

64Cu ydinreaktio käyttäen CS-15 syklotroni (syklotronia Corporation, Berkeley, CA) ja erotettu kautta ioninvaihdolla kuten on aiemmin kuvattu [30]. Bevasitsumabi (Avastin ™, Genentech /Roche, South San Francisco, CA) inkuboitiin 01:05 moolisuhteessa 2- (pisothiocyanatobenzyl) -1,4,7-triatsasyklono–1,4,7-trietikkahappo (SCN- Bz-NOTA) (Macrocyclics, Dallas, TX) 0,1 M NaHCO

3, pH 9,0 30 minuuttia. Saatu tuote, NOTA-bevasitsumabi, puhdistettiin Zeba Spin Desalting (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

64Cu oli kompleksoitu NOTA-bevasitsumabilla suhteessa 666 MBq /mg (18 mCi /mg) vasta-ainetta 0,1 M NH

4OAc-puskuria, pH 5,5 37 ° C: ssa 1 tunti sekoittaen jatkuvasti.

64Cu-NOTA-bevasitsumabi puhdistettiin käyttäen Zeba Spin Desalting (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ja radiokemiallinen puhtaus määriteltiin analyyttinen kokoeksk- (Superose 12 10/300 GL, GE Healthcare, Piscataway, NJ) kanssa 20 mM HEPES ja 150 mM NaCl (pH 7,3), jota eluoidaan virtausnopeudella 0,75 ml /min. Millenium 32 ohjelmisto (Waters, Milford, MA) käytettiin määrittämään kromatogrammit integroimalla.

64Cu-NOTA-bevasitsumabi inkuboitiin 37 ° C: ssa ihmisen seerumin 48 tuntia ja arvioitu vakautta siokromatografiaan.

radiomerkkiaineen absorptiokinetiikkaa

VEGF

165 (R Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ). Selvitetty kasvaimen lysaatit määrällisesti proteiinipitoisuus käyttäen BCA-määritystä (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Kokonaisproteiinista (120 ug) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin PVDF-kalvoille (Invitrogen, Carlsbad, CA), blokattiin 10% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,6), joka sisälsi 0,5% Tween 20 (TBST ), ja tutkittiin kanin vasta-aineita S6K

T389, S6K, AKT

S473, AKT, pVEGFR2

Y1175, VEGFR2 (kaikki 1:1,000, Cell Signaling Technology), kanan polyklonaalinen VEGF-vasta-aineen (1:2,500 Ab14078, Abcam), ja kanin polyklonaalista varten β-tubuliinin (1:35,000, Abcam). Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa, kalvot pestiin kolme kertaa TBST: ssä, inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä piparjuuriperoksidaasi-linked sekundaarisia vasta-aineita (1:5,000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja proteiinijuovat visualisoitiin ECL plus reagenssilla (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Proteiinimäärän normalisoitiin p-tubuliinia.

VEGF ELISA

786-O-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille solutiheyteen 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti, ja viljeltiin täydellisessä alustassa yli yön. Log-vaiheen soluja viljeltiin sitten seerumittomalla RPMI 1640-alustassa, jota oli täydennetty ajoneuvo (DMSO) tai 100 nM tai 1000 nM rapamysiini 6 tunnin ajan, väliaine korvattiin 2 ml: lla tuoretta seerumitonta alustaa, joka sisälsi ajoneuvon tai sama eri rapamysiini pitoisuudet, ja soluviljelmän supernatantti otettiin talteen 18 tuntia myöhemmin. Secreted VEGF-proteiinin kunnostetussa alustassa kvantitoitiin ELISA neljä itsenäistä kulttuureissa ryhmää kohti käyttämällä ihmisen VEGF Quantikine ELISA Kit (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

synteesi ja in vitro määritys

64Cu-NOTA-Bevasitsumabilla VEGF sitoutumisaffiniteetin

Koska edellinen -tutkimukset

64Cu-DOTA-konjugaattien osoitti korkea maksan radioaktiivisuuden kertyminen osoittaa potentiaalia transmetallation muihin proteiineihin in vivo [28], [31], päätimme käyttää NOTA joka muodostaa vakaampi kupari monimutkainen [32]. Bevasitsumabi konjugoitiin NOTA-Bz-NCS ja radioaktiivisesti

64Cu. Radioleimaus tehokkuus oli 92,1% ± 4,7%, radiokemiallinen puhtaus oli 98,1 ± 1,7%, ja spesifinen aktiivisuus oli noin 644 MBq /mg (17,4 mCi /mg) (n = 5 itsenäisestä kokeesta).

