Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

etiologia toissijainen syövän lapsuudessa syövän sairastaneet on suurelta osin epäselvä. Altistuminen normaalien somaattisten solujen säteilyä ja /tai kemoterapiaa voi vahingoittaa DNA: ta ja jos ei kaikki DNA vauriot ovat kiinnitetty kunnolla, mis-korjaus voi johtaa patologisia seurauksia. On uskottavaa olettaa, että geneettisiä eroja, eli polut vastuussa solusyklikontrollin ja DNA korjaus, on kriittinen rooli kehityksessä toissijainen syövän.

Menetelmät /Havainnot

Tunnistaa tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa alttiuteen toisen syövän muodostumisen, rekrytoimme 20 henkilöitä, jotka selvisivät lapsuuden maligniteetti ja kehitettiin sitten toisen syövän sekä 20 tarkasti ohjaus yksilöiden lapsuuden maligniteetti, mutta ilman toista syövän. Vasta-mikrosirut, me seulotaan ensisijaisesti fibroblastien täsmäävän potilaiden erojen määrää edustava DNA korjaukseen liittyviä proteiineja. Löysimme olennaisesti alentuneet RAD9A ja useiden muiden DNA korjaus proteiinit kahden syöpäpotilailla verrattuna yhden syöpäpotilaille. RAD9A proteiini taso nousi vastauksena DNA-vaurioita, mutta vähemmässä määrin kahden syöpäpotilaille. Kvantifiointi mRNA ilmaisun reaaliaikaisella RT-PCR osoitti, alempi

RAD9A

mRNA-tasoja sekä käsittelemätöntä ja 1 Gy γ-säteilytettyjä soluja kahden syöpäpotilailla.

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä tuloksemme tukevat ajatusta, että modulaatio RAD9A ja muiden solusyklin pysähtymiseen ja DNA korjaus proteiinit lisäävät riskiä sairastua toisen syövän lapsuudessa syöpäpotilailla.

Citation: Weis E, Schoen H, Victor A, Spix C, Ludwig M, Schneider-Raetzke B, et al. (2011) Vähentynyt mRNA ja Protein Expression genomi Talonmies RAD9A Alkeisyhdistyksessä Sidekudosmuodostussolujen yksilöiden Childhood ja Independent Toinen Syöpä. PLoS ONE 6 (10): e25750. doi: 10,1371 /journal.pone.0025750

Editor: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Ranska

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 09 syyskuu 2011; Julkaistu: 03 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Weis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Stiftung Rheinland-Pfalz für Innovation (hanke nro. 698) ja FAZIT-Stiftung. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

useimmissa tapauksissa syöpä on monitekijäinen sairaus aiheuttama ympäristöhaittoja, epäterveellisten elämäntapojen ja /tai geneettiset tekijät [1]. Koska lapset ovat yleensä vähemmän alttiita epäsuotuisan ympäristön tai elämäntapa kuin aikuiset, geneettiset tekijät ovat todennäköisesti tärkeämpi [2]. Kuitenkin vain pieni osa (1-10%) lapsuuden syöpien on tunnetun geneettisen etiologian [3]. On hyvin tunnettua, että säteilytys ja muut DNA: ta vahingoittavat aineet, joita käytetään syövän hoitoon voivat laukaista muodostumista leukemia ja muut syövät [4], [5]. Säteily ja /tai kemoterapiaa muodostavat riskitekijöitä kehittämisestä toisen syövän, joita ei voida luokitella peruuttamista primaarikasvaimen. Koska suhteellisen vähän lapsuusiän syövän sairastaneet kehittää toisen syövän [6], geneettinen taipumus voi olla mukana.

Solut ovat jatkuvasti alttiina endogeenisen ja eksogeenisen DNA: ta vaurioittavat aineet. On olemassa useita reittejä, jotka valvovat ja ylläpitävät genomin eheyttä. Solut on useita tarkistuspisteitä että ohimenevästi viivyttää solusyklin etenemistä, jotta ylimääräistä aikaa DNA korjaukseen tai apoptoosin [7], [8]. Mutaatiot tai poikkeava säätely geenien ohjaavat solusyklin tarkastuspisteitä ja DNA korjaus on tärkeä rooli kasvainten synnyssä [9], [10] ja ovat ensisijaisia ​​ehdokkaita etsittäessä geenejä moduloimiseksi riski toissijainen syöpään. Jos hoito aiheuttama DNA-vaurio misrepaired, tämä voi aloittaa toista kasvainten kehittymiseen. Geneettinen alttius voi johtaa lisääntyneeseen kromosomi epävakauden jälkeen säteilyä tai kemoterapiaa [5], [11], [12]. Vain hyvin harvoissa tapauksissa toisen lapsuuden pahanlaatuisen geneettinen epävakaus oireyhtymä kuten Fanconin anemia, ataksia teleangiectasia tai xeroderma pigmentosum on diagnosoitu [10]. Useimmissa tapauksissa syyt taustalla kehittämisestä toisen syövän ole tiedossa.

