Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on heterogeeninen ryhmä häiriöitä, joissa on useita geneettisiä ja proteomiikka muutoksia. c-CBL on E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla ja Jatkemolekyylin tärkeä normaalissa homeostaasin ja syöpä. Selvitimme geneettistä vaihtelua c-

CBL

, suhde reseptorityrosiinikinaaseilla (EGFR ja MET), ja toiminnot NSCLC.

menetelmät ja havainnot

käyttäminen arkistointiin formaliini -Kiinteä parafiiniin (FFPE) uutettu genomi-DNA, osoitamme, että c-CBL mutaatioita esiintyy somaattisten muoti keuhkosyövässä. c-CBL mutaatiot eivät ole toisiaan poissulkevia MET tai EGFR mutaatioita; mutta ne olivat riippumattomia p53 ja KRAS mutaatioita. Normaalissa /kasvaimen pareittain analyysi oli merkittävä menetys Heterotsygotian (LOH) varten C-

CBL

locus (22%, n = 8/37) ja mikään näistä näytteistä paljastui tahansa mutaation jäljellä kopio c-CBL. C-

CBL

LOH myös korreloi positiivisesti EGFR ja MET mutaatioita havaittiin samoissa näytteissä. Käyttämällä select c-CBL somaattiset mutaatiot kuten S80N /H94Y, Q249E ja W802 * (saatu valkoihoinen, Taiwanin ja Afrikkalainen Amerikan näytteet, vastaavasti) transfektoitiin NSCLC solulinjoissa, siellä nostettiin solujen elinkykyä ja solun liikkuvuus.

Johtopäätökset

kun yleinen mutaatioaste c-CBL olevan yhdistelmä kuin somaattinen missensemutaatio ja Loh, on selvää, että c-CBL on erittäin mutatoitunut keuhkosyövässä ja voi olla keskeinen rooli keuhkojen kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeitä.

Citation: Tan Y-HC, Krishnaswamy S, Nandi S, Kanteti R, Vora S, Önel K, et al. (2010) CBL usein muuttunut keuhkosyövässä: Sen Suhde Mutaatiot MET ja EGFR tyrosiinikinaasit. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10,1371 /journal.pone.0008972

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2009; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2010 Julkaistu: 29 tammikuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoittajat: tukemana National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute (NCI) Avustukset: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-säätiö, Cancer Research Foundation ja American Respiratory Health Association of America (RS) ja myöntää NSC96-2628-B-006-048-MY3 National Science neuvosto , Taiwan. Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Rahoitus agenices ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pelkästään Yhdysvalloissa vuosittain noin 219400 ihmistä on diagnosoitu keuhkosyöpä, joista yli 145000 heistä periksi sairauden [1]. Tämä määrä vastaa karkeasti yhdistetyn kuolleisuus rinta-, eturauhas-, paksusuoli, maksa, munuaiset ja melanooma [1]. Lisäksi ennuste on yleensä huono ja viiden vuoden eloonjäämisaste on alle 15%. Myös merkittäviä etnisiä eroja keuhkosyöpään, ja lopputulos on huonompi mustat verrattuna valkoiset. Sukupuolierot ovat myös silmiinpistävää naisten kanssa, joilla on merkittävästi parempi ennuste miehiin verrattuna. On olemassa useita geneettisiä muutoksia, joita voi esiintyä keuhkosyöpä. Esimerkiksi NSCLC, mutaatiot KRAS, p53, EGFR ja MET on tunnistettu. Monet näistä reiteistä, varsinkin Reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t) ohjataan c-CBL.

CBL

(Casitas B-linjan lymfooma) on nisäkkään geeni sijaitsee ihmisen kromosomissa 11q23.3 [2] ja on mukana solun signalointi ja proteiini ubikitinaatio [3]. CBL proteiinit kuuluvat nimetön sormi luokan ubikitiinipromoottori ligaasit (E3) ja on kolme homologeja

c-CBL

,

CBL-b

,

CBL-3

[4 ].

c-CBL

ja

CBL-b

geenit ekspressoituvat kanssa korkeimmalla tasolla hematopoeettisissa kudoksissa [5].

