Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tropomyosin liittyviä reseptorikinaasia B (TrkB) signalointia, stimuloida brain-hermokasvutekijä (BDNF) ligandi, edistää syövän etenemiseen, ja liittyy huonoon ennusteeseen eri syöpäsairauksia. Olemme pyrkineet tutkimaan kliinistä merkitystä BDNF /TrkB ilmaisun peräsuolen syöpä (CRC) kudoksia, sen ennusteen arvioinnissa CRC potilaille, ja sen terapeuttista potentiaalia

in vitro

ja

in vivo

. Kaksisataa kaksikymmentä kolme CRC potilaan näytteet käytettiin sekä BDNF ja TrkB mRNA-tasoja. Ekspression näiden proteiinien ensisijaisen ja etäpesäkkeitä tutkittiin immunohistokemiallisesti. CRC solulinjat ja yhdistelmä BDNF ja K252a (selektiivinen farmakologinen yleiseurooppalainen Trk estäjä) käytettiin

in vitro

solujen elinkelpoisuuden, muuttoliike, invaasio, anoikis vastus ja

in vivo

vatsakalvon etäpesäke määrityksiä. Tissue BDNF mRNA liittyi maksan ja vatsakalvon etäpesäke. Tissue TrkB mRNA liittyi myös imusolmuke etäpesäke. Yhteistyössä ilmentymä BDNF ja TrkB liittyi maksan ja vatsakalvon etäpesäke. Potilaat, joilla on korkeampi BDNF, TrkB ja koekspressoimalla BDNF ja TrkB oli merkitsevästi huonoon ennusteeseen. BDNF lisääntynyt kasvainsolujen elinkelpoisuuden, muuttoliike, invaasion ja esti anoikis että TrkB ilmentävien CRC solulinjoja. Nämä vaikutukset hiljennettiin K252a. Hiirissä injektoitiin DLD1 koekspressoivat BDNF ja TrkB, ja sen jälkeen käsiteltiin K252a, vatsakalvon etäpesäkenystyröiden todettiin vähentää, verrattuna kontrollihiiriin. BDNF /TrkB signalointi voi siis olla potentiaalinen kohde hoitoon vatsakalvon carcinomatosis johtuvat paksusuolen ja peräsuolen syöpään.

Citation: Tanaka K, Okugawa Y, Toiyama Y, Inoue Y, Saigusa S, Kawamura M, et al. (2014) Brain-hermokasvutekijä (BDNF) aiheuttaman Tropomyosin-Related Kinase B (Trk B) signalointi on potentiaalinen terapeuttinen kohde Peritoneaalisille carcinomatosis aiheutuvia peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (5): e96410. doi: 10,1371 /journal.pone.0096410

Editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 15. lokakuuta, 2013 Hyväksytty 7 huhtikuuta 2014; Julkaistu: 06 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksilla opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (KAKENHI 24591972 Yi, ja 25462051 SS). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksamatta edistymistä metastasoituneen kolorektaalisyövän (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) on perustettu äskettäin usean lääkkeen yhdistelmää chemotherapies, joka nyt tuottaa mediaanielinajassa kertaa yli 20 kuukautta [1]. Kuitenkin vatsakalvon carcinomatosis (PC) voi syntyä CRC. PC liittyy erittäin huono selviytyminen, ja hyvin harvat terapeuttiset tai lievittävää hoitoja [2]. Siten ymmärtää paremmin molekyyli- ja biologista käyttäytymistä PC johtuvien CRC kiireellisesti tarvitaan helpottamaan uusien hoitostrategioiden.