Sen hypoteesin testaamiseksi, että modulaatiot ilmaisemisessa solusyklikontrollin ja DNA: n korjaukseen geenit liittyvät toissijainen syöpään, analysoimme ensisijainen fibroblasteja lapsuuden syöpäpotilaat toisen syöpä (2C potilasta) ja varovasti verrokkia ilman toista syövän (1C potilasta). Ihon fibroblastien edustaa normaalia somaattisten solujen tyyppi. Toisin kuin veren ja EBV-transformoituja lymfoblastit, joita voidaan helpommin saada ensisijainen fibroblastien muodostavat homogeenisen solupopulaation ehjät solusyklin ja DNA: n korjaukseen tarkistuspisteitä. Tähän mennessä on ollut vain muutamia tutkimuksia ensisijainen fibroblasteissa syöpäpotilaita. Fibroblasteja rinta- ja kilpirauhassyöpä potilaiden todettiin viallinen korjaus- ja /tai solukierron säätelyssä [13]. Epänormaali geenien ilmentyminen somaattisissa soluissa vaikuta vanhempien retinoblastoomaa potilaat ovat myös yhdenmukaisia ​​perinnöllinen alttius syövän kehityksen [14].

Tunnistaa herkkyystekijöitä toiseen syövän muodostumisen, me seulotaan eri DNA-korjaus liittyy geenien konstitutiivista proteiinin ilmentyminen eroja 2C vs. 1C potilaille. DNA vaurioita Checkpoint proteiinia RAD9A säädeltiin vähentävästi sekä käsittelemätöntä ja säteilytetty somaattisten solujen kahden syöpäpotilaiden, verrattuna yhden syöpäpotilaille. Lisääntynyt konstitutiiviset ja DNA-vaurioita aiheuttama tasoja RAD9A proteiinin ja muiden genomisen huoltajien voi auttaa säilyttämään genomin vakautta ja estää toista kasvainten kehittymiseen jälkeen säteilyn ja kemoterapiaa. RAD9A, joka joissakin papereita kutsutaan hRAD9 tai yksinkertaisesti RAD9, on mielenkiintoinen ehdokas, koska se toimii useita eri reittejä pitkin, mukaan lukien DNA: n korjaus, solusyklin Checkpoint ohjaus ja apoptoosin ja sen epänormaali ilmentyminen on yhdistetty kasvaimien syntyyn [15], [16 ].

tulokset

potilasrekrytointi

Kaksikymmentä henkilöitä, jotka selvisivät lapsuuden syöpä ja kehitettiin sitten toinen syöpä rekrytoitiin Saksan Childhood Cancer Rekisteriseloste. Vähintään vuosi on oltava kulunut diagnoosi toisen syövän. Kaksikymmentä Hyväksytty tapauksissa selvisi lapsuuden syöpä ja ei kehittynyt toista syövän olivat satunnaisesti valittu Rekisteriseloste. Sopiva kriteerit olivat samaa sukupuolta, yhdenvertainen ensisijainen syövän diagnosointiin, yhtäläiset ikä ensimmäisen diagnoosin, ja samalla tarkkailussa. Koska primäärikasvaimissa Hyväksytty yhden ja kahden syöpäpotilasta diagnosoitiin samana vuonna, hoitomuodot olivat pitkälti samat. Kaikki potilaat seurattiin perusopetuksesta syöpädiagnoosin aikaa, jolloin he olivat palvelukseen.

Potilailla piti olla elossa ja vähintään 18-vuotias (täysi-ikäinen Saksa) antamaan tietoisen suostumuksensa ihobiopsia . Alle 50% yhteyttä kahden syöpäpotilaille päättänyt osallistua tutkimukseen. Koska nämä mukaanottokriteerinä, voisimme vain rekrytoida rajallinen määrä kahden syöpäpotilaiden koko Saksassa. On olemassa tietty harha jakelussa ensisijainen ja toissijainen syöpiä. Esimerkiksi yleisin yhdistelmä akuutin myelooisen leukemian akuutin lymfaattisen leukemian on erittäin epäedullinen ennusteen ja näin ollen ei ole edustettuna. Toisaalta, toissijaiset kilpirauhasen karsinoomat ovat yliedustettuina, sillä potilailla on hyvä ennuste ja aikuisuus.