64Cu-NOTA-bevasitsumabi oli stabiili jopa 48 tuntia seerumissa 37 ° C: ssa ilman näkyviä hajoamistuotteiden kokoeksluusio- HPLC-analyysi.

Voit testata

64Cu-NOTA-bevasitsumabi VEGF spesifisyys immunoreaktiivisuus määritykset suoritettiin. VEGF

165 maljattiin kolmena kappaleena vähitellen pitoisuuksina 0,4-10 ug /ml. Sitoutuneen

64Cu-NOTA-bevasitsumabi prosentteina kokonaisaktiivisuus lisätty kohosi pitoisuuden noustessa 13,3 ± 0,72% 0,4 ug /ml VEGF

165-+34,4 ± 3,89% 10 ug /ml VEGF (Kuvio 1). Co-inkubointi 20 ug ylimäärä leimaamatonta bevasitsumabi merkittävästi vähentynyt

64Cu-NOTA-bevasitsumabi VEGF

165 sitoutumalla 2,04 ± 0,35% osoitetaan spesifisyys radioleimatun vasta-aineen immunoreaktiivisuus (kuva 1).

Lisääntynyt sitoutuminen

64Cu-NOTA-bevasitsumabia havaittiin konsentraation kasvaessa VEGF. Inhiboitavissa sitova salpaaminen 20 ug leimaamatonta Bevasitsumabin korostetaan merkkiaineen spesifisyys. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Bars osoittaneet ovat +/- keskihajonta.

64Cu-NOTA-Bevasitsumabilla bioleviäminen ja Imaging Osoittaa Enhanced Munuaisten kasvainpaikantumisen

Voit testata

64Cu-NOTA-bevasitsumabi aviditeetti on kasvain selvästi VEGF ilme, biologiseen jakaantumiseen tutkimukset suoritettiin kateenkorvattomissa nude hiirillä 786-O heterotooppi- korva kasvaimia kuva 2A ja B). Veressä kiertävän

64Cu-bevasitsumabi veressä oli 9,3 ± 3,8% injektoidusta annoksesta grammaa kohti (ID /g). Kasvain otto oli 22,0 ± 5,3% ID /g, kun taas lihas otto oli vain 1,1 ± 0,4% ID /g. Perna, keuhkot, maksa ja munuaiset otto oli myös matala, 5,8 ± 2,5%, 4,8 ± 1,7%, 5,6 ± 1,4%, ja 2,6 ± 0,6%, vastaavasti. Niinpä vaikka hiiret synnytti kaksi kasvaimia, yksi kuhunkin korvaan, sisäänottoa yhden korvan kasvain näytteet oli merkittävästi vahvaa verrattuna isäntä elimiin. Lisäämällä 100 ug esto annos leimaamatonta bevasitsumabi esti merkitsevästi tuumorin

64Cu-NOTA-bevasitsumabi oton osoittavat radiomerkkiaineen spesifisyys in vivo (kuvio 2A). Pieneläinten PET kuvantamisen osoittaneet korkea kasvaimeen oton

64Cu-NOTA-bevasitsumabilla (SUV 10,6) (kuvio 2B). Toisena testin spesifisyys, me annettiin 10-kertainen ylimäärä iv esto annoksella bevasitsumabia yhdessä

64Cu-NOTA-bevasitsumabi PET merkkiaineen. Merkitsemätön esto annoksen alenemisesta kasvainkudoksen oton kolminkertaiseksi (kuvio 2B). Merkillistä, esto annos kumotaan kasvain kuvan tunnistus (6,3 ± 2,1%), jossa on jäännössignaali peräisin verestä merkkiaineen allas (kuvio 2B).

(A) Hiiret 786-O munuaissyövän korva kasvaimet olivat iv ruiskutettiin 100 uCi

64Cu-NOTA-bevasitsumabilla (n = 4 hiirtä). 24 tuntia injektion valitse elimet ja kasvaimet kerättiin, punnittiin, ja määrä toimintaa kussakin kudoksessa arvioitiin gamma-laskurilla. Rappeutuminen korjattu% injektoidusta annoksesta (ID) /g kudosta laskettiin kullekin elin. Estävä annos 100 ug leimaamattoman bevasitsumabi merkittävästi ja nimenomaan vähensi kasvainten merkkiaineen sisäänottoa ilman havaittavaa vaikutusta isäntä elimeen merkkiaineen kertymistä. (B) Hiiret 786-O munuaissyövän korva kasvaimia annettiin 100 uCi

64Cu-NOTA-bevasitsumabi i.v. puuttuessa (vasen paneeli), tai läsnä ollessa (oikea paneeli), 100 ug leimaamattoman vasta. Kaksikymmentä min staattinen skannaukset hankittiin 24 tuntia injektion jälkeen.

