Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syövän (CRC) tutkimus on hyötynyt suuresti saatavuudesta pieneläinten kasvainmuodoista. Spontaani ja kemikaalien aiheuttamien CRC mallia käytetään laajalti vielä rajoitettu niiden yhtäläisyyksiä ihmisten sairauksien ja usein pitkäaikainen, ei tarkasti toistuvat ja yhdistetty tulehdukselliseen sivuvaikutuksia. In-situ hiiren tai ihmisen kasvaimen istutuksen ruoansulatuskanavassa hiirillä on erittäin haastava, ja rajoittaa eläinten väliset erot ja vaihtelut menettely liittyviin komplikaatioihin ja kuolleisuuteen. Tämän seurauksena vuonna usein tutkimuksissa CRC on istutettu distaalisessa sivustoja, yleisimmin ihonalaisen alue, lähestymistapa, joka on suuresti rajoittaa puuttuminen normaalin ruoansulatuskanavan kasvain miljöö ja vaikuttaa olennaisesti kasvainten kehittymiseen.

Tavoitteet

tässä tutkimuksessa tavoitteena oli kehittää hyvin siedetty toistuva työkalu tutkia CRC pieneläimillä sopeuttamalla hiiren kolonoskopia järjestelmä toimimaan alustana paksusuolen Saharan limakalvon potilaalle tehdä istuttaminen ihmisen ja hiiren CRC syöpäsoluja.

tulokset

Raportoimme perustamalla uusi pienen eläin CRC malli, joka on vähän invasiivisia, nopea, hyvin siedetty, hyvin toistettavissa, ja antaa tarkan ohjauksen kasvain lukumäärä, sijainti ja kasvu korko. Lisäksi osoitamme, että tämä malli ainutlaatuisesti mahdollistaa side-by-side induktio erillisten geneettisesti manipuloitu kasvaimia, mahdollistaa mekanistinen tutkimus kasvaimen vuorovaikutuksen ja cross-talk sisällä natiivi suoliston microenvironment.

Johtopäätökset

Työllisyys tämän uuden lähestymistavan saattaa olla merkittävä tekninen etukäteen

in vivo

tutkimus CRC.

Citation: Zigmond E, Halpern Z, Elinav E, Brazowski E, Jung S , Varol C (2011) käyttö Hiiren Kolonoskopia varten Orthotopic Istuttaminen peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10,1371 /journal.pone.0028858

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu: 12 joulukuu 2011

Copyright: © 2011. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Crohnin Paksusuolitulehdus Foundation of America (CCFA) (ja S. J., numero – 7108160101; verkkosivusto: www.ccfa.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syövän (CRC) on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus monissa teollisuusmaissa [1]. CRC mallia pieneläimillä ovat antaneet tärkeitä välineitä tutkia taustalla etiologic ja patofysiologisia mekanismeja CRC kehityksen ja prekliinisissä arviointia uusien hoitomuotojen. Lukuisat hiiren CRC on kehitetty ja kuvattu kirjallisuudessa [2], [3]. Tärkeimmät lähestymistapoja ovat mutanttihiirissä, jotka kehittävät spontaanin kasvaimia, hoito laaja valikoima syöpää aiheuttaville aineille, tai ilman induktiota krooninen tulehdus, ja ektooppinen tai ortotooppinen implantaatio kasvainsolujen.

Spontaani CRC siirtogeenisen hiiren kantoja läheisesti matkivat ihmisen syövän oireyhtymät, kuten perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC) [4] ja familiaalinen adenomatoosi polypoosin (FAP) [5]. Nämä mallit ovat osoittautuneet korvaamaton tutkimuksen vaikutuksista tunnettujen geneettisten muutosten on taudinkulku. Kuitenkin monet näistä hiirimalleissa muodostavat adenoomia pääasiassa ohutsuolessa, ja liittyy yleensä hidas kasvu ja huomattava eläinten välisiä vaihtelevuus [3] APC

Min /+ Hiirikanta perustettiin perustuu tuloksiin johdettu peräisin ituradan mutageneesi tutkimuksessa N-etyyli-N-nitrosourea yhdistettynä fenotyyppisiä seulonta [5]. Vaikka tämä malli liittyy ulkonäkö suuri määrä hyvänlaatuisia adenoomia ohutsuolessa, CRC kasvaimet kehittävät vähemmän kuin puolet eläimistä. Kuitenkin hoidettaessa näitä hiiriä kanssa syöpää aiheuttavaksi tekijäksi azoxymethane (AOM) lisää merkittävästi kasvainten esiintyvyys kaksoispisteet näiden hiirten, ja tämä malli on osoittautunut hyödylliseksi tutkittaessa vaikutuksia chemopreventive yhdisteiden [6], [7].