Alentuneita DNA korjaukseen liittyvien proteiinien soluissa kahden syöpäpotilaiden

Räätälöidyt vasta-aine mikrosiruja (esimerkiksi, katso kuvio 1) käytettiin vertaamaan konstitutiivista ilmentämistä tasot (ilman induktio DNA-vaurion) eri DNA korjaukseen liittyvien proteiinien eksponentiaalisesti kasvavissa ensisijainen fibroblasteja lapsuuden syöpäpotilaiden ja ilman toisen kasvaimen, vastaavasti. 19 tutkittiin geenejä (taulukko 1) valittiin, koska ne ovat keskeisiä toimijoita eri DNA: n korjaukseen reittejä (eli DNA double-lohkon murtuma korjaus, nukleotidin Leikkauskorjauksessa, pohja Leikkauskorjauksessa, ja epäsuhta korjaus), jotka osallistuvat joko signalointi DNA-vaurion , tarkastuspiste ohjaus ja /tai DNA: n korjaukseen. Mutaatiot monissa näistä geeneistä tiedetään altistaa syövän kehittymiseen.

Eri määriä (noin 1,5, 1,0 ja 0,5 pg) ja anti-RAD9A vasta-aine (2 ng /ul), huomataan kolmena kappaleena nitroselluloosalle -päällystettyihin dioja ja inkuboitiin fluoresenssileimattua tumaproteiiniuutetta käsittelemättömien fibroblasteista kahden syöpäpotilaasta 2C-7 ja vastaavan yhden syöpäpotilaan 1C-7, vastaavasti. Anti-ACTB toimii positiivinen ja tarkkailu puskuri negatiivisena kontrollina. Mitatut 2C /1C RAD9A proteiinisuhde on 0,5.

Kunkin sovitetun (2C vs. 1 C) potilaalle parin määritimme z suhde kolmena mittaukset proteiinin tasot (normalisoitunut log10 transformaatio ja z tulokset). Kuusi 19 testataan proteiineja, jotka edustavat eri DNA korjaukseen reittejä, näytetään alhaisempi kaksi-syöpäpotilailla (taulukko 1). Laatikko tontteja Kuviossa 2 esitetään jakauma z-suhteet BRCA1 (-1.36x; p = 0,017), DDIT3 (-1.27x; p = 0,011), MSH6 (-1.16x; p = 0,021), TP53 (-1,18 x; p = 0,003), RAD9A (-1.38x; p = 0,040), ja RAD51 (-1.37x; p = 0,009). P-arvot ei korjattu useita testaus ja olisi pidettävä tutkivaa. Osoittaakseen luotettavuuden meidän vasta-mikrosiruja, Western blot-analyysi RAD9A suoritettiin edustava sovitettu pari. Anti-RAD9A vasta-aine värjäsi odotettu 45 kDa bändi tumaproteiiniuutteet, kun taas mitään tai vain heikko bändi nähtiin sytoplasman otteita (Fig. 3). Yhdenmukainen vasta-mikrosiru (Fig. 1), Western blot osoitti pienemmän määrän (60%) RAD9A proteiinin 2C potilaan verrattuna sovitettu 1C potilaalle.

suhteellinen ekspressiotasot fibroblasteissa 2C vs. 1C potilaat ovat -1.36x (p = 0,017) ja BRCA1, -1.27x (p = 0,011) ja DDIT3, -1.16x (p = 0,021) ja MSH6, -1.18x (p = 0,003) ja TP53, – 1.38x (p = 0,040) ja RAD9A, ja -1,37 (p = 0,009) ja RAD51. Proteiinin ilmentyminen mitattiin vasta-mikrosiruja (normalisoitu log10 muutosta ja z tulokset). Rasiakuvaajien osoittavat jakautumista z suhdelukuja Hyväksytty 2C vs. 1C potilaille. Mediaani edustaa vaakarivillä. Pohja on Ruudussa 25

persentiili, top 75

persentiili. T palkit ulottuvat laatikot korkeintaan 1,5 kertaa korkeus ruutuun. Vieraat havainnot esitetään avoimina piireissä.

Geeli vasemmalla puolella näkyy Coomassie sinivärjäyksen ydin- ja sytoplasmaproteiinin uutteita (30 ug kutakin) käsittelemättömästä fibroblasteista kahden syöpäpotilaan 2C-7 ja Hyväksytty yhden syöpäpotilaan 1C-7. Vastaavat geelin oikealla puolella värjätään anti-RAD9A-vasta-aine, joka tunnistaa 45 kDa: n tumaproteiini. Lasketut 2C /1C RAD9A proteiinisuhde on 0,6.