c

-CBL koostuu neljä aluetta, jotka koodaavat toiminnallisesti erillisiä proteiinidomeeneja: n N-pään tyrosiinikinaasin sitovaa (TKB) verkkotunnuksen, linkkeri alueella, katalyyttinen RING finger domain, proliinirikas alue ja c terminaalisia ubikitiinistä liittyvää (UBA) domain että myös päällekkäinen leusiinivetoketjurakenneproteiini (LZ) domain [3]. Sekä TKB ja etusormi domeenit ovat välttämättömiä ligandin indusoiman ubikinaa- RTK: iden [6], [7], [8], [9]. Nimetön sormi domain vaaditaan rekrytointi E2 ubikitiinistä entsyymien konjugoimiseksi. TKB toimialueen neljän kierteen kimppu (4H), kalsium-biding EF käsi, ja muunnetun SH2 verkkotunnuksen, joka sitoutuu fosfotyrosiinivasta- jäämiä [3], [10], [11], [12]. Lisäksi proliini-rikas alue c-CBL voi liittyä SH3-domeenin Grb2, joka voi epäsuorasti rekrytoida c-CBL RTK: oihin kautta Grb2 sovittimen proteiini [7], [13], [14].

c-CBL myös sitoutuu EGFR ja toimii E3 että tavoitteet EGFR varten ubikinaation ja hajoamista. Lisäksi CBL desensitizes EGF signalointi ja vastustaa soluproliferaatiota aiheuttama EGF [15]. EGF aktivointi näyttää myös aktivoida tyrosiinikinaasin SRC, joka fosforyloi c-CBL ja vuorostaan ​​aktivoi ubikinaation ja hajoaminen EGFR [16], [17], [18]. Äskettäin julkaistu tutkimus osoittaa, että viallinen endosytoosin EGFR on ominaista häviämämutantilla ja pistemutaatio L858R, jolloin sen yhdessä c-CBL ja myöhemmät ubikitinaatio on alentunut [19]. Äskettäin ensimmäinen ihmisen c-CBL mutaatioita raportoitu akuuttia myelooista leukemiaa (AML) potilasta [20]. Mutaatio R420Q estää FMS-tyyppistä tyrosiinikinaasi 3 (FLT3) sisäistämistä ja ubikitinaatio [20].

Ei vain E3 aktiivisuus on tärkeää kasvaimen synnyssä, c-CBL on kaksi, mutta erillinen toimivat signaalitransduktiomolekyylia molekyylin . Olemme aiemmin osoittaneet, että c-CBL on tärkeä sitomisessa CRKL ja BCR /ABL hematopoeettisissa soluissa. Lisäksi, se voi sitoa ja mukauttaa toimintojen solun tukirangan sitoutumalla proteiinien, kuten taliini ja paksilliinin. TKB domeeni on tärkeä sitoutumisen useita molekyylejä, ja ne sitten toimivat signaalitransduktion.

Koska kriittinen rooli CBL normaalin homeostaasin ja syövän, me arveltu, että se voidaan mutatoida keuhkosyövässä. Tässä tutkimuksessa raportoimme novel c-CBL somaattisia mutaatioita S80N /H94Y, Q249E ja W802 * valkoihoisilla, Taiwanin ja Afrikkalainen Amerikan keuhkosyöpää potilaista. Ilmaiseminen nämä mutaatiot NSCLC solulinjoissa johtaa lisääntyneeseen lisääntymistä ja solun liikkuvuus. Osoitamme, että c-CBL mutaatioita esiintyy kanssa tai ilman MET tai EGFR mutaatioita mutta ovat toisensa poissulkevia on LOH klo C-

CBL

lokuksessa. Lisäksi c-

CBL

LOH liittyy joko MET tai EGFR mutaatioita. Olemme siis hypoteesina, että c-CBL mutaatiot saattavat edistää kasvaimia synnyttävän potentiaalin MET ja EGFR keuhkosyövässä.

Methods

Ethics lausunto

Kirjallinen lupa kaikille tutkimusta ihmisen aiheista on saatu Institutional Review Board, University of Chicago ja kattaa kaikki tutkimukseen suoritettu laboratoriossa. Seuraavassa on heidän yhteystietonsa: Institutional Review Board, The University of Chicago, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2. kerros, Chicago, IL 60637. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikista potilaista, joiden kudosnäytteitä käytettiin tässä tutkimuksessa .

