Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Products liittyvä polypeptidejä 2 (LAP2) on ydin- proteiini, joka yhdistää tumalevy kromatiinin kanssa. Vaikka sen kriittinen roolit geneettisiä häiriöitä ja hematopoieettisten pahanlaatuisia kasvaimia on kuvattu, sen ilmentyminen ja roolit ruoansulatuskanavan syöpiin on huonosti tunnettu.

Methods

ekspression tutkimiseksi LAP2 potilaan kudoksissa, suoritimme immunohistokemia ja reaaliaikainen PCR. Tutkia motiliteetti syöpäsolujen, käytimme Boyden kammion, haavan paranemista ja Matrigeliä invaasio määrityksissä. Paljastamaan roolit etäpesäkkeitä in vivo, käytimme maksan etäpesäke ksenograftimallissa. Tutkia oleva mekanismi, cDNA microarray tehtiin.

Tulokset

immunohistokemia potilaan kudoksissa osoitti laajaa ilmentymistä LAP2 erilaisissa ruoansulatuskanavan syöpien kuten vatsa-, haima-, maksa- ja sappitiehyeiden syöpien . Reaaliaikainen PCR vahvisti, että LAP2β on yli-ilmentynyt mahasyövän kudoksissa. Knockdovvn LAP2β ei vaikuttanut leviämisen useimmat ruoansulatuskanavan syöpäsoluja paitsi haiman syöpäsoluja. Kuitenkin knockdovvn LAP2β vähentynyt motiliteetti kaikkien testattujen syöpäsoluja. Lisäksi yliekspressio LAP2β lisääntynyt liikkuvuus mahalaukun ja haiman syöpäsoluja. Maksassa etäpesäke ksenograftimallia, LAP2β lisääntynyt metastaattinen teho mahalaukun syövän solujen ja kuolleisuutta testattiin hiirillä. cDNA microarray osoitti mahdollisuutta, että Myristoylated alaniini-rikkaan C-kinaasin substraatti (MARCKS) ja interleukin6 (IL6) voivat välittää LAP2β-säädellään motiliteettia syöpäsoluja.

Päätelmät

Edellä olevista tuloksista, me päätellä LAP2 on laajalti yli-ilmennetään erilaisia ​​ruoansulatuskanavan syöpien ja LAP2β säätelee liikkuvuuteen syöpäsolujen ja viittaavat siihen, että LAP2β voi olla käyttöä diagnostiikan ja terapeuttisten ruuansulatuskanavassa syövissä.

Citation: Kim HJ, Hwang SH, Han ME , Baek S, Sim HE, Yoon S, et ai. (2012) LAP2 laajalti yli-ilmennetään Monipuolinen ruoansulatuskanavan syöpien ja Säätelee Liikkuvuus syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (6): e39482. doi: 10,1371 /journal.pone.0039482

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 08 syyskuu 2011; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2012 Julkaistu: 20 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Medical Research Institute Grant (2010-25), Pusan ​​National University Hospital, lääketieteen tutkimuskeskuksen ohjelma opetus-, tiede- ja teknologia /Korean Science and Engineering Foundationin (2011-0006190) ja National Core Research center Program opetus-, Science and Technology (nro R15-2006-022-01001-0). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasis syöpäsolujen vaikuttaa suuresti ennuste syöpäpotilailla. Eloonjäämisaste potilailla, joilla on kaukainen etäpesäke on huomattavasti alhaisempi kuin ne, jotka ovat lokalisoitu kasvain useimmissa syöpätyypit [1]. Yksi kriittisiä tekijöitä etäpesäkkeitä on motiliteettia syöpäsolujen [2]. Monia kriittisiä molekyylejä, jotka säätelevät motiliteettia syöpäsolujen on tunnistettu. Koska esto maahanmuutto on tehokas hoidettaessa etäpesäkkeitä monin tavoin, monet maahanmuuttoa estäjät ovat alle kliinisen kehityksen [3]. Esimerkiksi Rho-kinaasi on pieni GTPaasina joka säätelee aktiini ja mikroputkijär- verkon ja matkapuhelinverkon ulokkeita. Joten, estäjä joka kohdistuu Rho-kinaasia on alle kliinisen kehityksen [3].

Products liittyvä polypeptidejä 2 (LAP2) on yksi LEM-domain proteiineja, jotka ovat sisempi tumakalvoa proteiineja, joilla on yhteinen motiivi noin 40 aminohappoa, tunnettu LEM-domeenin [4], [5]. LEM-verkkotunnuksen proteiinit yhdistää sisemmän tumakalvoa ja tumalevy kromatiinin kanssa muurin läpi-to-autointegration kerroin (BAF). Perhe LEM-verkkotunnuksen proteiinit sisältää LAP2 [6], [7], [8], emerin [9], Man1 [4], LEM2 [10] ja LEM3 [11]. Nimi LEM juontuu LAP2, Emerin ja Man1 [4].