Kuusi proteiinit osoittavat ilmentämällä eroja myös määrällisesti soluissa 1 h ja 4 h kuluttua 1 Gy γ-säteilytys. Kunkin potilaan vertasimme proteiinin tasot mitataan vasta-mikrosiruja käsitellyissä vs. käsittelemättömien näytteiden. Kaksi proteiinia, RAD9A ja DDIT3, erosivat toisistaan ​​soluvasteen DNA-vaurion välillä 2C ja 1C potilailla. Laatikko tontteja Kuviossa 4 esittävät z suhdeluvut RAD9A (kun normalisoinnin log10 transformaatio ja z tulokset) kun 2C ja 1C ryhmä. Molemmissa ryhmissä RAD9A proteiinin tasot olivat koholla jälkeen DNA-vaurioita. Kun yksi syövän ryhmä, RAD9A oli yli-ilmentynyt yli kaksinkertaiseksi 1 h ja 4 h kuluttua säteilytyksen, verrattuna konstitutiivisen proteiinin tasolla. Kun 2C-ryhmän määrä RAD9A proteiinin lisääntyminen 1.76- ja 1,63-kertainen 1 h ja 4 h, vastaavasti, mikä on pienempi induktio (-1.44x, p = 0,012 4 h), jonka DNA-vaurioita lapsuudessa syövän potilaille, joilla on toinen kasvain. Samanlainen RAD9A, proteiini, jota koodaa DNA-vaurioita indusoituva transkriptio

DDIT3

havaittiin myös lisättävä, säteilytettyjä soluja (Fig. 3). Vuonna 1C potilailla, proteiini taso oli kohonnut 1.40- ja 1.96-kertainen 1 h ja 4 h jälkeen DNA-vaurioita, verrattuna 1.26- ja 1.95-kertaisesti 2C ryhmässä. 1 h kuluttua säteilytyksen oli pienempi induktio (-1.13x, p = 0,019) kahden syövän ryhmä.

Differential induktio RAD9A (vasen puoli) ja DDIT (oikea puoli) 1 h ja 4 h kuluttua 1 Gy γ-säteilytys fibroblasteissa kahden syöpäpotilailla (harmaat laatikot) ja yhden syöpäpotilailla (katkoviivalaatikoiden). Proteiinin ilmentyminen mitattiin vasta-mikrosiruja (normalisoitu log10 muutosta ja z tulokset). Rasiakuvaajien osoittavat jakelu z-suhteet käsiteltyjen vs. käsittelemättömien solujen saman potilailla. Mediaani edustaa vaakarivillä. Pohja on Ruudussa 25

persentiili, top 75

persentiili. T palkit ulottuvat laatikot korkeintaan 1,5 kertaa korkeus ruutuun. Vieraat havainnot on esitetty avoimet ympyrät. DNA-aiheuttaman vaurion kasvu 2C ryhmä on alhaisempi kuin 1C ryhmä RAD9A 4 tunnin säteilytyksen jälkeen (-1.44x, p = 0,012) ja DDIT3 1 h säteilytyksen jälkeen (-1.13x, p = 0,019 ).

Alennettu RAD9A mRNA ekspressiotasot kahden syöpäpotilailla

Koska RAD9A proteiini dramaattisimmin vaimentua kahdella-syöpäpotilailla, Keskityimme lisätutkimuksia tällä solusyklin tarkistuspisteen ja DNA: n korjaukseen proteiinia. Suoritimme kvantitatiivinen mRNA: n ilmentymisen analysoi reaaliaikaisella RT-PCR sekä käsittelemätöntä ja säteilytettyjä soluja. Laatikko tontteja Kuviossa 5 esillä jakautumista ilmaisun suhdeluvut 20 pareittain potilaista. Konstitutiivinen

RAD9A

mRNA-tasot (ilman induktio DNA-vaurioita) olivat merkittävästi alemmat kaksi-syöpäpotilailla (-2.40x, p = 0,004), verrattuna yhden syöpäpotilailla. Välillä-ryhmä eroja havaittiin myös 1 h (-2.54x, p = 0,003), 4 h (-2.62x, p = 0,003), ja 24 h (-2.54x, p = 0,003) jälkeen säteilytys. Kolme pareittain edustavat harha tai äärimmäisen vieraat havainnot vuonna rasiakuvaajan kaaviot, mikä osoittaa, että suhteellinen

RAD9A

ekspressiotasot voivat huomattavasti vaihdella potilaiden välillä ja ei aina vähennetään kahdella syöpäpotilailla. The (äärimmäinen) harha edustavat erilaisia ​​yhdistelmiä ensimmäisen ja toisen syöpään.

RAD9A

mRNA tasot käsittelemättömän ja säteilytetään (1 h, 4 h ja 24 h kuluttua 1 Gy) fibroblasteissa kaksi- syöpäpotilailla, verrattuna sovitettu yhden syöpäpotilailla. mRNA kvantifioitiin reaaliaikaisella RT-PCR (normalisoitu kanssa ΔΔCT menetelmällä ja kaksi endogeenisen kontrolligeenin). Rasiakuvaajien osoittavat jakautumista ilmaisun suhdelukuja Hyväksytty 2C vs. 1C potilaille. Mediaani edustaa vaakarivillä. Pohja on Ruudussa 25

persentiili, top 75

persentiili. T palkit ulottuvat laatikot korkeintaan 1,5 kertaa korkeus ruutuun. Vieraat havainnot on esitetty avoimet ympyrät, äärimmäinen vieraat havainnot kolmioita. Kaksi syöpäpotilailla osoittavat alennetaan

RAD9A

mRNA-tasoja ilman induktio DNA-vaurioiden (-2.40x, p = 0,004) sekä 1 tunnin (-2.54x, p = 0,003), 4 h (-2,62 x, p = 0,003), ja 24 h (-2.54x, p = 0,003) sen jälkeen, kun säteilytys.