Kudosnäytteiden

keuhkosyöpä kudosten ja pariksi viereisen normaalin keuhkojen kudoksia saatiin 50 valkoihoisia, 29 Afrikkalainen-amerikkalaiset ja 40 Taiwanin NSCLC potilaat, jotka rekrytoitiin Chicagon yliopiston sairaalan (Chicago , USA) (valkoihoinen ja Afrikkalainen Amerikan potilasta) ja Taipei Veterans General Hospital of Taiwan (Taiwanin potilasta) saatuaan asianmukaisen Institutional Review Board lupa ja tietoinen suostumus potilailta. Out of 119 näytettä, 77 oli miehiä, 38 naisia ​​ja 4 olivat tuntemattomia iän diagnoosin vaihtelee 47-90 vuotta. Mitä kasvaintyypeille, 53 olivat adenokarsinooma, 32 oli okasolusyöpä ja 34 oli suuri cell carcinoma. 49 oli vaihe I, 14 oli vaihe II, 34 oli vaiheen III, ja 13 oli vaiheessa IV (taulukko S1).

Cell Culture

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut A549 ja H358 ylläpidettiin DMEM ja RPMI-1640, vastaavasti. Ihmisen alkion munuaisen 293T-soluja viljeltiin DMEM: ssä. Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

c-

CBL

Gene mutaatioanalyysiin

eksonit 2-16 c –

CBL

geenin erikseen monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Alukkeet on lueteltu taulukossa S2. PCR-olosuhteet olivat 1 sykli 95 ° C 5 minuuttia; 35 sykliä, joissa 94 ° C 30 sekuntia, 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C 2 minuuttia; ja yksi sykli 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. PCR-tuotteet käsiteltiin ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH) ja sekvensoitiin Big-Dye Terminator Chemistry (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvensointi suoritettiin eteenpäin koodaavan säikeen kanssa vahvistuksen

c-CBL

muutoksiin suorittaa sekvensoimalla käänteisjuoste samoin. Kromatogrammit analysoitiin mutaatioiden avulla Mutaatio Surveyor v2.61 (Softgenetics, State College, PA).

plasmidikonstrukteja ja kohdennetun mutageneesin

villityypin c-

CBL

cDNA-insertti subkloonattiin pAlterMax ekspressiovektoriin käyttäen

Xho

I ja

SalI

I restriktioentsyymikohtia (Promega, Madison, WI). Käyttäen tätä emoplasmidin pAlterMax-c-

CBL

, The TKB domain kaksinkertainen mutaatio (S80N /H94Y), pistemutaatio (Q249E), ja C-terminaalin pistemutaatio W802 * c-

CBL

luotiin käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 ’ja 5′-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3′ kaksinkertaisen mutaation S80N /H94Y; 5’-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 ’ja Q249E, ja 5′-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3’ ja W802 * sekä niiden täydentävät alukkeita käyttämällä QuickChange Site-Directed Mutagenesis XL (Stratagene, La Jolla, CA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Konstruktioita vahvistettavaan pistemutaatioiden standardeilla DNA-sekvensointi molemmat juosteet.

Heterotsygotian menetys (LOH) Analysis

Viisi mikrosatelliitteihin kromosomissa 11 (3 11q: ssa tai 200 kb ylös tai alavirtaan c-

CBL

geenin ja 2 ohjaus markkereita 11p) valittiin analyysin (taulukko S3). Perustettiin mikrosatelliittimarkkerin ja vastaavat alukesekvenssit poimittiin GeneLoc tietokannasta (https://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Alukkeet räätälöidyt ja kukin eteenpäin aluke leimattu fluoresoivasti 5 ’päähän, jossa FAM, PET, NED tai VIC (Applied Biosystems). Primer hehkutuslämpötiloja ja duplex tulokset arvioitiin NIST Primer Tools (https://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD). Alukkeet varmistettiin suorittamalla PCR kontrolli DNA (eristetty TK6) ja ratkaisemiseksi tuotteet agaroosigeeleillä. Bändit tehtiin näkyviksi UV transilluminaattori. Genomi-DNA uutettiin tuumorinäytteistä ja pariksi normaalin keuhkokudoksen. Alukkeet ryhmiteltiin multiplex yhdistelmien taulukosta S4. Marker D11S929 toimi sisäisen valvonnan tarkistaa johdonmukaisuutta PCR: istä ja piikkien kapillaarielektroforeesilla. Multiplex PCR: t suoritettiin 10 ui, joka sisälsi 1 ui genomista DNA: ta (20-50 ng), 0,5 uM kutakin aluketta (1,0 uM yhteensä jokaiselle alukeparia), 400 uM dNTP: itä, 1 x PCR-puskuria, joka sisälsi MgCl