Lisäksi niiden rakenteellinen rooli tumakalvoa, LEM-domain proteiinien on osoitettu kriittisiä rooleja solujen eri prosesseissa, kuten DNA: n replikaatiota ja geenin ilmentymisen säätelyyn. LAP2β säätelee DNA: n replikaatiota olemalla vuorovaikutuksessa HA95 aikana G1 vaiheen solusyklin [12]. Tämä vuorovaikutus HA95 johtaa prereplication komplekseja replikaation ja stabiloi sen. Häiriöt tämä vuorovaikutus aiheuttaa julkaisun prereplication monimutkaisia ​​osia ja laukaisee proteolyysin Cdc6.

Patologiset seurauksia on kuvattu LEM-verkkotunnuksen proteiinit geneettisiä häiriöitä ihmisillä ja kutsutaan yhteisnimellä laminopathies [5], [13 ]. Esimerkiksi Emerin puute aiheuttaa Emery-Dreifussin Lihasrappeuma (EDMD) [9], [14], [15] ja Man1 puutos johtaa osteopoikiloosi, Buschke-Ollendorf oireyhtymä ja melorheostosis [16]. Näiden lisäksi laminopathies, osallistuminen LAP2 karsinogeneesissä on kuvattu. Esimerkiksi, LAP2β on osoitettu olevan osallisena leviämisen pahanlaatuisten lymfosyyttien [12], [17], [18]. Lisäksi yliekspressio LAP2α ilmoitettiin kurkunpään, keuhkojen, vatsan, rinta- ja paksusuolen syövän kudoksissa [19].

LAP2 perhe LEM domeenin proteiineja, koostuu vähintään kuusi isoformit nisäkkäillä: α, β , γ, δ, ε, ζ, [6], [20], [21], [22]. Nämä isoformit synnytetään vaihtoehtoisella silmukoinnilla saman transkriptin. Kaikki isoformit paitsi nisäkkäiden LAP2α ja LAP2ζ ovat sisempi tumakalvoa proteiineja ja jakavat samanlaisen verkkotunnuksen organisaatio. N-terminaalinen segmentti sisältää LEM-domain ja LEM kaltaisen domeenin. Toisin kuin LEM-domain, LEM kaltainen domeeni voivat olla vuorovaikutuksessa suoraan chromatin ilman apua BAF. C-terminaalinen segmentti LAP2 proteiinien on lamiinivektori sitovaa domeenia. Erityisesti C-terminaalinen segmentti α-isoformin puuttuu membraania läpäisevä domeeni, niin proteiini on jaettava koko ytimen. Vaikka LAP2α, β, ja γ ilmaistaan ​​kaikkialle useimmissa nisäkässoluissa, tasauspyörästö ilmentyminen LAP2 isoformien on kuvattu. Eriytetyn kudokset erittäin ilmaista LAP2γ isoformin kuitenkin kudoksiin jakautuvat solut ilmentävät enemmän LAP2α ja LAP2β isoformit [23].

Vaikka kriittisen roolit geneettisiä häiriöitä ja hematopoieettisten pahanlaatuisia kasvaimia on kuvattu, ilmaisun ja roolit LAP2 muissa soluissa tai sairauksia ovat huonosti tunnettu. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ensimmäistä kertaa uuden roolin LAP2β säätelyssä motiliteetin syöpäsolujen ja yliekspressio LAP2 erilaisissa ruoansulatuskanavan syöpiin.

(A) immunohistokemiallinen värjäys osoitti yliekspressio LAP2 erilaisissa ruoansulatuskanavan syöpien kuten haiman, maksan, vatsan ja sappiteiden syövät. Huomautus yliekspressio LAP2 metastaattisessa syöpäsoluja. Mittakaava, 200 um. (B) yli-ilmentyminen LAP2β mahasyövän kudoksissa tutkittiin reaaliaikaisen PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita β-isoformi. GAPDH käytettiin normalisoimaan kaikki tiedot.