Koska on raportoitu, että

RAD9A

ilmentäminen on riippuvainen DNA: n metylaatio [17], päätimme metylaatiostatuksen oletetun cis-säätelyalueen by bisulfiitti pyrosekvensointi. Verrattuna klassiseen bisulfiitti plasmidisekvensointi, bisulfiitti pyrosekvensointi voi analysoida rajoitettu määrä CpG sivustoja sijaitsee eniten 30-50 emäsparia 3 ’Sekvenointialuke kuitenkin toisaalta se voi paljon tarkemmin (± 2%) määrällisesti CpG metylaatio tasolla. Analysoidut DNA-segmentti, joka sisältää kolme vierekkäistä CpG sivustoja, havaittiin olevan metyloimatonta käsittelemättömissä soluissa sekä 2C ja 1C potilailla. Valikoima metylaatio arvojen oli 4-10%, kuten odotetaan kopiointia ajatellen aktiivisen geenin. Ei ollut merkittävää välillä-ryhmä metylaatio ero, joka voisi selittää havaitun ilmentymisen ero. Koska tiheys metyloitu CpG: t eikä yksittäisiä sivustoja CpG saari puolestaan ​​geeni päälle tai pois [18], [19], keskimääräinen metylointi muutaman CpG: t voivat yleensä toimia edustajana epigeneettisellä markkeri tietylle cis-säätelyalue .

kromosomi 11q13.1, joka sisältää

RAD9A

geeni usein monistettiin erilaisissa ihmisen kasvaimissa [17]. Jos haluat sulkea pois

RAD9A

kopioluvun vaihtelut 2C ja 1C potilaita, suoritimme korkearesoluutioinen karyotype analysoi kanssa Affymetrix GeneChip- Genome Wide Human SNP array 6.0 sekä kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Molemmat menetelmät paljasti kaksi kopiota

RAD9A

geeni kaikilla tutkituilla potilailla.

Keskustelu

Verrattuna valtavia ponnisteluja luonnehtia transcriptomes ja proteiinien syöpäsoluja, on suhteellisen harvat tutkimukset etsivät geeniekspression eroja normaaleissa somaattisissa soluissa kasvaimen potilaista [13], [14]. Sen hypoteesin testaamiseksi, että erot DNA korjaukseen reitit voivat vaikuttaa riski kehittää toisen kasvaimen käsittelyn jälkeen lapsuuden syöpä, vertasimme konstitutiivinen tasoja DNA korjaukseen liittyvien proteiinien ensisijainen fibroblasteissa sovitetun kahden syövän ja yhden syöpäpotilailla. Koska emme odota dramaattisia eroja vaan hienovarainen modulaatiot DNA korjaus kapasiteetti kahdella-syöpäpotilailla, emme suorita genominlaajuisten näytöllä, mutta testataan vain rajallinen määrä tunnettuja DNA: n korjaukseen liittyvien geenien käyttäen erittäin herkkiä vasta-ainetta mikrosiruja. Se havainto, että 6 19 testattiin DNA korjaukseen liittyviä proteiineja konstitutiivisesti vaimentua normaaleissa soluissa kahden syöpäpotilaiden edistää ajatus siitä, että DNA: n korjaus polkuja kahden syöpäpotilaille ovat vähemmän pystyy käsittelemään DNA-vaurion kuin yhden syöpäpotilailla . Kahden proteiinit myös osoitti alempaa induktion jälkeen DNA-vaurioita. Yksi geeni,

RAD9A

analysoitiin tarkemmin. Sekä konstitutiivista mRNA: n ekspression eksponentiaalisesti kasvavia fibroblasteissa sekä DNA-vaurion indusoima eri ajankohtina sen jälkeen, kun säteilytys oli pienempi kahden syöpäpotilailla kuin yhden syöpäpotilailla. Tässä valossa RAD9A on hyvä ehdokas tekijä altistavia toinen syöpä. Differentiaalinen

RAD9A

ilmaisua ei välittämä DNA: n metylaatio tai kopioida numeron vaihtelu.