2 ja 0,2 U

Taq

DNA-polymeraasia. PCR suoritettiin ABI GeneAmp 9700 PCR System seuraavissa olosuhteissa: 5 min 94 ° C: ssa; 30 sykliä 30 s 94 ° C: ssa, 1 min 60 ° C: ssa, 1 min 72 ° C: ssa; ja 5 minuuttia 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin kapillaarielektroforeesilla ABI 3130XL DNA Analyzer. Kromatogrammit analysoitiin Peak Scanner 1.0 ja GeneMapper 3.7 ohjelmisto (Applied Biosystems) varten alleelinen muutoksiin. Alue piikkien tuotettu DNA PCR-tuotteiden määrä määritettiin kunkin alleelin. Suhde alleelinen alueet laskettiin jokaiselle kasvaimen ja pariksi normaalin DNA-näytteen. Kun qLOH (alleelinen suhde kasvaimen huiput jaettuna alleelinen suhde pariksi normaalissa näytteessä) oli ≤0.5 tai ≥2.0 varten c-

CBL

ja ainakin yksi muu 11q markkeri vähintään kaksi erillistä koetta, näyte katsottiin olevan alleelinen epätasapaino ja tulkita LOH. Näytteet arvioitiin ainakin kaksi erillistä koetta ja näytteet osoittavat mahdollisille LOH at C-

CBL

toistettiin kolmannen kerran joka sisälsi uuden rastilipulla klo

BAX

lokuksen (tietoja ei esitetty) kromosomin 19 tarkistaa eheyden näytteen DNA.

transfektio C-

CBL

Constructs

A549-solulinja transfektoitiin käyttämällä Fugene HD (Roche, Nutley, NJ) reagenssiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kahdeksan ug plasmidi-DNA, joka sisälsi joko ei ollenkaan insertin (tyhjä vektori), villityypin c-

CBL

, S80N /H94Y c-

CBL,

Q249E c-

CBL

tai W802 *

CBL

käytettiin transfektioon 6-kuoppaiselle viljelylevylle. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin ilmaisun.

C-

CBL

Knockdown

C-

CBL

Knockdown suoritettiin käyttäen lentivirus transduktion avulla MISSION lentiviruksen transduktiopartikkeleilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kohti valmistajan ohjeiden mukaan. Lyhyesti, 1 x 10

5 H358 solua /kuoppa ympättiin 6-kuoppalevyille ja infektoitiin seuraavana päivänä C-

CBL

lentiviral shRNA rakentaa. Tuottavat vakaita c-CBL pudotus solulinjat, solut valittiin 2 päivä 1 ug /ml puromysiiniä. c-CBL-tasot määritettiin käyttäen kokosolulysaateista immunoblottauksella anti-CBL-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA).

solunelinkykyisyysmääritys

Solut transfektoitiin kuten edellä on kuvattu transfek- määrityksessä. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla.

haavan paraneminen Määritys

A549-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 48 tuntia, kunnes 100% konfluentteja . Sitten väliaine vaihdetaan ja solut transfektoitiin kuvatulla tavalla transfektioanalyysissä. Kaksitoista tuntia transfektion jälkeen, suora naarmu tehtiin poikki solukerrokselle käyttäen 1 ml: n pipetin kärki. Sitten solut pestään varovasti 1 x PBS: llä solujätteen poistamiseksi, ja elatusaine korvattiin. Otettiin valokuvia ja haavan alueen 12 tunnin välein, kunnes 48 h.

Western blot -analyysi

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa 1X PBS: ssä, sitten lyysattiin jää- kylmää lyysipuskuria (0,5 M Tris-HCl: a, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 2,5% deoksikoolihappoa, 10 mM EDTA, 10% NP-40, 0,5 mM DTT: tä, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 5 ug /ml leupeptiiniä ja 10 ug /ml aprotiniinia) 5 minuutin ajan. Lysaattia sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin. Kokosoluliuotteista (50 ug /kuoppa), erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja geelit siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Whatman, Piscataway, NJ). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi Tween-20 (PBST) (1 x PBS, 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit sitten pestiin kolme kertaa PBST: llä ja tutkittiin asianmukaisten piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvot pestiin uudelleen kolme kertaa PBST ja kaistoja visualisoitiin käyttämällä Western blot kemiluminesenssin reagenssia (BioRad, Valencia, CA) on Chemidoc Gel dokumentaatiojärjestelmän (BioRad, Valencia, CA). Vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotekniikka ja käytettiin jäljempänä mainittujen pitoisuuksien (c-CBL, 1:5000 c-MET, 1:5000, EGFR, 1:5000, ubikitiini, 1:1000 HA, 1:5000 ja β- aktiini, 1:10,000).

virtaussytometria

Solusyklianalyysiä suoritettiin virtaussytometrialla. Noin 2 x 10

6-soluja kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut kerättiin trypsiini /EDTA-käsittely, pestiin 1 x PBS: llä kolme kertaa, ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolissa 2 tuntia. Solut pestiin jälleen kylmällä PBS: llä ja värjättiin liuoksessa, joka sisältää 25 ug /ml propidiumjodidia, 200 ug /ml RNaasi A: ta ja 0,1% Triton X-100: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen guava PCA-96-virtaussytometrillä (guava Technologies, Millipore, Billerica, MA).