Inducible CRC hiiri malleja, toisaalta, ovat yleisesti käyttöön perustuvat erilaisten karsinogeenisia yhdisteitä, kuten azoxymethane (AOM), 1,2-dimetyylihydratsiinia (DMH) ja muut [2]. Kemiallisesti aiheuttama olevien kasvainten monia yhteisiä histopatologisia ominaisuuksia periytymättömiä ihmisen CRC [2], [8]. Kasvaimen kehittymisen näissä malleissa on raportoitu olevan välillä 30 viikkoa. Erityisesti yhdistelmä syöpää yhdisteen krooninen tulehdus, kuten tapauksessa AOM /dekstraaninatriumsulfaatti (DSS) -malli, on osoittautunut lyhentää viiveaikaa havaittu klassisen mallin noin 10 viikkoa, ja kohdistaa induktion kasvainten pääasiassa distaalinen paksusuolen [8], [9]. Nämä edut sekä sen korkea teho, yksinkertainen käyttötapa, monenlaisia ​​alttiuden, ja suhteellinen kustannustehokkuus, ovat tehneet tämän mallin hyvin yleinen CRC tutkimukseen, ja erinomainen tutkimuksen välineenä tutkia varhain karsinogeenisia tapahtumia ja arvioida mahdollisia terapeuttisia lähestymistapoja [2], [8]. Kuitenkin, tässä mallissa kasvaimet kehittävät alla ympäristön vaikutuksia kroonisen tulehduksen, tila, joka jäljittelee tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) -associated CRC, mutta ei paljon yhteistä satunnaista ihmisen CRC. Mikä tärkeintä, CRC

in-vivo

malleja edellä mainittu kärsii luonnostaan ​​kyvyttömyydestä kontrolloida kasvaimen numeroita ja kasvun kinetiikkaa.

Useat ortotooppisten hiiren CRC malleja on kuvattu, joista useimmat vaativat operatiivinen lähestymistapa injektio tai implantaatio syöpäsolujen paksusuoleen tai umpisuolen kerrosta [10], [11]. Monimutkaisuus kirurgisen, tuloksena trauma, menettely liittyvää tulehdusta ja kuolleisuutta, rajoittavat vakavasti arvoa näiden järjestelmien tutkimukseen synnynnäisen ja adaptiivisen kasvainten vastaisen immuunivasteen.

Ihmisillä tähystystutki- paksusuolen on tärkein tapa löytö ja jatkohoidon CRC. Äskettäin

in vivo

hiiren tähystys on kehitetty mahdollistaa korkean resoluution kuvantaminen paksusuolen elävissä hiirissä, ja tutkijat voivat suoraan visualisoida ja pisteet patologisten kudosten muutokset paksusuolessa [12], [13] ja sisäisessä Machine Kin-vatsa- elimet [14]. Lisäksi toimenpiteiden kuten toistettavissa koepaloja koolonin vammojen elävissä hiirissä aikana sekä seurantajakson ajan kokeesta ja niiden myöhempi proteomiikka-analyysi ovat ottaneet käyttöön uusia tehokkaita työkaluja CRC tutkimuksen [15].

Esitämme täällä ensimmäistä kertaa mukauttamista hiiren kolonoskopia ja sen työtä varten perustetaan uusi potilaalle tehdä hiirimallissa CRC. Tämä lähestymistapa tarjoaa helpon ja yksinkertaisen ratkaisun tekniset rajoitukset, jotka liittyvät nykyisten CRC mallia.