Western-blottauksella (A, B) ja reaaliaikaisella PCR: llä (C, D) käytettiin tehokkuuden määrittämiseksi pudotus (A, C) tai yli-ilmentymisen ( B, D) LAP2β in SNU638 tai PANC1 soluja. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* P 0,01, Studentin t-testi). (E) Vaikutus LAP2β pudotus on syöpäsolujen lisääntymistä. WST-1-määritystä käytettiin mittaamaan syöpäsolujen lisääntymistä, kun läsnä on 10% FBS: ää. Viisi päivää transfektion 100 nM LAP2β siRNA tai 100 nM salattu (SCR) siRNA, WST-1 runsaudenmäärityksessä suoritettiin. (F) vaikutus LAP2β ilmentymisen vaikutus syöpäsolujen lisääntymistä. WST-1 määritys suoritettiin SNU638 tai PANC1 solut yli-ilmentävät LAP2β geenin tai valvontaa vektorin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta in viitenä (* P 0,01, Studentin t-testi).

Methods

Soluviljelmät ja transfektio

Sen jälkeen ruoansulatuskanavan syöpä soluja käytettiin; mahasyöpä soluja (SNU216, SNU638), kolangiokarsinooma soluja (SNU1079, HuCCT1), haimasyövän soluja (PANC1, MIA-PACA2), maksasyöpä soluja (Huh7, HepG2). HuCCT1, HepG2, SNU216, SNU638, SNU1079 ja Huh7-soluja viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. PANC1 ja MIA-PACA2 soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DME) /korkea glukoosi, johon on lisätty 10% FBS: ää ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Useimmat solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2-inkubaattorissa. Solut transfektoitiin siRNA: lla käyttäen DhamaFECT Reagenssi 3 (Dhamacon, Lafayette, CO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssit siRNA ovat seuraavat: LAP2β siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5′-ACA AGA GGG UCA AGA AGA A (dTdT) -3 ’ja 5′-UUC UUC UUG ACC CUC UUG U (dTdT) -3 ”; salattu (SCR) siRNA (Dhamacon, Lafayette, CO, USA), 5’- GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ’ja 5’UUU CGC UCU UUU CGC GAU C (dTdT) -3’.

yli-ilmentyminen LAP2β

DNA ilmentämisrakenne pCMV-SPORT6-LAP2β (Thermo tieteellinen avoin biosysteeminä, Huntsville, AL, USA) käytettiin ajamaan yli-ilmentymisen ja G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA) käytettiin valinnassa. Solut ko-transfektoitiin pCMV-SPORT6-LAP2β /pIRES-Neo klo 05:02 suhteessa käyttäen FuGENE HD (Roche, Nutley, NJ), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. MDCK-solut määritettiin samanaikaisesti käyttäen tyhjä kontrollivektorilla.

Western-blottaus

Kun geelielektroforeesi ja siirretään PVDF-kalvolle, kalvo blokattiin yhden tunnin ajan. Kun oli lisätty primaaristen vasta-aineiden (hiiren anti-humaani LAP2β (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 1:1000) ja hiiren anti-α-tubuliinin (BioGenex, 1:10000)) estoliuoksessa kalvo inkuboitiin ensisijaisen vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli ravistelijassa. Sopivan sekundäärisen vasta-ainetta (1:2000, piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan ravistelijalla. Lopuksi, proteiinit havaittiin käyttäen LAS3000.

Boyden kammion määrityksessä (A-G), ja haavan paranemiseen määritys (H, SNU638 solut) käytettiin mittaamaan migraation syöpäsoluja. LAP2β siRNA inhiboi merkittävästi FBS- tai EGF-muuttoliikkeelle verrattuna SCR siRNA SNU638 (A, C), PANC1 (A, D) tai muita ruoansulatuskanavan syöpäsoluja (G). Yliekspressio LAP2β in SNU638 (B, E) tai PANC1 (B, F) solut merkittävästi lisääntynyt liikkuvuus verrattuna kontrolliryhmään vektorin (B, E, F). EGF: ää (100 ng /ml) tai 10% FBS: ää on käytetty indusoimaan kemotaksista. Mitomysiini C (0,01 ug /ml) lisättiin poistamaan vaikutukset proliferaation. Kaksi päivää transfektion jälkeen 100 nM LAP2β siRNA tai 100 nM salattu (SCR) siRNA, muuttoliikkeen määritykset suoritettiin. Neljä tai kuusi tuntia myöhemmin lisäämisen jälkeen EGF: n tai FBS osaksi Boyden kammion määrityksessä solut kiinnitettiin. Jälkeen naarmun haavan paranemista määrityksessä siirtyneet solut kiinnitettiin ilmoitettuina aikoina. Edustavia värjäytymistä siirtynyt solujen esiteltiin (A, B). Siirtyneet solut laskettiin, ja tulokset on esitetty graafisessa muodossa (C-G). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena (C-G, * P 0,01, Studentin t-testi).