Ubiquitin Ligase Activity

293T-solut pidettiin viljelmässä DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10 % FBS: ää ja 1% penisilliini (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), transfektoitiin 0,2 ug: EGFR-pcDNA3 ja 2 ug HA-merkitty c-

CBL

rakentaa kuten käyttämällä kalsiumfosfaatti mukaan valmistajan protokollan (Profection, Promega, Madison, WI). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut ilman ravintoa yön yli DMEM: ssä, jota oli täydennetty 0,5% FBS: ää, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman EGF: ää (100 ng /ml) 15 minuuttia. Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä, joka sisälsi 0,2 mM natriumortovanadaattia sitten hajotettiin jääkylmässä lyysipuskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 10% glyseroli, 2 mM natriumortovanadaattia ja proteaasinestäjät). Lysaatit kirkastettiin roskat sentrifugoimalla 16000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. EGFR immunosaostukset suoritettiin 200 ug selvitetty lysaatin käyttäen 250 ng kanin-anti-EGFR ja proteiini A /G-Plus Sepharose yön yli 4 ° C: ssa. Saostukset pestiin 5 kertaa lyysipuskurissa ennen kiehumista Laemmli-puskurissa. Eluoinnit immunoblotattiin antiubikitiinivasta-ja EGFR. Kaksikymmentä mikrogrammaa selvitetty lysaattia immunoblotattiin kullekin c-

CBL

konstrukteja käyttämällä anti-HA.

Tilastollinen analyysi

Mutation hinnat eri ryhmien välillä verrattiin käyttäen Fisherin testata. Jatkuvien muuttujien, ryhmä vertailut suoritettiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA) seurasi Sidak n säätö monivertailuja. Kokeista, joissa toistuvissa mittauksissa ajan analysoitiin toistettujen mittausten ANOVA Greenhouse-Geisser sopeutumista vapausasteita. Analyysit suoritettiin käyttäen STATA (10.1) ohjelmisto (Stata Corporation, College Station, TX).

Tulokset

C-

CBL

geenimutaatioita Keuhkosyöpä

roolin tutkimiseksi c-

CBL

keuhkosyövän, analysoimme sen genomista DNA: ta kasvaimen ja pariksi normaali otetuista näytteistä useilta etniseltä. Keuhkojen kasvain näytteet edustaa valkoihoisilla (n = 50), Afrikkalainen-amerikkalaiset (n = 29), ja Taiwanin (n = 40) keuhkosyöpäpotilaita. Suunnittelimme 12 paria alukkeita sekvensoida koodaavan alueen c-

CBL

geeni, joka ulottuu eksonien 2-16 (taulukko S2). Havaitsimme 8 ainutlaatuista somaattiset mutaatiot C-

CBL eksonien

keskuudessa 8 eri potilailla. Vaihtelu L620F, tunnetun SNP (rs2227988) eksonissa 11 havaittiin myös. Tärkeää on, että kahdeksan uusia ei-synonyymi mutaatiot varmistettiin sekvensoimalla molemmat juosteet c-

CBL

saatu genominen DNA keuhkojen kasvain näytteet (taulukko 1). Lisäksi yksikään 8 mutaatioita havaittiin vastaavan normaalia kudosta, mikä osoittaa, että nämä olivat somaattisia mutaatioita. Neljä samaa yhden nukleotidin vaihtelut (SNVs) on havaittu myös, mutta ei käytetty enempää tässä tutkimuksessa.

Kolme 8 novel non-synonyymi mutaatiot sijaitsevat TKB (tyrosiinikinaasin sitovaa) domain ( S80N, H94Y, ja Q249E), yksi RING finger domain (V391I), yksi proliini-rikas alue (72515_72517 del ATG), ja kolme C-pään alueen (W802 *, R830K, ja A848T) ja c-CBL proteiinia (kuvio 1A ja kuvio S1). Kuvassa 1B, näytämme mallin kromatogrammit edustavat näytteet.