RAD001 Vähentää Munuaisten kasvainkohdesolut fosforylaatio ja VEGF Content

Ennen testausta

64Cu-NOTA-bevasitsumabi PET hoitovasteen kuvantaminen, joka on ryhmä hiiriä käsiteltiin päivittäin RAD001, 10 mg /kg, tai ajoneuvon, määrittää rapalog n vaikutukset kasvaimen mTOR signalointi ja VEGF sisältöä. Neljäntoista päivän RAD001 tuotettu havaita fosforylaation mTOR erityisten treoniini 389 sivuilla ribosomaalisen proteiinin S6-kinaasi (kuvio 3). Toisin kuin aikaisemman työn ihmissolulinjoilla osoittavat rapalog negatiivista palautetta PI3K-mTORC2 induktio [33], oli 15% vähennys AKT fosforylaatio seriinillä 473 (Pakt

S473), joka on mTORC2 kohde, sopusoinnussa rapalog-mTOR sitomiseen [34]. RAD001 käsittely laski kasvainten VEGF-proteiinin ilmentymistä 60% ja samanaikaisesti 60%: n vähennys VEGFR2 fosforylaatio, periaate endoteelisolujen VEGF signalointi reseptoriin määritettynä normalisoinnin vastaavan tubuliinin lastaus kontrolleihin (kuvio 3A). Testata solun autonominen vaikutuksia rapalogs 786-O VEGF eritystä, väliaine rapamysiinistä ja ajoneuvojen-käsitellyissä viljelmissä analysoitiin VEGF sisältöä. Rapamysiini aiheutti 20% lasku erittää VEGF kontrolliin verrattuna (kuvio 3B). Tämä osittainen vaste 786-O-soluja voisi johtua kyvyttömyys rapamysiinin estää avaimen mTORC1 tavoitteet säätelevä käännös ”heikko mRNA: iden”, kuten 4E-BP1 [13] (kuvio 3). On olemassa useita selityksiä selvempi lasku VEGF tasot immunoblot vastaan ​​ELISA-analyysi. Koska ELISA mitattu erittää VEGF on mahdollista, että VEGF on eritetty, ja ennen kuin aloitetaan rapamysiinin hoidon, siis lääkeaineen vain esti käännös ja eritystä juuri syntetisoidun kasvutekijän viljellyissä soluissa. Lisäksi rapamysiini voi vaikuttaa solun VEGF erityspolulle erityiseen mekanismiin verrattuna VEGF mRNA translaation sääntelyä. Todennäköisemmin oli lausutaan ero soluviljelmässä, jossa ravinteiden säännöstä on yhtenäinen, vaikka seerumistarvaatio, versus kasvain microenvironment koskemattomassa hiirillä mahdollisesti hallussaan perfuusio epäsuhta tai valtimo vaihtotyötä.

(A) RAD001 kumottu mTORC1 välittämän ribosomaalisen proteiini S6 kinaasin fosforylaatiota kasvaimen lysaateissa vaikuttamatta mTORC1 välittämää 4E-BP1 fosforylaatiota. Kasvainten VEGF pitoisuus pieneni 60% ja mukana on oikeassa samanlainen lasku VEGFR2 fosforylaatioon. Immunoblottaustietojen data normalisoitiin fosforyloitumaton kokonaisproteiinin kohde ja p-tubuliinia. Kukin kaista on lysaatti yksi kasvain yhdellä hiiren. (B) ELISA-analyysi väliaine peräisin RAD001 käsitelty 786-O viljellyissä soluissa, n = neljä itsenäistä viljelmät kohden testiryhmässä osoitti 20% lasku erittyvän VEGF-proteiinin taso. ELISA data normalisoitiin yhteensä solujen DNA korjaamaan RAD001 välittämää pienenemistä solun kokonaisproteiinista. * P 0,0001.