Tulokset

perustaminen potilaalle tehdä hiirimallissa CRC hyödyntäen hiiren kolonoskopia järjestelmä

Pieni eläin tähystys pidetään nykyään kultakantaan väline valvontaan paksusuolen tulehduksellisten sairauksien ja CRC. Jotta sopeutua tähän järjestelmään varten potilaalle tehdä istuttaminen CRC kasvainsoluja paksusuolen Saharan limakalvon olemme suunniteltu injektioneulalla, joka voi kulkea endoskooppinen vaipan työskentelykanavalle Karl Storz Coloview miniendoscopic järjestelmään. Ihonalaisen neulat olivat mittatilaustyönä saamiemme toiveiden Cadence Inc. USA, ja on valmistettu 8 tuumaa pitkä joustava ruostumaton joustava teräs, jossa on 30 gaugen ulkohalkaisijat, ja lyhyt viiste 45 asteen enkeli (kuva S1). Tämä hypodermisellä neulalla antaa useita suunnittelu etuja; joustava teräs yhdessä neula mitat lievittää injektio liikkumavaraa ja mahdollistavat sujuvan läpi työ- kanavan ja Luer, joka kierretään sen välttämiseksi ilmavuodot. Lisäksi tylppä viiste sallii injektiona Saharan limakalvon vähäisempi riski rei’itystarvikkeet tai vuotaen injektoidun materiaalin ontelon. Ensin tarkasteltiin kudosjakaumasta pistetään reagenssien ja arvioi sopivan Injektiotilavuuden ruiskuttamalla musteella värimerkkaus- osaksi paksusuolen Saharan limakalvon kerros. Injektio 50 ui antoi parhaan yhdistelmän minimaalinen vuodon ja polttoväli sironta musteen alla epiteelin kerros (kuvio 1A). Huuhtelu paksusuolen ontelon soveltamalla suolaliuosta kautta tutkimisen vaipan endoskoopin vahvisti lokalisoinnin pistetään musteen alla epiteelin kerros (Elokuva S1). Histologinen analyysi vahvisti, että musteella pysyy sisällä paksusuolen lamina propria jopa 5 päivää sen jälkeen, kun potilaalle tehdä injektion (kuvio S2A). Tärkeää on, histologinen analyysi injektoitujen hiirten steriiliä Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos ilman kalsiumia ja ilman magnesiumia (PBS

– /-) paljasti normaalin terveen paksusuolen arkkitehtuuria pistoskohdan vahvistetaan, että tämä menetelmä on vähän invasiivisia (kuvio S2B).

(A) Paksusuolentähystys kuva esittää paksusuolen Saharan limakalvon injektio Intian muste väriaine C57BL /6 hiiri arvioimiseksi sopivan injektiotilavuus ja sen jakelu on paksusuolen lamina propria. (B) edustaja colonoscopy kuvat osoittavat asteittaista kehittymistä CRC kasvain samassa C57BL /6 hiiri seuraavat potilaalle tehdä istuttaminen 1 x 10

5 MC38 CRC soluja päivä 5, kautta päivä 12 päivään 19 (C-D) edustavia kuva histologia näytteestä värjättiin hematoksiliinilla ja eosiinilla (H 0,05) kaikissa aikapisteissä prosenttiosuus paksusuolen ympärysmitta sekä kasvaimen. Poikkeuksellinen oli vertailu kasvaimen välillä 10E4 10E5 ryhmien viikolla 3, koska suurin osa kasvainten nämä ryhmät olivat jo luokka 5, joka sisältää kaikki kasvaimet yli 50% paksusuolen kehän.

(A) edustaja kolonoskopia kuvia osoitetaan korrelaatio määrä ruiskutetaan MC38 kasvainsolujen ja koko vahvistetaan CRC kasvaimen 3 viikkoa seuraavat ortotooppisten kasvainsolun istutuksen. (B) Kuvaajat yhteenveto kasvun kinetiikka, ympärysmitta prosenttiosuus ja kehitykseen luokan paksusuolen kasvain korrelaation määrän pistetään MC38 CRC soluja. Huomautus nopeaan perustamiseen luokka 5 kasvainten jo 2 viikkoa istuttamisen jälkeen vain 1 x 10

5 MC38-CRC soluissa. Kukin ryhmä koostui 5 hiiren.

Yhdessä luomme täällä uuden menetelmän tehokkaan potilaalle tehdä kiinnittymisestä CRC kasvainten käyttäen hiiren tähystys nopeasti ja mini-invasiivisen tavalla, jossa on rajoitettu määrä soluja tarvitaan injektiota, ja ehdoton kontrolli kasvainten ilmaantuvuus, sijainti ja kasvukinetiikat.