Matrigel invaasiomääritys käytettiin mittaamaan hyökkäystä syöpäsoluja. Knockdovvn LAP2β inhiboi merkittävästi FBS- ja EGF-indusoitu invaasio verrattuna SCR siRNA SNU638 (A, C) tai PANC1 (A, D) soluja. Yliekspressio LAP2β in SNU638 (B, E) tai PANC1 (B, F-solut) lisäsi merkittävästi invaasio kontrolliin verrattuna vektori. EGF: ää (100 ng /ml) tai 10% FBS: ää on käytetty indusoimaan hyökkäystä. Mitomysiini C (0,01 ug /ml) lisättiin poistamaan vaikutukset proliferaation. Kaksi päivää transfektion jälkeen 100 nM LAP2β siRNA tai 100 nM salattu (SCR) siRNA, invaasio määritykset suoritettiin. Edustavia värjäytymistä tunkeutuneet solujen esiteltiin (A, B). Tunkeutuneet solut laskettiin, ja tulokset on esitetty graafisessa muodossa (C-F). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta kolmena kappaleena (CF, * P 0,01, Studentin t-testi).

Reaaliaikainen PCR

Mahasyöpää kudokset saatiin kirjallinen suostumus potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio at Pusan ​​National University Hospital ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital, ja tutkimus hyväksyi Institutional Review board of sairaaloiden (Luvan numero 2009-13). Kokonais-RNA olevia kudoksia tai soluja uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) tai RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) noudattaen valmistajan protokollaa. cDNA syntetisoitiin MMLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA), dNTP ja oligo-dT-alukkeita. Alukesekvenssit olivat seuraavat: LAP2β, 5′-AGG GCA GAG CAA AGA CTC CAG TAA CAA-3 ’ja 5′-TTA TTC CAG CTT GAG AAT AGC TCT GAT TGT GC -3′; MARCKS, 5’- GTG CCC AGT TCT CCA AGA CCG CA -3 ’ja 5′- GGC CAT TCT CCT GTC CGT TCG CT -3′, IL6; 5’- TAG CCG CCC CAC ACA GAC AGC C -3 ’ja 5’TTC TGC CAG TGC CTC TTT GCT GCT -3′; STAT3, 5’- AAC ATG GCT GGC AAG GGC TTC TCC T -3 ’ja 5′- AGT GCT CAA GAT GGC CCG CTC CC -3′; GAPDH, 5’- GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 ’ja 5′- TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G – 3’. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI Prism 7500 sekvenssi ilmaisin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa. GAPDH käytettiin standardoida cDNA tulotasoilla.

immunohistokemia

Kun parafiini ja nesteytys, levyt altistettiin 0,3% vetyperoksidia 30 minuuttia sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Esto tehtiin 10% tavallista aasi seerumia (NDS) ja 1% BSA 1 x PBS. Sitten laseja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa estopuskurilla, joka sisältää seuraavat ensisijaiset vasta-aine; anti-ihmisen LAP2 (1:200, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-STAT3 (1:100, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-IL6 (1:100, Abcam, Cambridge, UK) tai anti-MARCKS (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) vasta-aine. Sekundaarinen vasta-aine (piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua) sitoutuminen tehtiin klo 1:200 laimennus estopuskurissa 2 h RT: ssa. Detektio suoritettiin HRP (Vector Laboratories) käyttämällä DAB substraattipakkausta (Vector Laboratories). Counterstaining tehtiin 1 min hematoksyliinillä värjäyspuskurilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

proliferaatiomääritystä

kaksi, kolme tai viisi päivää transfektion jälkeen siRNA, lisäsimme 10 ui esisekoitettu vesiliukoista tetratsoliumsuolaa-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) solujen proliferaatiota reagenssia kuhunkin kuoppaan. Näitä soluja inkuboitiin kahden tunnin ajan inkubaattorissa. Solujen elinkelpoisuus mitattiin absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen ELISA-lukijaa (TECAN, Mannedorf, Sveitsi).