64Cu-NOTA-Bevasitsumabilla Biodistibution Muutokset vastaus RAD001

Seuraavaksi, tutkimme

64Cu-NOTA-bevasitsumabi PET kuvantamisen voisi havaita RAD001 välittämä kasvaimen VEGF pitoisuus pienenee hiirimallissa RCC. Bioleviäminen tutkimukset suoritettiin 7 pikemminkin kuin 14 päivää ja RAD001 annon testata, onko VEGF sisäänotto erottaa merkittäviä muutoksia kasvaimen kasvua (kuvio 4A). RAD001 laski merkitsevästi kasvaimen

64Cu-NOTA-bevasitsumabi oton kaksinkertaiseksi, vehikkelikäsitellyt kasvaimet, 30,3 ± 8,3%, RAD001 13,8 ± 2,6% ID /g vastaavasti

p

0,001. MicroPET /CT kuvantamistutkimukset suoritetaan rinnakkain kohortin kasvaimen omaavien hiirten (kuvio 4B ja C) paljasti kolminkertainen vähenemiseen kasvaimen

64Cu-NOTA-bevasitsumabi signaalin intensiteettiä, SUV 4,0, verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin, SUV 12,2 . Kasvaimen kasvu vasteen analyysin toisessa rinnakkain kohortissa RAD001 ja ajoneuvon käsiteltyihin hiiriin (katso materiaalit ja menetelmät) paljasti, että RAD001 esti kasvaimen kokoa laajennus 14 päivän aikana hoidon määritettynä lineaarista regressioanalyysiä, jossa kaltevuus ajoneuvon ryhmä kasvu kasvu oli 14,98 (p = 0,0001), kun taas kaltevuus RAD001 käsitellyssä ryhmässä oli 0,20 (p = 0,92). Kaksisuuntainen ANOVA paljasti myös merkittäviä eroja kasvaimen koot mukaan mittauksen päivä ja ajoneuvon versus lääkehoitoa. Valitettavasti ero, RAD001 kasvaimen tilavuus väheneminen oli jo olivat tilastollisesti merkitseviä, 7. päivään mennessä, määritettynä yksisuuntainen ANOVA, p = 0,003 päivän 0 päivän 7 intervalli tai kerta pisteen analyysi päivä 7 kasvaimen koon välillä ajoneuvon ja RAD001 ryhmät, Mann-Whitneyn U-testi, p = 0,013, estää määrittäminen ennustearvo VEGF-PET kuvantamisen tänä ajankohtana (kuvio 5).

(A) bioleviäminen

64Cu- NOTA-bevasitsumabi hiirillä (n = 4 hiirtä ryhmää kohti) otetaan 786-O munuaissyövän kasvaimia hoidon jälkeen RAD001 tai ajoneuvoon. (B) Hiiret, 786-O munuaissyövän korva kasvaimia skannattiin lähtötilanteessa seuraavat i.v. injektio 100 uCi

64Cu-NOTA-bevasitsumabilla (n = 4). RAD001 sitten annettiin 7 päivää ja skannaa toistetaan. Siellä oli merkitty vähentynyt

64Cu-NOTA-bevasitsumabi signaalin RAD001 verrattuna vehikkelikontrolliin käsitelty hiiri. (C) pienenemistä standardin oton arvo (SUV) on RAD001 verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin.

kolmiulotteisessa korva kasvaimen kasvua määritys paljastaa, että RAD001 (▪) olennaisesti estää kasvun korvan kasvain (n = 9 hiirillä 18 kahdenvälistä kasvaimet) verrattuna lineaarista kasvua vehikkelikontrollit (•) (n = 7 hiirillä 14 kahdenvälistä kasvaimia).

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme menestyksellisesti syntetisoitiin ja arvioitiin

64Cu-NOTA-bevasitsumabin kuvantaminen VEGF tasot RCC tuumoriksenograftien. Tämä yhdiste oli vakaa, erityisesti kertyy kasvaimiin, ja voitiin estää lisäämällä leimaamatonta bevasitsumabi. Lisäksi suoritetaan RAD001 välittämä väheneminen VEGF-ilmentyminen selvästi näkyväksi PET kuvantamisen avulla

64Cu-NOTA-bevasitsumabi. Merkkiaineen sisäänoton väheneminen oli samanaikaisesti staattisen vaikutuksen RAD001 kasvaimen kasvuun. Siten

64Cu-NOTA-bevasitsumabi saattaa olla uusi korvike biomarkkeri taudin vakauttaminen välittävät rapalog tai mTOR estäjä hoitoja.