Orthotopic istuttaminen geneettisesti manipuloitu CRC-kasvainsoluja

Yksi eduista syövän istutuksen yli spontaani kehittämiseen kasvainmuodoista on kyky geneettisesti muokata muodostuneen kasvaimen. Osoituksena Periaatteessa me pistetään BALB /c-hiiriin 1 x 10

5 CT26 hiiren CRC-solut, jotka oli aiemmin geneettisesti manipuloitu ilmaista lusiferaasi. Koko kehon bioluminesenssi optisen kuvantamisen (Biospace Photon Imager) ilmeni, että CRC-kasvain nimenomaan pistoskohdan ympärillä, joka voi olla vielä puoliksi määrällisesti mukaan sen synnyttämä luminesenssi (kuvio 3A). Erityisesti, tämä lähestymistapa voi olla käyttökelpoinen arvioitaessa kasvaintaakat tarvitsematta uhrata hiirillä. Lisäksi aito etu endoskooppinen implantaatiomallissa on kyky istuttaa useita vierekkäisiä vielä selvä kasvaimia samassa hiiren, joita muuntogeenisten yli-express tai hiljaisuus kiinnostavat geenit, jotka mahdollistavat niiden suora vertailu identtisellä isännän miljöö. Käyttämällä lentiviruksen reportteri, meidän transdusoitu kaksi erillistä loisteputki reportteri geenejä MC38 solulinjaan perustaa MC38-GFP ja MC38-RFP linjat (kuvio 3B ylempi vasen paneeli). Injektio MC38-GFP solut ja niiden viereen MC38-RFP soluissa johti yhteistyössä muodostaa kaksi geneettisesti identtisiä kasvaimia, jotka vaihtelevat vain niiden sijainnin ja ilmentymistä lisätty reportterigeeneistä (kuvio 3B alempi vasen paneeli ja oikea paneeli) .

(A) Värikoodatut edustavan kuvan koko kehon bioluminenssin optisen kuvantamisen BALB /c-hiirten 2 viikkoa seuraavat osa-limakalvon injektion PBS

– /- (hiiren) tai 1 x 10

5 CT26 CRC ilmentävien kasvainsolujen lusiferaasi ja 10 minuutin kuluttua ip-injektion D-Luciferin. Huomaa luminesenssi päästöjä nimenomaan alueen pistetään CRC kasvainsolujen (hiiren). (B) Ylempi vasen paneeli – fluoresoiva stereo-mikroskooppinen kuva päällekkäin kuva graafinen kuva vastaanottajan C57BL /6 hiiren paksusuolen 3 viikkoa sen jälkeen, kun potilaalle tehdä injektion kanssa MC38 CRC soluja, jotka olivat geneettisesti manipuloitu lentiviraalinen reportterijärjestelmän ilmaista RFP, suurennus x10. Down vasen paneeli – kolonoskopia kuva C57BL /6 hiiren paksusuolen seuraavat potilaalle tehdä istuttaminen 2 vierekkäistä MC38 CRC kasvainsoluja; MC38-RFP (punainen nuoli) ja MC38-GFP (vihreä nuoli). Oikea paneeli – fluoresoiva stereo-mikroskooppinen kuva päällekkäin kuva graafinen kuva vastaanottajan C57BL /6 hiiren avattu Pilkku 2 viikkoa side-by-side potilaalle tehdä injektion MC38-RFP (distaalinen) ja MC38-GFP (proksimaalinen) CRC kasvainsoluja, suurennus x10. Huomaa induktio 2 vierekkäistä CRC kasvaimia, jotka eroavat toisistaan ​​vain ilmentymisen transdusoitujen reportterigeenin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

kuvaamme tässä uutta potilaalle tehdä hiiren CRC mallia, joka perustuu mukauttamista kaupallisesti saatavilla miniendoscopy järjestelmä, joka antaa monia etuja verrattuna tunnettuihin hiiren CRC malleja. Se on helppo käyttää, vähän invasiivisia, ja hyvin toistettavissa menettely, jota voidaan käyttää hiiriä geneettistä taustaa. Tässä mallissa sekä hiiren ja ihmisen CRC-kasvaimet voidaan indusoida. Mallin avulla myös tarkan hallinnan kasvaimen esiintymistiheys ja sijainnista paksusuolen. Lisäksi tämä menetelmä mahdollistaa täydellisen kontrollin kasvaimen kasvun kinetiikkaan; se voi olla hyvin nopeaa saavutti asteen 5 2 viikon kuluessa kiinnittymisestä vain 1 x 10