Brain-hermokasvutekijä (BDNF) on jäsenenä neurotrophin ( NT) perhe. BDNF on tärkeä rooli kehityksessä ja korjaus hermoston [3]. Se sitoutuu sen kaksi suurta reseptorien tropomyosin liittyvä reseptorikinaasia B (TrkB) suurella affiniteetilla ja spesifisyys, ja yleiseurooppalaisen NT reseptorin p75 (p75

NTR) heikolla affiniteetilla [4]. Sitovat BDNF on TrkB johtaa autofosforyloinnin tyrosiineilla solunsisäisessä verkkotunnusta aktivointi alavirran signalointireittien kuten RAS /MAPK ja PI3K /AKT [4], [5]. BDNF sitoo myös matalan affiniteetin reseptoriin p75

NTR joka kohdistaa erilaisia ​​toimintoja kuten säätelyyn solujen eloonjäämistä ja erilaistumista aikana hermosolujen kehitykseen [6].

Vaikka sekä TrkB ja p75

NTR mukana leviämisen, erilaistuminen, selviytyminen ja apoptoosin neuronien ja muiden hermosolujen kasvaimia [7], [8], p75

NTR ensisijaisesti toimii vuorovaikutuksessa kumppani TrkB, moduloi TrkB aktivointi BDNF, ja vaikutteita prosurvival vaikutus BDNF /TrkB signalointi [ ,,,0],9].

BDNF /TrkB signalointi on raportoitu liittyvän kasvaimen etenemiseen, etäpesäkkeitä, ja vastaus kemoterapiaa useissa ihmisen maligniteettien kuten neuroblastooma [10], munasarjojen [11], pään ja kaulan [12 ], keuhko [13], hepatosellulaarinen [14], haiman [15], virtsarakon [16], eturauhassyöpä [17], multippeli myelooma [18], ja rintasyöpäsolujen [19]. TrkB on myös osoitettu edistävän vastustuskyky anoikis (muoto irronnut indusoiman apoptoosin) [20], ja siten antaa metastaattista ominaisuuksia tai epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) [21], [22]. Toisin roolia TrkB syövän, p75

NTR näyttää joko kasvain edistäviä tai kasvaimeen estävä mukaiset toiminnot kasvaintyypeissä [8].

Aiemmin tutkimukset laboratoriossamme ovat paljastaneet: yhdistyksen välillä TrkB tasojen kasvainprogression ja potilaan ennusteeseen mahasyövän [23]; yhdistys TrkB kemoterapiaan vastarintaa ruokatorven syöpä [24]; ja TrkB osallistuminen EMT paksusuolen syövän [25]. Viime aikoina olemme osoittaneet osallistumista BDNF /TrkB väylän syövän etenemisen mahasyövän [26].

Mitä tulee BDNF /TrkB signaloinnin CRC, BDNF tai TrkB yliekspressoitui kummassakin kliinisessä kasvain näytteitä ja liittyy aggressiivinen kasvain fenotyypit [27] – [30].

In vitro

tutkimukset osoittivat, että BDNF /TrkB signalointi mukana proliferatiivinen tai invasiivisia ominaisuuksia [27] – [30], ja tehoa tai resistenssiä anti-epidermaalisen kasvutekijän reseptorin monoklonaalisen vasta-aineen setuksimabin [31], tai gastriini vapauttavan peptidin reseptorin [32]. Nämä linjat todisteet osoittivat, että BDNF /TrkB signalointi edistää syövän etenemiseen, mikä johtaa huonoon ennusteeseen eri ihmisen maligniteettien, ja että se on tullut potentiaalinen terapeuttinen kohde [33], [34].

Tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää: yhdistyksen välillä BDNF /TrkB ilmaisun ja kliinis muuttujia sarjassa ihmisen CRC kudosten prognostisia arvo BDNF /TrkB signalointia CRC potilaille; ja sen terapeuttista potentiaalia in vitro ja in vivo.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board ja paikallinen eettinen komitea Mie yliopiston Graduate School of Medicine (nro 2126). Kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista (aikuiset ja vanhemmat lapset) otettiin kiinni tutkimus.