Perinteisesti kiinteän kasvaimen hoitovasteen sai perustuu kasvaimen mitanpienennysväline, joko mitata fyysisesti , radiograafisesti tai CT ja MRI. Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) ja sen uudempi RECIST1.1 versio tarjoaa standardoidun menetelmän tehon vertailuihin lääkkeitä ja tutkimuksia. Kuitenkin syntyminen molekyylirakennetta kohdennettujen hoitomuotojen haastaa RECIST kuin tehokkuus vertailukohtana [35]. Kun molecularly kohdennetut hoidot ovat tehokkaita, ne pääasiallisesti tuottavat vakaa tauti (SD) tai osittainen vaste (PR), jossa vähäisiä muutoksia kasvaimen kokoa. Rajoitukset RECIST Molekyylien hoidon tehokkuuden määrittämistä motivoi kehittämistä CT, MRI, ja ultraääni kuvantamisen algoritmeja ja tekniikoita räätälöity erityisesti kasvaimen verisuonten kohdistaminen huumeita. Nämä algoritmit on suunniteltu muutosten havaitsemiseksi yleisen kasvaimen verisuonten tiheyden, angiogeeninen tekijä välittämä uudissuonivuotoihin ja kasvaimen verisuonten virtaus [36].

Toinen lähestymistapa arvioida hoidon tehoa on PET. Kasvaimet ovat ominaista parannettu glukoosin ja tymidiinin vastauksena geneettiseen dysregulation aineenvaihdunnan ja leviämisen [37]. Diomerkkiaineina

18F-fluorodeoksiglukoosia (FDG) ja

18F luoritymidiiniä (FLT) [38] – [40], kuva kasvain glukoosin otto ja DNA-synteesiin havaitsemiseksi primaarikasvaimen ja etäpesäkkeiden ja seurantaan hoitovasteen. Sekä FDG ja FLT PET voi paljastaa terapeuttinen teho ennen kasvaimen tilavuuden muutoksiin. Nämä kaksi PET merkkiaineiden haastetaan se, että joidenkin syöpien, kuten RCC (ja eturauhasen) ovat pääasiallisesti FDG tunteettomia [41], ja FLT aliarvioi leviämisen kasvaimissa aktivoitu pyrimidiini de novo synteesiä tai salvage-reitin säätelyä [42]. Kuitenkin vähemmistö FDG positiivinen RCC, PET havaitsee tuumorivaste aikaisintaan koon pienentämiseen ja ennustaa paremmin etenemistä elinaika (PFS) [14].

Huolimatta rajoituksia syövissä, kuten RCC, uuden ulottuvuuden PET on tullut ilmeiseksi, että viime vuosina. ”ImmunoPET” merkkiaineita ovat vasta-aine-radionuklidi-konjugaattien sitoutumiseen proteiineihin joko kiinnitetty solun pinnalle tai erittää kasvaimeen mikroympäris- [43]. Käyttämällä bifunktionaalisia kelaattoreita kuten NCS (isotiosyanaatti) tai NHS (N-hydroksisukkinimidiä) muotoja 1,4,7,10-tetra-1,4,7,10-tetraetikkahappoa (DOTA) tai 1,4,7-triatsasyklononaa- N, N ’, N ”-triacetic acid (NOTA), radionuklidien metalli-ionit voidaan kompleksoida in kelaattorin ytimien kun kovalenttiset sidokset muodostuvat ilmainen lysiinin ryhmien vasta-aineita tai peptidejä [44]. Valtaa tämän lähestymistavan on, että DOTA /NOTA kelatoiman PET merkkiaineita voidaan konjugoida vasta-spesifinen ohjelmistoon angiogeenisten tekijöiden. Koska VEGF on pääasiallinen angiogeeninen tekijä tuottaman RCC (ja useimmat muut syövät sekä), tämä angiogeeninen tekijä on pohdittava keinona kuvantamisen tavoite. Ennen tutkimukset ovat arvioineet käyttö radioleimattujen bevasitsumabin PET kuvantamisen VEGF ilmaisua. Esimerkiksi bevasitsumabi on radioaktiiviseksi

89Zr [26] ja

86Y [27] prekliiniseen kuvantamiseen munasarjojen ksenograftimalleissa. Huolimatta kyky näiden aineiden kuvan VEGF, energian korkea ja runsaasti gamma rappeutuminen näistä radionuklideja altistumisen huolenaihe verrattuna

64Cu joka on paljon alhaisempi energian korkea gamma rappeutuminen runsautta. Paudyal

et al.

Arvioitiin

64Cu-johon kuu- luvat DOTA- bevasitsumabin prekliinisissä VEGF ilmentymisen kuvantamisen peräsuolen ksenografteissa [28]. Maksa otto oli suhteellisen korkea, 17,2% ID /g, toisin kuin meidän

64Cu-NOTA-bevasitsumabi merkkiaineen jossa se oli 4,8% ID /g. Selitystä ero ottoa maksaan voisi olla korkeampi

64Cu sitoutumisaffiniteetti NOTA verrattuna DOTA. Nagengast

et al

.