Boyden jaosto Pitoisuus

Migration syöpäsolujen mitattiin Boyden kammion. Noin 5 x 10

4 solua 0,05 ml: aan seerumitonta RPMI 1640 väliaine ympättiin hyvin kalvoon päällystetty tyypin I kollageenia. Poistamaan vaikutukset proliferaation, mitomysiini C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) lisättiin. Solujen annettiin kulkeutua neljä tai kuusi tuntia. Kalvot kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-quik ratkaisu (Sysmex, Kobe, Japani) yhden minuutin ajan ja pestään tislatulla vedellä. Solujen lukumäärä 10 satunnaisesti valittua kentät määritettiin valomikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolmesti.

haavan paraneminen Pitoisuus

Yksisolukerros oli naarmuuntunut keltaisella pipetillä kärjestä ja kulkeutumista solujen haavoittuneen alueen havaittiin alle käännettyä mikroskooppia. Poistamaan vaikutukset proliferaation, mitomysiini C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) lisättiin. Kuvat on otettu ilmoitettuina aikoina. Mittaukset otettiin viiden yksittäisen mikroskooppikentäs- kussakin kokeessa, ja edustavia tietoja kolmesta kokeesta esitetään.

Matrigel Invasion Pitoisuus

kyky syöpäsolujen hyökätä määritettiin käyttäen 24-kuoppaista BioCoatTM MatrigelTM kammio insertit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Sisempi insertti hyökkäyksen kammiot päällystettiin 0,5 mg /ml kasvutekijä vähentää matrigeeliin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja ulompi insertin 0,5 mg /ml fibronektiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Solut ympättiin insertit tiheydellä 5 x 10

4 inserttiä kohti seerumittomassa väliaineessa ja siirrettiin sitten kuoppiin täytetty viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 10% FBS: ää tai 100 ng /ml EGF: ää, kuten kemoattraktantti. Poistamaan vaikutukset proliferaation, mitomysiini C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) lisättiin. Sen jälkeen kun 24 (10% FBS), tai 52 tuntia (100 ng /ml EGF: ää) inkubaation, ei-tunkeutuvat soluihin päälle kalvon poistettiin kaapimalla. Tunkeutuneet solut pohjassa kalvon vahvistettu, mitä seurasi värjäys Diff-quik ratkaisu. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja vähintään 10 kenttää laskettiin kussakin kokeessa.

Maksa Metastasis ksenograftimallissa

kyky transfektantteja ja etäpesäkkeitä maksaan arvioitiin hitaasti injektoimalla soluja ( 5 x 10

6 /0,05 ml) otetaan perna nude-hiirten kautta 27 neulan (NK4 ryhmä, mock ryhmä; n = 5 /ryhmä). Patologiseen tutkimuksia, kaikki hiiret tapettiin viikon 5 ja maksa eristettiin, kiinnitettiin 10% neutraaliin – puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Pusan ​​National University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (PNUIACUC) hyväksyi koemenettelyt (Luvan numero: PNU-2010-00083).

cDNA Microarray

Yhteensä RNA eristettiin SNU638-LAP2 ja SNU638 mock-soluihin käyttämällä RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) noudattaen valmistajan protokollaa. Määrällisesti RNA: ta käytettiin sitten microarray-analyysi Ihmisen HT-12_v4_Bead pelimerkkejä (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Yhteensä RNA-näytteet leimattiin käyttäen Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Applied Biosystem, CA, USA) ja cDNA-synteesi ja in vitro transkription. Single-RNA (cRNA) tuotettiin ja leimattiin sisällyttämällä biotiini-NTP (Ambion). Yhteensä 0,5 ug biotiini-leimattua cRNA hybridisoitiin 58 ° C: ssa 16 h Illumina Human HT-12_v4_BeadChip (Illumina). Hybridisoitu biotinyloitu cRNA havaittiin streptavidiini-Cy3 ja kvantitoitiin käyttäen BeadArray Reader Scanner (Illumina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Array tiedot käsiteltiin ja analysoitiin Illumina BeadStudio versio 3.0-ohjelmisto (Illumina). Skannatut tiedot normalisoitiin jonka kvantiili-kvantiili normalisoinnin menetelmää ja log-transformoitiin (by base kaksi). Kaikki tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja raaka tiedot toimitettiin yleisölle arkistoon (NCBI: n GEO-hakunumero: GSE31450).