RAD9A

geeni evolutionarily erittäin konservoitunut hiivasta ihmiseen, joka pidetään yleisesti hyvä indikaattori toiminnallinen merkitys. Se toimii useita eri reittejä pitkin, mukaan lukien pohja leikkaaminen, homologinen rekombinaatio ja yhteensopimattomuuden korjauksen sekä solukierron tarkistuspisteen kontrolli ja apoptoosin. Monet sen toiminnot näyttävät välittyvän ydin- RAD9A-HUS1-Rad1 proteiini-kompleksin, joka muistuttaa PCNA [15], [16]. Hiiri

Rad9

–

/

– ja vähäisemmässä määrin

Rad9

+ /

– Knockout soluihin [20] ja ihmisen RNAi knockdown solut alennettu

RAD9A

tasoilla [21] ovat herkkiä erilaisille DNA-vaurioita, näytetään genomin epävakaus, DNA: n korjaukseen puutos ja muuttunut solusyklin tarkastuspisteitä. Alkion kuolleisuutta hiiren

Rad9

–

/

– mutaatio tarkoittaa, että monikäyttöisyyden Rad9A ovat välttämättömiä embryogeneesiin ja normaalia kehitystä. Hiiret kohdennettuja

Rad9

–

/

– poistetaan keratinosyyteissä ovat erittäin herkkiä genotoxin aiheuttama ihon kasvaimen muodostumisen [22], [23].

Rad9

–

/

– keratinosyyttien näyttää suuremman määrän spontaaneja ja genotoxin aiheuttama DNA taukoja, poikkeava solusyklin jakelun ja korotettuun apoptoosin. Tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että RAD9A toimii tuumorisuppressorina ihon ja muiden kudosten edistämällä DNA: n korjautumista vaurioituneita soluja ja vakauttamaan genomin ennen kasvaimien syntyyn tapahtuu. On mielenkiintoista huomata, että sekä downregulation ja säätelyä

RAD9A

on tuumorigeneesiin liittyvistä.

RAD9A

yli-ilmentyminen on havaittu eri kasvaimia, mukaan lukien rinta- [17], keuhkosyöpä [24], kilpirauhasen [25], ja eturauhassyövän [26]. Tämä viittaa siihen, että

RAD9A

voi toimia myös onkogeenin, todennäköisesti poikkeava transaktivaatiota alavirran kohdegeenien. Yleensä

RAD9A

taso korreloivat kasvaimen koon ja /tai vaiheessa.

RAD9A

kuuluu kasvava ryhmä geenejä dual roolista syövässä. Riippuen solutyypistä ja kudosympäristö, se voi osoittaa joko kasvain edistäviä tai kasvain-estävä vaikutus [15]. Mekanismeja, joilla monimuotoinen RAD9A proteiini toimii onkogeenin ja kasvaimia estävä, vastaavasti ovat suurelta osin tuntemattomia.

Koska määrä kahden syöpäpotilaiden ollessa 18-vuotias on suhteellisen pieni, emme voi rajoittaa meidän tutkituilla potilailla tiettyyn kasvain yhteisöä tai hoitokäytäntö. Suurin alaryhmä primaarikasvainten olivat lymfaattisen leukemiat (10 tapausta). Koska niiden hyvää ennustetta, kilpirauhasen karsinoomat (6 tapausta) olivat yliedustettuina toiseksi syöpiä. Sädehoito on tärkeä riskitekijä kilpirauhaskarsinoomaa [27]. Tässä valossa, se houkuttelevaa spekuloida, että runsaasti RAD9A proteiini voi moduloida riski säteilyn aiheuttama kasvain. Tulevaisuuden enemmän kattavia tutkimuksia pitäisi harkita vaikutuksia eri hoitomuotojen lapsuuden syöpä. Kuten edellä todettiin, rekrytointi homogeeninen potilasryhmät on erittäin haastavaa. Saimme ihobiopsioista ja verinäytteet kaikilta tutkittu potilailla. Koska monet potilaat olivat luuytimestä siirrettyjen veren soluja ei analysoitu. Fibroblastiviljelmät perustettu yhden tai useamman vuoden kuluttua toisen syövän diagnosointiin /hoitoon, mikä on epätodennäköistä, että ilmaisu erot kahden syöpää vastaan ​​yhden syöpäpotilaille suoraan tai epäsuorasti vaikuttaa säteilyä tai kemoterapiaa. Vaikka on todennäköistä olettaa, että viljellyt fibroblastit edustavat tilannetta normaalia kehon soluihin, olisi toivottavaa tutkia myös fermentoidun solujen ja /tai muiden kudosten.

määrä analysoitiin potilaiden on suhteellisen pieni. Kuitenkin, tulokset viittaavat siihen, että konstitutiivinen RAD9A proteiinin tasot sekä Induktion laajuuden jälkeen DNA-vaurion vaihdella kahden syövän ja yhden lapsuuden syöpäpotilailla. Ehdotamme, että RAD9A toimii tuumorisuppressori ihon fibroblasteissa ja muissa normaaleissa solujen elin, ja näin ollen auttaa estämään toisen syöpää. Analyysi eri normaalin solutyyppejä suuremmissa potilasryhmissä, esimerkiksi aikuisten syövän sairastaneet ovat tarpeen tukea rooli RAD9A DNA vaurioita aiheuttama syövän synty.