5 kasvainsoluja, tai voi hidastaa sitä ruiskuttamalla pieni määrä soluja. Tärkeää on, tämä lähestymistapa välttää vahinkoja ja tulehdusta nähty monissa muissa tällä hetkellä työssä malleja. Lisäksi yksilöllisesti mahdollistaa induktion geneettisesti manipuloitu CRC-kasvaimia ja vertailu useita erillisiä kasvainten perustettu side-by-side samalla hiiren vältetään eläinten väliset vaihtelut.

ektooppinen implantoitu ihon alle kasvainsolulinjojen on laajalti käytetty tutkimuksen välineenä, erityisesti sen arvioimiseksi, sytostaatit hoitointerventioiden [17]. Kuitenkin kohdunulkoinen istutusta oteta huomioon monimutkaisuus ainutlaatuinen ominaisuus meikki natiivin microenvironment. Itse asiassa se on vakiintunut, että incongruent isäntä strooman voi vaikuttaa tuumorigeenisyyteen ja solukierron säätelyssä verrattuna istutettavien luontaisen kudoksen sängyn [18], [19]. Etuna valitsemalla potilaalle tehdä lähestymistapa on erityisen tärkeä suoliston miljöö, joka on koti ainutlaatuinen immunologisten solu- ja molekyylitason kokonaisuuksia, jotka asuu jatkuvassa vuorovaikutuksessa mikrobiston ja konstitutiivista altistumista ravinnon antigeeneille.

Suorituskyky yli 200 potilaalle tehdä CRC implantations käytetään tätä menetelmää on varmistanut, että tämä malli on hyvin siedetty ja hyvin toistettavissa. Kuitenkin mahdollinen komplikaatio menettely on rei’itys paksusuolen ja mahdollisesti ilman vuoto ja solujen vatsaontelo. Tällä hetkellä meidän käsissämme, tämä komplikaatio on harvinainen, joiden osuus on pienempi kuin 5 prosenttia kaikista menettelyistä. Kuolleisuus menettelyn aikana on erittäin harvinainen ja voi johtua anestesian tai rei’itys. Kasvainvaikutuksen elossa hiirillä (95%) on 100%, aina huipentui ainoa kasvainten kehittymiseen nimenomaan injektiokohdassa. Huomattavaa on, että käyttämällä jäykän laajuus mahdollistaa pääsyn ainoastaan ​​distaalisen puolet paksusuolen ja siten rajoittaa potilaalle tehdä istutusta tämän lähestymistavan tällä alueella.

CRC on edelleen toiseksi suurin syy syövän kuolleisuutta monissa teollisuusmaissa. Kokeet tehdään pieniä eläimiä ovat osoittautuneet olennaisen tärkeää ymmärrystä taudin patofysiologia sekä prekliinisten arviointia uusien hoitomuotojen. Kuitenkin hiiren CRC malleja rajoittavat niiden samankaltaisuus ihmisen sairauden. Tämä on erityisen totta, muodostamista koskevia CRC kasvaimen etäpesäkkeitä. Yksi merkittävä haitta CRC hiirimalleja on yleinen puute invasiivisen ja metastaattisen fenotyypin [2]. Vuonna AOM /DSS malli infiltroiva johdot epiteelisolujen kuvattiin rikkomaan muscularis limakalvon ja saavuttaa myös osa-limakalvon imunestejärjestelmän, vaikkakin hyvin harvoin [20]. Samoin me harvoin todistamaan paikallinen invasiivisuus Kasvainten peräisin olevat solut, mutta ei koskaan havaita distaalinen etäpesäkkeitä käyttämällä lähestymistapaa. Suhteellisen nopea kasvu kinetiikka liittyy mallimme, joka uskottelee varhainen uhri istutettu hiiriin huolehtiva arvosana 5 CRC kasvain, on luultavasti tulossa haittaa induktion metastaattinen kasvain. Itse asiassa, vaikka potilaalle tehdä istuttaminen ihmisen CRC solujen, tiedetään olevan aggressiivisesti metastaattinen, ei aiheuttaa metastaattinen kasvain. Yhteinen este yhteinen hiiren CRC mallien perustaa etäpesäkekasvainten voi merkitä sitä, että suoliston hiiren miljöö ei ole tukevaa etäpesäkkeiden muodostumista. Kuitenkin tämä voi olla kääntää haluttuun malliin järjestelmä niille, jotka haluavat tutkia mahdollista roolia pahanlaatuisten geenejä. Tämän tueksi, järjestelmämme voidaan käyttää indusoida geneettisesti manipuloitu kasvaimia, jossa me yli-express tai hiljaisuus kiinnostavat geenit.