(A) Kaaviokuva eri C-CBL mutanttien suhteen eri toimintakykyyn. Kolme mutaatiot: S80N, H94Y, Q249E sijaitsivat TKB domain; V391I sijaitsi nimetön sormi verkkotunnuksen; 72515_72517 del ATG (ei-lukukehyksen deleetio) ja L620F (tunnettu SNP, rs2227988) on sijoitettu Pro-rikas alue ja W802 *, R830K, ja A848T löydettiin C-terminaalinen alue c-CBL. Numerot esitetään edustavat aminohappoa kantoja. Association c-CBL mutaatioita eri etnisten väestöryhmien on esitetty taulukossa (∧ tiedossa SNP). (B) Edustavia esimerkkejä sekvensointi kromatogrammeja mutaation alueella normaalin (N) ja kasvaimen (T) näytteitä. Nuolet osoittavat heterotsygoottinen mutaatio kasvain näytteessä. (C) Heterotsygotian menetys (LOH) analyysi 37 kasvain ja pariksi normaali näytteitä Taiwanin potilaista. Arvo 0,5 osoittaa Loh on C-

CBL

lokuksessa. (D) Kaaviokuva kromosomi 11 markkereita valittu LOH analyysia ja edustavia esimerkkejä LOH kromatogrammin analyysi. Monistamisen jälkeen käyttäen kromosomi 11 erityisiä microsatellite alukkeita, PCR-tuote erotettiin kapillaarielektroforeesilla ja kvantitoitiin voimakkuuden mukaan.

11q LOH c-

CBL

Gene

Pariksi keuhkojen kasvain ja normaali keuhkojen kudosnäytteitä Taiwanin potilaista (n = 37) tutkittiin LOH. Kahdeksan (21,6%) osoitti Loh klo C-

CBL

lokukseen kromosomissa 11 ja 29 näytettä (78,4%) paljasti normaalin alleelinen osuus on mikrosatelliittimarkkerin (kuviot 1C ja D).

c-CBL Mutaatiot eri etnisten ryhmien

c-CBL kaksinkertainen mutantti S80N /H94Y löydettiin saman potilaan ja yleinen mutaatio korko c-CBL keuhkojen kasvaimet oli 6,7% (8/119). Taajuus c-CBL mutaatio oli korkein suuri cell carcinoma (14,7%; 5 34 potilasta) ja sen jälkeen levyepiteelikarsinooma syöpä (6,3%; 2 32 potilasta) ja vähiten havaittiin adenokarsinooma (AD) (1,8%; 1 53 potilasta), vaikka nämä hinnat eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (p = 0,292). Mutaationopeudet oli 6,0% valkoihoisilla (0 20 AD; 0 10 SQ, ja 3 20 LC), 13,8% vuonna Afrikkalainen-amerikkalaiset (1 10 AD, 1 10 SQ, ja 2 9 LC), ja 2,5% (0 23 AD, 1 12 SQ, ja 0 5 LC) vuonna Taiwanin väestöstä. Lisäksi kahden taiwanilaisen sairastavilla potilailla keuhkosyöpä (yksi squamous ja yksi adenokarsinooma) oli tiedossa SNP L620F. Etniset erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä, mutta voima havaita eroja oli alhainen.

Mutaatiot

MET

ja

EGFR

voidaan käyttää samanaikaisesti Associated c-CBL muutostyöt

Koska Itäaasialaiset keuhkosyöpä on korkeampi taajuus

EGFR

ja

MET

mutaatioita keuhkokasvaimia [21], [22], myös määritetty mutaatioita

EGFR

ja

MET

samassa Taiwanin kohortin näytteet ja verrattiin tuloksia havaitun C-

CBL

muutoksia (LOH ja /tai mutaatioita). Vuonna 37 testatussa, emme löytäneet mitään päällekkäisyyttä C-

CBL

mutaatioita ja c-

CBL

LOH (kuva 2). Kolmen c-CBL mutantteja (kuten tiedetään L620F SNP, rs2227988), yksi näytteistä oli MET mutaatio (N375S) ja toinen oli EGFR-mutaatio (L858R). Niistä 8 näytettä, joka oli Loh on C-