Materiaalit ja menetelmät

Patient näytteitä

Saksan lapsuusiän Syöpärekisteri on kerännyt lähes kokonaan kaikki lasten syöpien Saksassa vuodesta 1980, suorittaa avoimen lopun seurannan painottaen toinen kasvaimet. Avulla on Rekisteriseloste rekrytoimme 20 henkilöä selvisi lapsuuden maligniteetti ja sitten, liity ensimmäinen tapahtuma, joka on kehitetty toinen syöpä (2C potilasta) sekä 20 Tarkasti henkilöt [samaa sukupuolta, sama ensisijainen syöpä (ICCC luokitus ), yhtä suuri ikä (± 1 vuosi) ensin diagnoosi], jotka eivät kehittäneet toisen syövän (1C potilasta). Perinnöllisyysneuvonta tarjottiin ja tietoisen kirjallisen sisältöä saatiin kaikista potilaista tutkimukseen osallistuneiden, joka hyväksyttiin eettisen komitean Medical Association of Rheinland-Pfalzin (nro 837.440.03 [4102]).

keski-ikä diagnoosin ensimmäisen kasvain oli 6,8 vuotta (vaihteluväli 0-14) molemmissa ryhmissä. Ensisijainen kasvaimia akuutti myelooinen tai lymfaattisen leukemian (11 tapausta), Hodgkinin tai Burkittin lymfooman (5 tapausta) ja muut kiinteät kasvaimet (4 tapausta). Keskimääräinen ikä toisessa diagnoosi 2C ryhmässä oli 16,7 vuotta (vaihteluväli 9-30). Toinen kasvaimet olivat myelodysplastinen oireyhtymä tai lymfooma (7 tapausta), kilpirauhaskarsinoomaa (6 tapausta) ja muut kiinteät kasvaimet (7 tapausta). Toinen kasvaimet vahvistettiin kokeneet kliinisen onkologit olevan mitään pahenemisvaiheita tai vaihtoehtoisia ilmentymiä ensisijaisen kasvaimen.

Ihobiopsiat otettu aikaisintaan vuoden, yleensä useita vuosia toisen syöpähoidon. Ensisijainen fibroblastisoluviljelmissä perustettiin ihobiopsioista ja viljellään minimal essential Earlen suoloja (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, vitamiineja ja antibiootteja. Solut (ilman DNA-vaurioita) kerättiin eksponentiaalisesti kasvavista subkonfluenteista kulttuureissa. Aiheuttavan DNA korjaus, subkonfluenteista viljelmät altistettiin 1 Gy ionisoivan säteilyn avulla GammaCell 2000 (Cs137) säteilyttäjällä. Näytteet otettiin 1 h, 4 h ja 24 h jälkeen säteilytyksen. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

Western blot ja vasta-mikrosirujen

ydin- proteiinin uuttamalla solut suspendoitiin uudelleen kaksi kertaa 500 ul: aan 10 mM HEPES , 1,5 mM MgCI2, 10 mM KCI, pH 7,9 ja inkuboitiin jäillä 10 min. 10 s kuluttua sentrifugoimalla suurimmalla nopeudella supernatantti heitettiin pois. Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 20 mM HEPES, 0,42 M NaCl: a, 1,5 mM MgCI2, 0,2 mM EDTA, 25% glyserolia, pH 7,9 ja homogenisoitiin käyttäen ruiskua, jossa neula. Kun oli inkuboitu jäillä 30 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 30 min maksimi nopeudella 4 ° C: ssa, supernatantti, joka sisälsi tumauutteen erotettiin soluliman pelletti ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin käyttäen Roti Quant (Roth, Karlsruhe, Saksa).

Western blot-analyysi, 30 ug tumaproteiiniuutetta erotettiin 8% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin sitten Hybond-P-membraanille (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Kalvo ensin blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa (NFDM) liuotettuna Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), 0,1% Tween 20: tä (TBST). Blotteja inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisten anti-RAD9A vasta-ainetta, laimennettiin 1:250 (2 ug /ml) TBS 5% NFDM. Pesun jälkeen blot kolme kertaa 5 minuutin ajan TBST: llä, proteiinit detektoitiin peroksidaasilla leimatun sekundaarisen kanin anti-hiiri-vasta-aineita käyttäen BM Chemiluminescence Western Blotting Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Kaistaintensiteettejä kvantifioitiin kanssa LAS-3000 (Fujifilm, Düsseldorf, Saksa) luminoiva kuva-analysaattoria. Coomassie blue-värjäys säätämiseen käytetään signaalin intensiteetit proteiinin määrää.