Kokeellinen protokollia in vivo tutkimukset tarkistettiin ja hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea on Mie yliopiston Graduate School of Medicine.

potilaat

kaikkiaan 223 potilasta, joilla CRC, joita hoidettiin laitoksella Ruoansulatuskanavan ja Pediatric Surgery vuonna Mie yliopiston Graduate School of Medicine 2000-2008, oli mukana tässä tutkimuksessa. Potilaat, joilla on puutteelliset kliinisiä tietoja, riittämättömiä jatkotoimia tai riittämätön kudoksen näytteitä otettiin pois tutkimuksesta. Kaikki potilaat olivat histologisesti varmennettu adenokarsinooma paksusuolen tai peräsuolen. Mediaani-ikä potilailla oli 67 vuotta (vaihteluväli: 12-91 vuotta). Mediaani seuranta-aika oli 30,6 kuukautta (alue: 1,5-+107,2). Kaikkiaan 49 potilasta kuoli CRC liittyvien syiden tänä aikana.

Staging perustui kliinisiin arviointiin ja histopatologista analyysiä käyttäen International Union Against Cancer (UICC) TNM lavastus järjestelmä. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osallistuneista potilaista päälle tutkimus, paikallisten eettisten ohjeiden. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board.

näytekokoelmien

Syöpä kudokset jäädytettiin nestetypessä heti kirurgisen resektion ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Diagnoosi CRC vahvistettiin kaikille 223 potilasta perustuvat ennusteeseen viittaavia havaintoja.

Yhteensä RNA: n uutto, cDNA-synteesi

Syöpä kudokset jauhettiin ja homogenisoitiin Mixer Mill MM 300 homogenisaattorilla (Qiagen, Chatsworth , CA, USA). Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy mini -kittiä (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin 5 ug kokonais-RNA: satunnainen heksameeriä aluketta ja Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (RT -PCR) ja suhteellinen geeniekspressiotasot

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) analyysi suoritettiin käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ilmentymistasojen kohdegeenin transkriptit, mitattuna käyttäen TaqMan-koettimia BDNF (määritys ID, Hs00380947_m1) ja TrkB (määritys ID, Hs00178811_m1), normalisoitiin GAPDH (määritys ID, Hs02758991_g1) ja arvioitiin käyttäen Applied Biosystems StepOne Software (v2. 1).

suhteellinen BDNF ja TrkB geeniekspression tasot määritettiin käyttämällä standardikäyrää. Standardikäyrä tuotettiin käyttäen 5-kertaista sarjalaimennosta satunnaisalukkeilla qPCR Human Viite-cDNA (TAKARA BIO INC., Clontech, Japani). Kaikki vakio käyrät lineaarinen alueella käytetään analysointiin, joiden hyväksyttävä vastaava korrelaatiokerroin (R

2). Ilmentymistaso kohdegeenin laskettiin standardikäyrästä, ja normalisoitu vastaan ​​GAPDH. Lopuksi, kohdegeenin mRNA: n taso ilmaistiin suhteena suhteessa GAPDH-mRNA: n tasolla. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle, ja keskiarvoa käytettiin laskettaessa mRNA: n ilmentymisen tasoja.

Amplified PCR-tuotteet erotettiin elektroforeettisesti, visualisoitiin ja valokuvattiin UV-valossa etidiumbromidivärjäyksen jälkeen.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Osiot 2-3 pm paksu leikattiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) yksilöihin CRC potilaista. Sen jälkeen deparaffinization ja kuivuminen, näytteet keitettiin 10 mM natriumsitraattipuskurissa 15 min paljastamaan antigeenejä. Leikkeitä blokattiin sitten normaalia vuohen seerumia (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) 60 minuutin ajan ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä Envision reagensseja (Envision kit /HRP, Dako Cytomation, Tanska). Kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Ensisijainen kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan, BDNF (H-117, 1:350; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ja ensisijaisen hiiren monoklonaalinen vasta-aine TrkB (1:100; R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), jonka 1:100 laimennus, ja hiiren monoklonaalinen anti-aktiini (klooni 4) vasta-aine (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA), jonka 1:400 laimennus 5% rasvatonta maitoa TBS-T: ssa yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa TBS-T: n, blotteja inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Promega, Madison, WI, USA), jonka 1:200 laimennus 5% rasvatonta maitoa TBS-T: llä. Hoidon jälkeen parannettu kemiluminesenssidetektiolla ratkaisu, kemiluminesenssi signaaleja saatiin näkyviin CS Analyzer ja AE-6962 kevyt capture (ATTO Corp., Tokio, Japani).