CBL

lokus 5 oli ylimääräinen mutaatio MET (N375S) ja 2 oli

EGFR

eksonin 19 poisto. Kaksikymmentäkuusi näytteissä ei ollut C-

CBL

mutaatio eikä C-

CBL

LOH (3 potilasta oli C-

CBL

mutaatiota mutta ei C-

CBL

LOH). Näistä 26 näytettä 9 oli MET mutaatio (8 N375S, 1 L211W), 13 oli

EGFR

mutaatio (7 eksoni 9 poisto, 6 L858R) ja 4 ei ollut muita markkinatalouskohtelua tai EGFR-mutaatio. Siten määrä MET tai EGFR mutaatioita potilailla, joilla Loh on C-

CBL

lokuksen (7 8) oli samanlainen kuin potilailla, joilla ei C-

CBL

mutaatio tai LOH ( 22 26 potilasta) (p = 0,99). Nämä 4 potilailla, joilla ei ole tunnistettavissa mutaatio C-

CBL

,

MET

tai

EGFR

edusti 10,8% 37 potilasta analysoitiin Taiwanin potilaan kohortissa. Sitä vastoin 89,2% Taiwanin keuhkosyöpään potilailla on tunnistettavissa mutaatio joko C-

CBL

,

MET

tai

EGFR

tai yhdistelmä kolmen geenin (kuvio 2) . Lisäksi päätimme

p53

ja

KRAS

mutaatiot näissä Taiwanin ikäryhmät. Kaksi

p53

ja 1

KRAS

mutaatio havaittiin. Yksittäinen

KRAS

mutaatio päällekkäin yhdellä

p53

mutaatio. Tällä potilaalla oli myös

EGFR

eksonin 19 deleetio mutta ei ollut C-

CBL

mutaatio. Toinen

p53

mutaatio näyte oli C-

CBL

LOH samanaikaisen MET N375S mutaatio. Niinpä Taiwanin analysoitujen näytteiden,

p53 /KRAS

mutaatioita ja c-

CBL

mutaatiot olivat toisensa poissulkevia (tuloksia ei ole esitetty).

37 Taiwanin analysoitiin mutaatiot c-

CBL

,

MET

ja

EGFR

ja Loh analyysi C-

CBL

lokuksessa. Tiedot osoittavat, 21,6% (8/37) oli Loh, kun taas 8% (3/37) oli c-CBL mutaatio (mukaan lukien tunnettujen SNP L620F), nämä näytteet olivat toisensa poissulkevia. Lisäksi 5 8 LOH näytteistä oli myös MET N375S mutaation ja 2 oli

EGFR

eksonin 19 poisto. Näytteissä, joiden C-

CBL

mutaatio, 1 oli myös MET N375S mutaatio, kun taas toinen oli EGFR L858R mutaatio. Näytteissä, jotka eivät satama mitään C-

CBL

mutaatio (70%, 26/37), 22 oli joko

MET

tai

EGFR

mutaatio ja vain 4 ei ollut mutaatiota missä tahansa näistä 3 geeneistä.

Cellular toiminnot c-

CBL

Muutokset kontekstissa Lung tumorigeneesin

. E3 aktiivisuus on ehjä mutantti c-CBL proteiineja.

Sen tutkimiseksi, eri C-CBL mutaatiot vaikuttavat E3 aktiivisuutta, EGFR valittiin malliksi substraattina c-CBL E3-toiminto. Kaikki c-CBL mutanttien testattu parannetun ubikitinaation aktivoitua EGFR samanlainen kuin villityypin c-CBL-proteiinia. Tämä tulos osoittaa, että katalyyttinen aktiivisuus c-CBL mutanttien ei ole heikentynyt, kun EGFR oli substraatti. (Kuvio 3A).

(A) c-CBL-mutantit eivät muuta ubikinaation EGFR. Solut ko-transfektoitiin EGFR ja erilaisia ​​c-CBL-mutantit stimuloitiin EGF, immunosaostettiin anti-EGFR-vasta-aineella ja niitä blotattiin anti-ubikitiini-vasta-ainetta. Immunoblottauksella anti-EGFR-vasta-aine toimi IP-ohjaus, kun taas anti-HA-blot käytettiin tulo-ohjausyksikön. (B) Solujen elinkelpoisuus mitattiin trypaanisiniekskluusiolla ja verrattuna tyhjän vektorin kontrolli. c-CBL villityypin (WT) ja mutanttien S80N /H94Y, Q249E, ja W802 * osoitti 66,7%, 132,3%, 120,8% ja 147,9% solujen elinkelpoisuuden vastaavasti A549-soluja 48 h transfektion jälkeen. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja keskimääräinen data näytetään. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan. (C) Proteiinin ekspressiotasoja eri mutanttien analysoitiin Western-blotit käyttäen c-CBL-vasta-ainetta. (D) Solusyklianalyysiä erilaisten c-CBL mutanttien 48 h transfektion jälkeen A549-soluissa.