Uskomme, että tämä uusi potilaalle tehdä CRC malli on merkittävä tekninen etukäteen

in vivo

tutkimus CRC, ja voidaan erityisesti käyttää tutkimaan uusia hoitomuodot, kasvain n genetiikan ja kasvun mekanismit, ja sen vuorovaikutusta yhteydessä natiivin suoliston microenvironment.

Methods

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Tel Aviv Sourasky Medical keskus eettisen komitean eläinkokeissa ja sopeutui korkeimpien kansainvälisten standardien inhimillinen eläinten hoito biolääketieteellisen tutkimuksen alalla. Hyväksyntänsä numero – 037_b3428_8.

Eläimet

8-10 viikkoa-vuotiaiden miesten C57BL /6, Balb C ja Kateenkorvattomia nude hiiret saatiin Harlan biotekniikan (Rehovot, Israel). 8-10 viikkoa ikäiset miehet NOD-SCID-hiiriä ystävällisesti prof. Tsvee Lapidot’n (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

Kateenkorvattomia nude-hiiriä Saharan lethaly säteilytetty (450 rad) ennen potilaalle tehdä kiinnittymisestä ihmisen CRC solulinjojen poistamiseksi immunologiseen hylkäämistä. Eläimillä oli rajoittamaton pääsy ruokaan ja veteen, pidettiin lämpötila ja kosteus-ohjattu huonetta, ja pidettiin päällä 12 tunnin valo /pimeä sykli.

kolorektaalisista kasvainsoluja

Hiiren C57BL /6 CRC kasvainsoluja (MC38) ystävällisesti Dr. Avi Eisenthal (Tel Aviv Sourasky Medical Center). Luciferase stably- transfektoituja hiiren CRC kasvainsoluja (CT26) oli ystävällisesti professori Lea Eisenbach (Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). Ihmisen CRC tuumorisolulinjoja SW620, SW480 ja LS174T ystävällisesti toimittanut prof. Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). HT-29 ihmisen CRC solu- linja oli antelias lahja tri Isabel Zvibel (Tel-Aviv Sourasky Medical Center, Tel-Aviv, Israel). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä 5% CO

2 37 ° C: ssa runsaasti glukoosia DMEM väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini streptomysiiniä antibiootin liuosta, 1% L-glutamiinia liuosta, ja 1%: ista pyruvaattia ratkaisu.

Generation MC38 CRC ilmentävien kasvainsolujen GFP tai RFP

MC38-GFP: n ja MC38-RFP CRC kasvainsoluja muodostettiin transduktiolla PCSC-SP-PW-IRES-GFP /RFP Lentiviruksiin suunniteltu ilmentämään GFP tai RFP kanssa MOI 50 (ystävällisesti tri Alon Chen, Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). Myöhemmin MC38 solut, jotka ilmentävät GFP tai RFP lajiteltiin korkeaan puhtauteen käyttäen nopea FACSAria II lajittelija (Beckton-Dickinson).

Hiiren endoskooppinen järjestelmä

Meillä työskentelee korkearesoluutioinen hiiri video endoskooppinen järjestelmä ( ” Coloview järjestelmä ”) on aikaisemmin kuvattu hiiren endoskooppiset menettelyistä [12] – [14], joka koostuu pienoiskoossa endoskoopin (laajuus 1,9 mm ulkohalkaisija), ksenon valonlähde, kolminkertainen siru kamera, ja ilmapumpun saavuttaa säännelty inflaatio hiiren suolen (Karl Storz, Tuttlingen, Saksa). Endoskooppinen menettely katsellaan värinäytöllä ja digitaalisesti tallennettu nauhalle.