solunelinkykyisyysmääritys

arvioimiseksi vaikutusta BDNF solujen elinkelpoisuuden muuttoliike, invaasio, ja anoikis vastus, rekombinantti ihmisen BDNF ja K252a, selektiivinen farmakologinen yleiseurooppalainen Trk estäjä, käytettiin.

solun elinkelpoisuus, muuttoliike, invaasio, ja anoikis vastus oli verrattuna muun ei-käsitellyissä soluissa (kontrolli), BDNF-käsiteltyjä soluja, K252a-käsiteltyjä soluja, ja K252a seurasi BDNF-käsitellyissä soluissa.

Sytotoksisuus arvioitiin käyttäen WST-8 [2- (2-metoksi -4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2, 4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium, mononatriumsuola] kolorimetrisellä määrityksellä. Syöpäsolut (5000 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppaisille solulevyille (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) 100 ul: ssa viljelyalustaa 24 tuntia. Esi-inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin K252a (100 nM) tai seerumia 2 h, ja sitten käsiteltiin joko rekombinantti ihmisen BDNF (100 ng /ml) tai seerumia. 48 tuntia myöhemmin väliaine poistetaan ja korvataan 90 ul: tuoretta elatusainetta, minkä jälkeen lisättiin 10 ui WST-8-reagenssiliuosta (Cell Counting Kit, Dojindo Laboratories, Japani) ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa inkubaattorissa .

Solujen elinkyky määritettiin kolorimetrisellä verrattuna lukemalla optinen tiheys (OD) arvot mikrolevylukijalla (Softmax, Molecular Devices Corporation, CA, USA) absorptio aallonpituudella 450 nm. Sytotoksisuus arvioitiin käyttämällä Cell Counting Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tiedot saatiin samanlaisia ​​tuloksia vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe (SE).

migraatiokokeessa

Confluent syöpäsolut olivat seerumideprivaatio 48 tuntia. Haavat luotiin käyttäen steriiliä 200 ui pipetin kärjen esi-inkuboinnin jälkeen, jossa K252a (100 nM) tai seerumia 2 tuntia. Rekombinantti ihmisen BDNF (100 ng /ml) tai seerumitonta alustaa lisättiin ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 46 h. Haavan arvioitiin käyttäen Olympus IX71 mikroskoopilla (Olympus, Center Valley, PA, USA) 10-kertaisella suurennuksella. Solujen migraation etäisyys mitattiin käyttämällä Adobe Photoshop 9.0.2 ohjelmistoja ja verrataan perustasomittaukset. Kukin riippumaton koe suoritettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SE.

invaasiomääritys

Solun hyökkäystä arvioitiin käyttämällä BioCoat matrigeelin invaasio kammiot ja ohjaus insertit (Becton Dickinson Labware). Yhteensä 50000 solua /kuoppa siirrostettiin hyökkäystä ja ohjaus kammiot, ja esi-inkuboitiin 100 nM K252a tai seerumia 2 tuntia. Tuoretta kasvualustaa yksin tai väliaineessa, joka sisälsi ihmisen rekombinantti-BDNF (100 ng /ml) lisättiin sitten Falcon kumppani levyjen (BD Biosciences, San Jose, CA). Matrigel hyökkäys kammiot ja ohjaus insertit inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa. Inkuboinnin alustassa, joka sisältää soluja, poistettiin yläkammioon käyttäen vanupuikoilla ja seerumittomassa elatusaineessa. Kalvot kiinnitettiin metanolissa, Mayerin hematoksyliinillä, vesi etanolissa, ja asetettiin lasilevyille. Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat alapuolen kalvo määritettiin sitten. Jokainen itsenäinen koe suoritettiin kolme kertaa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SE.