Räätälöidyt vasta-aineen mikrosiruja kvantifiointiin 19 eri DNA korjaukseen liittyvien proteiinien (taulukko 1) valmistettiin tiputtelua yksi pisara, kaksi tippaa ja /tai kolme tippaa, jokainen pudotus joka sisälsi noin 0,5 pg-vasta kolmena kappaleena nitroselluloosalle päällystettyjä dioja (Oncyte, nitroselluloosa 16 multi-pad dioja, Grace Bio-Labs, Bend, OR, USA) käyttäen kosketukseton array spotter (sciFLEXARRAYER 3 , Scienion, Berliini, Saksa). Vasta-aineita beeta-aktiini (ACTB) toimivat positiivisina, tiputtelua puskuri negatiivisena kontrollina. Leikkeitä säilytettiin 4 ° C: ssa kuivissa olosuhteissa. Tumaproteiinien leimattiin amiinin reaktiivisen fluori väriaine, joka muodostaa kovalenttisen amidisidoksen välillä primäärisiä proteiineja. Kaksi mikrogrammaa proteiinia ja 0,12 ui fluoresoivaa ainetta (Dylight 649 NHS Ester, Pierce, Rockford, USA) inkuboitiin 1 h ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Sitten ylimäärä fluoresoiva väriaine inaktivoitiin lisäämällä 100 mM glysiiniä reaktioon. Ennen käyttöä vasta-mikrosiruja peitettiin 16-pad FAST runko hybridisaatio kammiot (Whatman, Maidstone, UK). Epäspesifinen sitoutuminen estettiin 1 tunti 4 ° C: ssa 120 ul PBS: ää, joka sisälsi 4% NFDM per alaryhmä, jota seurasi kolme pesua 120 pl PBS: llä, joista kukin 10 min. Leimatut proteiinin näytteitä inkuboitiin aliryhmään yön yli 4 ° C: ssa. Tämän jälkeen levyjä pestiin kaksi kertaa 15 minuutin ajan PBS: lla, 5% Tween 20: tä ja kaksi kertaa 15 min HPLC-laatuista vettä. Lopuksi levyt kuivattiin SpeedVac ja skannattu korkearesoluutioinen confocal skanneri (Affymetrix array skanneri 428 TM, High Wycombe, UK). Slide kuvat analysoitiin käyttämällä Spotfinder 3.1.1 ohjelmisto (TM4, Dana Faber Cancer Institute, Boston, USA). Taustan vähentäminen suoritettiin seuraavan kaavan mukaan: spot intensiteetti = keskimääräinen intensiteetti SP – (sum bkg – sum top25 BKG) /(lukumäärä pixelSP – pikselien määrä top25 BKG), jossa SP mikä tahansa paikka, bkg vastaavan taustan ja top25 bkg top 25% taustan pikselin.

tilastollinen analyysi microarray tietojen teimme log10 muutos, z pisteet ja z-suhde laskelmat [28]. Välisenä-ryhmä vertailuja käytimme merkki testi ja, mikäli mahdollista, Wilcoxonin testi (vinous [-1, + 1]) ja rasiakuvaajien grafiikkana (PASW tilastot 18,0). Ei säätöä useiden testaus suoritettiin. Analyysit pidettiin tutkivan ja p arvot vastaavat testit on esitetty kuvaileva syistä. Tulokset näistä testeistä ei näin ollen voida pitää merkittävinä millään tasolla.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR

Yhteensä-RNA: t valmistettiin käsitellyn ja käsittelemättömän fibroblastiviljelmät käyttäen TRIzol menetelmää (Invitrogen ). Yksi mikrogramma RNA Näytteiden käänteisesti cDNArksi käyttäen SuperScript III Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR on

RAD9A

suoritettiin QuantiTect Primer Pitoisuus (Qiagen, Hilden, Saksa) ja Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmän (Life Technologies, Karlsruhe, Saksa). Eksoni-ulottuu eteenpäin (5′-GAGAAGACGGTGGAAAAATG-3 ’) ja reverse (5′-GGAAGGACAGGTTGTGAGTC-3’) alukkeet suunniteltu Primer3, versio 0.4.0 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ohjelma. Lineaarisuus vahvistus todennettiin qPCR standardikäyrää ja sekvenssianalyysillä.

RRN18S

(Qiagen, # QT00199367) ja

TBP

(# QT00000721) käytettiin endogeenisen kontrolligeenin. Kaikki reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kukin 25 ui reaktiotilavuudessa sisälsi 25 ng cDNA: ta templaattina 10 ul RNaasi-vapaata PCR luokiteltava vettä, 2,5 ui 10x QuantiTect Primer määritys ja 12,5 ui 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). PCR suoritettiin kahdessa vaiheessa: yksi sykli 95 ° C: ssa 15 min (ensimmäinen vaihe) ja 40 sykliä 94 ° C: ssa 15 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 40 s (toinen vaihe).