Mahalaukun syöpäsoluja yli-ilmentävät LAP2β geenin tai kontrollivektorille ruiskutettiin pernaan ja etäpesäke maksan tutkittiin 5 viikkoa myöhemmin. Etäpesäkekasvainten alueet olivat katkoviivaprofiileina piireissä. Edustavia immunovärjäyksin anti-LAP2, anti-IL6, anti-STAT3, ja anti-MARCKS vasta-aineita ja H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

LAP2 on laajalti yli-ilmennetään Monipuolinen ruoansulatuskanavan syöpien

tarkastella ekspressiomalleja LAP2 ruoansulatuskanavan radalla syöpiä, kuten mahan, haiman, maksan ja sappiteiden syöpä, suoritimme immunohistokemiallisesti käyttämällä potilaan kudoksia (n = 15 per jokainen syöpä tyyppi). LAP2 proteiini laajalti yli-ilmentyy cancerous alueella kudosten verrattuna ei-syöpä alueilla (Fig. 1A, 47% vuonna mahasyöpä, 27% vuonna haimasyöpä, 30% maksasyövän, 40% sappitiehyen syöpä). Erityisesti ilmaus LAP2 havaittiin metastaattisen syöpäsoluissa potilaiden kudoksiin. Koska LAP2 on lukuisia isoformeja, keskityimme LAP2β. Vahvistaa tulokset immunohistochemistsry, suoritimme reaaliaikaisen PCR: llä käyttämällä LAP2β alukkeita mahasyövän kudoksissa. Vaikka kaikilla testatuilla kudokset eivät yli-ilmennä LAP2β, se oli yli-ilmentynyt 13 tapauksessa (yhteensä 24 tapausta, Fig. 1 B).

roolit LAP2β in leviämisen, Migration, ja Invasion syöpäsolujen

tutkia roolit LAP2β karsinogeneesis-, koputimme alas tai yli-ilmentyy LAP2β käyttämällä siRNA tai cDNA, vastaavasti. Olemme tarkastetaan tehokkuutta modulaation LAP2β geenin western-blottauksella tai reaaliaikaisella PCR: llä (Fig. 2A-D). LAP2β siRNA (100 nM) vähensi mRNA taso LAP2β vuonna SNU638 tai PANC1 soluja verrattuna SCR siRNA 42% tai 61%. Yliekspressio LAP2β cDNA transfektiolla lisääntynyt mRNA taso LAP2β vuonna SNU638 tai PANC1 solut (klooni # 6) kontrolliin verrattuna vektorin 1,7 tai 19,6 kertaiseksi.

Seuraavaksi tutkimme rooli LAP2β proliferaation syöpäsoluja. Viisi vuorokautta transfektion jälkeen, jossa SCR tai LAP2β siRNA, WST-1 proliferaation määritys suoritettiin. Knockdovvn LAP2β ei vaikuttanut leviämisen Testatuimmat syöpäsolujen paitsi haimasyöpäsoluissa (Fig. 2E). LAP2β siRNA esti leviämisen MIA-PaCa2 ja PANC1 haimasyöpäsoluissa verrattuna SCR siRNA 74% ja 46% tässä järjestyksessä (Kuva. 2E). Havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia, kun suoritetaan WST-1 runsaudenmäärityksessä kaksi tai kolme päivää transfektion jälkeen. N yli-ilmentyminen LAP2β vuonna SNU638 tai PANC1 solut vaikuttavat hieman lisääntymistä (kuvio. 2F).

määrittämiseksi roolin LAP2β muuttoliikkeen syöpäsolujen teimme tutkimuksia käyttämällä Boyden kammion määritystä. Kaikilla testatuilla syöpäsoluja, knockdovvn LAP2β esti migraation syöpäsolujen (Fig. 3). Esimerkiksi LAP2β siRNA esti FBS- tai EGF aiheuttamaa kulkeutumista SNU638 solujen verrattuna SCR siRNA 47% ja 70% tässä järjestyksessä (Kuva. 3A, 3C). Sen constrast, yliekspressio LAP2β lisääntynyt FBS- ja EGF aiheuttamaa kulkeutumista SNU638 solujen verrattuna mock soluihin 145% ja 387% vastaavasti (Fig. 3B 3E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin LAP2β- yli-ilmentäviä PANC1 solut (Fig. 3B 3F). Tämä vaikutus migraatio syöpäsolujen varmistettiin edelleen haavan paranemista määritys SNU638 soluissa (kuvio. 3H). Nämä tulokset johtivat meidät tutkimaan roolia LAP2β vuonna hyökkäyksen syöpäsoluja. Matrigel invaasiomääritys, LAP2β siRNA esti FBS- ja EGF aiheuttama invaasion SNU638 solujen verrattuna SCR siRNA 93% ja 47% tässä järjestyksessä (Kuva. 4A 4C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin PANC1 (Fig. 4A 4D) tai SNU216 (tuloksia ei ole esitetty) solut. Sen sijaan yli-ilmentyminen LAP2β lisääntynyt FBS- ja EGF aiheuttama invaasion SNU638 solujen vertailuryhmän vektorin 725% ja 1223%: lla (Fig. 4B 4E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin PANC1 (Fig. 4B 4F) soluja.