B. Vaikutus keuhkosyöpään solujen elinkykyä.

vaikutus edustavan c-CBL mutantti kustakin kolmesta etniseltä taustaltaan keuhkosyöpään solujen elävyys solulinjoissa määritettiin. S80N /H94Y kaksinkertainen mutaatio, Q249E, ja W802 * havaittiin keuhkojen kasvain näytteissä saatu valkoihoinen, Taiwanin ja Afrikkalainen Amerikan, vastaavasti. Kuten on kuvattu menetelmiä, c-CBL villityypin (WT) ja edellä mainitut kolme mutantit ilmennettiin kloonauksen jälkeen ne pAlterMax vektoriin A549-soluja. Nämä solut ilmentävät suhteellisen pieni pohjapinta tasot endogeenisen c-CBL (tuloksia ei ole esitetty). Transfektion tehokkuus oli vertailukelpoinen eri ryhmien välillä ja solujen lukumäärä oli transfektoitu c-

CBL

villityypin konstrukti oli noin 70% verrattuna kontrollisoluihin, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla. Solut, jotka on transfektoitu S80N /H94Y, Q249E ja W802 * c-CBL mutantti konstruktit lisännyt elävien solujen lukumäärä, joka oli 132,3%, 120,8% ja 147,9% korkeampi vastaavasti, verrattuna tyhjän vektorin ohjaus transfektoitujen solujen ja merkittävästi erilainen kuin villin tyyppinen rakentaa (p = 0,022, p = 0,049 ja p = 0,008, vastaavasti) (kuvio 3B). Suhteellisia pitoisuuksia c-CBL-proteiinin kokosolulysaateista valmistettiin näytteestä saatujen Rinnakkaisessa kokeessa oli päättänyt. C-CBL proteiinia tasoja edustavien näytteiden transfektoimattomissa ja tyhjän vektorin transfektoidut solut olivat vertailukelpoisia ja ne edustavat c-CBL WT ja kolme C-CBL mutantit olivat vertailukelpoisia (kuvio 3C).

C. Vaikutus solusyklin.

Tutkia jos lisäykset solujen elinkelpoisuutta eri c-CBL mutantit ovat lisääntyneen soluproliferaatioon solusyklikontrollin analyysi. A549-solut transfektoitiin c-CBL WT tai kolmea eri mutanttien: S80N /H94Y, Q249E ja W802 *. Tyhjän vektorin transfektantin käytettiin kontrollina. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen solujen syklin analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Ei ollut merkittävää muutosta subG1, G1 tai S-vaiheen solusyklin kesken eri mutantteja verrattuna WT-rakenne (p = 0,64, p = 0,40 ja p = 0,28, vastaavasti). G2 /M-vaiheen solusyklin osoitti kasvua solujen määrä kolmen mutantteja, S80N /H94Y, Q249E ja W802 *, verrattuna WT mutta jälleen ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,25) (kuva 3D ).

D. Vaikutus solun liikkuvuus.

vaikutuksen tutkimiseksi ilmaisun kolmen edellä mainitun c-CBL mutanttien solujen vaeltaminen, suoritimme haavan paranemista määritystä, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Sulkeminen tyhjästä tai haavan tarkkailtiin 0, 12, 24, 36, ja 48 h. (Kuvio 4A). Kaikki näytteet, jotka edustivat transfektoitujen solujen mutantteja, haavan ero oli paljon pienempi kuin se, joka nähtiin näytteessä, joka edusti transfektoitujen solujen c-CBL WT (p 0,001). Olemme myös päättäneet haavan sulkeminen kaikkien viisi ryhmää. 48 h, villityypin c-CBL transfektantit osoitti 61,1% avoin haava kun S80N /H94Y, Q249E ja W802 * mutantit osoittivat 18,7%, 23,9% ja 34,3% avoin haava vastaavasti (p 0,001) (kuvio 4B).

(A) Haavan paranemista määritys suoritettiin A549-soluja oli transfektoitu WT c-CBL tai erilaisia ​​mutantteja. Tyhjän vektorin (EV) käytettiin kontrollina. Edustavia kuvia (Brightfield ja vaihekontrastimikroskoopilla) kustakin ajan- näkyvät. (B) avoin haava kunakin ajankohtana kvantitoitiin ja normalisoitu 0 h.