Orthotopic paksusuolen Saharan limakalvon istuttaminen CRC solujen

Hiiret nukutettiin käyttäen ketamiinia /ksylatsiinia. Sub-limakalvon injektiot suoritettiin käyttämällä ruostumatonta joustavaa ruostumatonta terästä; 8 tuumaa pitkä, 30 mittari ja 45 asteen viiste neulat mittatilaustyönä saamiemme toiveiden (Cadence Inc. U.S.A.). Neula työnnettiin läpi Luer lock (Söllner, GmbH) ruuvattu työkanavassa laajuuden välttämiseksi ilmavuodot. Myöhemmin laajuus insertoitiin hiiren paksusuolen ja sen jälkeen inflaatio neula tuotiin läpi työskentelykanavalle soveltamisalaa n edestä. CRC soluistutusryhmä menettely suoritettiin kaksi koordinoitu henkilöitä; yksi henkilö navigoinnin kolonoskopia kun taas toinen henkilö toimi pistoksen liikkumavaraa. Injektio suoritettiin tarkkailtavana jota hyvin lempeä Saharan limakalvon levinneisyys avoin puoli viiste menossa ylös tasainen kulma. Tilavuus 50 mikrolitran CRC kasvainten soluja injektoitiin sitten paksusuolen osa-limakalvolle.

In vivo

kuvantamisen

seuraa lusiferaasia ekspressoivan CT26 CRC kasvaimen istutuksen ja kasvu BALB /c-hiirissä, 50 ui D-lusiferiini (30 ug /ml) oli ip injektoitiin 10 minuuttia ennen ja jälkeen hiiret työnnetään suljettuun pimeään kammioon koko kehon jäähdytettiin CCD-kamera Photon Imager-järjestelmän (Biospace Lab, Ranska) . Sillä

in vivo

visualisointi GFP ja RFP kasvaimia Leica MZ16F loisteputki stereomikroskooppikäyttöön järjestelmää käytettiin (Leica Microsystems, Saksa).

Histologia

Kudokset fiksattiin 4% paraformaldehydi yön yli 4 ° C: ssa, upotettiin parafiiniin, sarjaan leikattiin (15 um), ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (Sigma).

Objektilasit havaittiin käyttämällä Olympus BX51 mikroskoopilla, ja kuva hankinta suoritettiin kanssa Olympus DP70 kamera ja DP-Manager -ohjelmisto.

CRC kasvaimen kasvukinetiikat

C57BL /6-hiiriä ortotooppisesti Saharan limakalvon ruiskutettiin 10

3, 10

4, tai 10

5 MC38 solut. Kasvain on paksusuolen ympärys ja kehitysvaiheeseen seurattiin ajan kolonoskopialla viikoittain 3 viikon ajan soluistutusryhmä. Endoskooppinen luokittelu tehtiin mukaan kasvaimen koon suhteen kehän paksusuolen perustetun Becker et al [12]. Lyhyesti, kasvaimen koko luokiteltiin seuraavasti: Grade 1 (vain havaittavissa kasvain), luokka 2 (kasvain, joka kattaa enintään 1/8 paksusuolen ympärysmitta), luokka 3 (kasvain, jotka kattavat enintään 1/4 paksusuolen ympärysmitta), Grade 4 (kasvain, jotka kattavat enintään 1/2 paksusuolen ympärysmitta) ja luokka 5 (kasvain, joka kattaa enemmän kuin 1/2 paksusuolen ympärysmitta).

tilastollinen analyysi

tulokset analysoitiin yksisuuntainen ANOVA ja post analyysi Bonferronin monivertailu testejä.

tukeminen Information

Kuva S1.

räätälöity neulat käytetään ortotooppisesti pistää kasvainsolujen osaksi paksusuolen Saharan limakalvon. Ihonalaisen neulat on valmistettu 8 tuumaa pitkä joustava ruostumattomasta teräksestä, jossa on 30 gaugen ulkohalkaisijat, ja lyhyt viiste 45 asteen enkeli. Huomaa, että neula työnnetään Luer joka myöhemmin ruuveilla työskentelykanavalla endoskoopin välttämiseksi ilmavuodot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0028858.s001

(TIF) B Kuva S2.

Sub-limakalvon injektiot PBS

– /- musteella. Edustavat kuvat histologia näytteitä värjättiin hematoksiliinilla ja eosiinilla (H LS174T ihmisen CRC solulinjoissa, vastaavasti.