LAP2β Parantaa Metastasoitunut teho mahalaukun syöpäsoluja maksametastaasin ksenograftimallia

asetukseen motiliteettia syöpäsolujen LAP2β viittasi mahdollisuuteen, että LAP2β säätelee etäpesäke syövän soluihin in vivo. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, me ruiskutetaan mahasyövän solut pernassa nude-hiirten ja sitten havaittiin etäpesäkkeitä maksaan. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen LAP2β lisääntynyt tehokkuus ja koko maksan etäpesäkkeiden (Fig. 5), ja kuolleisuus testattu hiirillä. 67% hiiriä, joihin injektoitiin mahalaukun syöpäsoluja yli-ilmentävät LAP2β kuoli 8 viikkoa myöhemmin, kun injektion, kun taas kaikki kontrollihiiret injektoitiin mahalaukun syövän solut, jotka ilmentävät kontrollivektorilla säilynyt. Vuonna histologinen tutkimus on Ksenograftikudoksista, olemme vahvistaneet yliekspressio LAP2β on ksenograftin peräisin hiiristä injektoitiin LAP2β yli-ilmentäviä soluja (Fig. 5).

LAP2β aiheuttama muutokset mRNA Expression

paljastaa taustalla mekanismi LAP2β-säänneltyjen motiliteettia, teimme cDNA microarray (NCBI: n GEO-hakunumero: GSE31450). Vaikka mRNA: n taso LAP2β yliekspressoitiin stabiili solulinja noin 1,7-kertainen, kuin monien geenien muuttivat yli-ilmentyminen (Fig. 2 taulukko 1). Niistä merkittävästi muuttunut geenien LAP2β keskityimme Myristoylated alaniini-rikkaan C-kinaasin substraatti (MARCKS), signaali anturin ja aktivaattori transcription3 (STAT3) ja interleukin6 (IL6), koska nämä geenit on raportoitu säätelemään motiliteettia soluja. Reaaliaikainen PCR kunkin geenin vahvistettiin merkittäviä muutoksia mRNA-tasojen kunkin geenin (Fig. 6). Yli-ilmentyminen LAP2β lisääntynyt mRNA tasot MARCKS ja IL6 vertailuryhmän vektorin 193% ja 79% vastaavasti (kuva. 6). Lisäksi enemmän ilmaisuja MARCKS, IL6 ja STAT3 havaittiin ksenograftin peräisin hiiristä injektoitiin LAP2β yli-ilmentäviä soluja (Fig. 5).

Geenien ilmentyminen välillä mahasyövän solujen overepxressing LAP2β geenin tai kontrollivektoreihin verrattiin cDNA microarray. Reaaliaikainen PCR käytettiin vahvistamaan LAP2β aiheuttama muutos geenien ilmentyminen on

MARCKS, STAT3 ja IL-6

in SNU638 soluissa. Tiedot piirretään kertaiseksi muutoksia verrattuna mock-solut. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta on viitenä (* P 0,01, Studentin t-testi).

Keskustelu

LAP2, yksi LEM domeenin proteiineja, on ollut pääasiassa kuvattu pelata rakenteellinen rooli tumakalvoa ja olla mukana useissa geneettisiä sairauksia. Kuitenkin tässä esittelemme ensimmäistä kertaa sen ilmaisun ja roolit erilaisissa ruoansulatuskanavan syöpiin. Erityisesti olemme havainneet, että LAP2β voi hallita liikkuvuutta syöpäsolujen sekä edistää etäpesäkkeiden syöpäsoluja.

Metastasis syöpäsolujen vaikuttaa suuresti ennustetta syöpäpotilailla. Useat tulokset esillä olevassa tutkimuksessa tuki LAP2β säätelee motiliteettia ja etäpesäkkeiden syöpäsoluja. In vitro kokeita Boyden kammiossa, haavan paranemista ja Matrigel invaasio määritykset osoittivat, että knockdown vähentynyt, kun taas yli-ilmentyminen LAP2β lisäsi maahanmuutto ja hyökkäys syöpäsolujen (Fig. 3 4). Lisäksi, ksenograftimallissa, LAP2β parannettu etäpesäke syöpäsolujen (Fig. 5). Vaikka kontrollivektorille-transfektoituja soluja aiheuttama etäpesäke ksenograftimallia, vaikutus oli varsin tehotonta ja hidasta. Sen sijaan LAP2β-yli-ilmennetään soluissa osoitti aggressiivisemman käyttäytymisen ksenograftin. Lisäksi löysimme yliekspressio LAP2 metastaattisessa syöpäsoluissa kudosten potilailta (kuvio. 1).

Miten LAP2β edistää liikkuvuutta ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen? Löydettiin useita geenejä, jotka indusoitiin LAP2β cDNA microarray-analyysi (taulukko 1), mikä vahvistettiin edelleen reaaliaikaisella PCR: llä (Fig. 6) ja immunohistokemia ksenograftin (Fig. 5). Yksi heistä, MARCKS, vastaa sitovia ja silloitus aktiinisäikeiden suoraan kalvolle [24]. Yliekspressio MARCKS on havaittu eri syövissä, mukaan lukien maksasyövän [25], haimasyöpä [26], glioblastoma [27] ja kolangiokarsinooma [28]. Lisäksi MARCKS on ratkaiseva rooli EGFR aiheuttama invaasion glioblastoomasolua [29]. Monet muut tutkimukset ovat osoittaneet, että osallistuminen MARCKS solun liikkuvuudessa [30].

Toinen ehdokas geeni, joka välittää LAP2β aiheuttama liikkuvuus on IL-6, joka on ensisijaisesti tuotettu akuutti ja krooninen tulehdus. Syöpäsolut, jotka ovat alttiina IL-6 tai erittävät sytokiini kriinisenä tekijä osoittavat lisääntynyt invasiivisuus [31], [32], [33]. Lisäksi inaktivaatio gp130, anturin IL-6 signalointia, vähentää aggressiivisuus rintasyöpäsoluissa in vivo [34]. Useita IL-6-signalointireitin liittyviä geenejä, mukaan lukien STST3 liittyy myös maahanmuuttoon ja hyökkäys syöpäsolujen [35], [36], [37]. IL-6 ilmentyy laajalti monissa kiinteiden syöpien, mukaan lukien eturauhas- [38], rintojen [39], keuhkosyöpä [40] syöpä, ja glioblastooma [41].

Miten LAP2β säädellä geeniekspressiota? LEM-domain proteiinien on osoitettu kykenevän säätelemään geeniekspressiota sitomalla transkription sääntelyviranomaisten on tumalevy. Man1 sitoutuu reseptoriin säädelty R-Smad: ien ja antagonisoi signalointi muuttamalla kasvutekijä β (TGFli), activin ja luun morfogeeninen proteiini (BMP) [42]. Man1 puutos johtaa alkion verisuonten remodeling vikoja hiirillä ja luuston kehittyminen ihmisellä [16], [43]. Toinen esimerkki on emerin sitoutumisesta P-kateniinin, alavirran kohde Wnt signalointia, joka edistää sen irtautuminen ydin [44]. Emerin puutos johtaa ydinaseiden kertyminen β-kateniinin. LAP2β on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa HDAC3 ja säännellä toimintaa E2F, p53 ja NF-KB: n transkription tekijöitä, [5], [45]. Jatkossa tutkimuksissa, miten LAP2β voi säädellä MARCKS tai IL-6 ilmaisu ansaitsee lisätutkimuksia.

osallistuminen LAP2β lisääntymään ehdotti tutkimuksen, jossa typistetty LAP2β muuttuneessa DNA-replikaation tehokkuutta [18]. Sääntelyn DNA replikaatiota LAP2β on ehdotettu välittyvän kaksi mahdollista väyliä. LAP2β voi vähentää aktiivisuutta E2F monimutkaisia ​​yksin tai sukusolujen vähemmän (GCL) [46]. Toinen reitti on vuorovaikutuksessa HA95 aikana G1 vaiheen solusyklin [12]. Tämä vuorovaikutus HA95 edistää vakautta prereplication komplekseja. Esillä olevassa tutkimuksessa, knockdovvn LAP2β ei vaikuttanut leviämisen kaikkein ruoansulatuskanavan syöpäsolujen paitsi haimasyövän soluja (Fig. 2). Lisäksi yli-ilmentyminen LAP2β ei aiheuttanut merkittävää muutosta lisääntymistä (Fig. 2), mikä viittaa sääntelyn lisääntymisen LAP2β ruuansulatuskanavassa syöpäsolut ei ole niin kriittinen.

Laaja yliekspressio LAP2 eri ruoansulatuskanavan syöpien on kuvattu ensimmäisen kerran tässä tutkimuksessa (Fig. 1). Expression of LAP2β on kuvattu erilaisissa normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien iho, kateenkorva, keuhko-, kiveksissä ja munasarjoissa. Kuitenkin sen ilmentyminen normaalissa ruoansulatuskanavassa harvoin havaittu [47].