Anoikis määrityksessä

Anoikis, irtoaminen: n indusoiman apoptoosin, tiedetään indusoituvan kun kiinnittyneet kasvainsolut pakko kasvaa tarttumattoman tavalla. Anoikis vastus arvioitiin osuutta elinkelpoisten syöpäsolujen lisääntyneet kuin toisissaan kiinni alhaisen kiinnityksen ruokia.

Anoikis määritykset suoritettiin kuuden hyvin Costar Ultra Low Attachment Microplates (Corning, NY, USA). DLD1, LoVo ja SW480-solut suspendoitiin RPMI-1640: BDNF (100 ng /ml), K252a (100 nM) tai K252a + BDNF pitoisuutena 5 x 10

5 solua /ml, vastaavasti. Niiden solujen suspensiot (2 ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 24 h kosteassa ilmakehässä (37 ° C: ssa ja 5% CO

2).

Kun induktio anoikis, solut ympättiin 5 x 10

3 solua /kuoppa mikrotiitterilevylle (96 kuoppaa, tasainen pohja) lopullisessa tilavuudessa 100 ui viljelyalustaa kuoppaa kohti. Arvioida elinkelpoisia tuumorisoluja, että lisääntynyt ei-toisissaan kiinni alhaisen kiinnityksen ruokia, spektrofotometrinen Jokaisen kuopan absorbanssi mitattiin käyttämällä WST-8-reagenssiliuosta, kuten edellä on kuvattu (solunelinkykyisyysmääritys). Jokainen itsenäinen koe suoritettiin kuusi kertaa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SE.

Kun induktio anoikis, 5 x 10

5 solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan 1 x sitomispuskurissa, ja anneksiini V: fluoreseiini-isotiosyanaatti /propidiumjodidia ( PI) merkinnät suoritettiin valmistajan protokollan (Bio Vision, Mountain View, CA, USA). Analyysi suoritettiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA) määrittää osuus elinkelpoisten tai apoptoottisten kasvainsolujen ei-tarttuva kasvua varten käyttäen alhaisen kiinnityksen ruokia. Kukin näyte sisälsi 5 x 10

5 solua. Aineisto analysoitiin käyttämällä CellQuest Pro ohjelmistoa (BD Biosciences). Elinkelpoiset kasvainsolut, jotka olivat negatiivisia sekä anneksiini V ja PI-värjäyksellä (alhaalla vasemmalla neljänneksessä) katsottiin anoikis-resistenttien solujen kanssa tarttumattoman kasvua. Apoptoottisia kasvainsolut, jotka olivat positiivisia anneksiini V värjäytymistä (oikeanpuoleiseen alanurkkaan + oikeasta yläneljänneksestä) katsottiin anoikis aiheuttama solujen. Kasvainsoluja käsiteltiin 2,5% formaliinin liuosta käytettiin positiivisena kontrollina indusoiman apoptoosin soluissa. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin tulosten varmistamiseksi solunelinkykyisyysmääritys anoikis vastus.

In vivo

vatsakalvon etäpesäkkeiden määrityksessä

Male nude-hiirten (BALB /c) 8 viikon iässä hankittiin Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japani). Kokeelliset protokollat ​​tarkistettiin ja hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea on Mie yliopiston Graduate School of Medicine. DLD1 soluja (5 x 10

7 solua /500 ui PBS) ruiskutettiin vatsaonteloon vatsakalvon metastaattisen muodostumista. Joko K252a (500 ug /kg) tai PBS: ää (kontrolli) injektoitiin intraperitoneaalisesti kolme kertaa viikossa vaikutuksen tutkimiseksi K252a on vatsakalvon metastaattisen muodostumista. Neljä viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin, ja sitten koko ja määrä vatsakalvon etäpesäkenystyröiden arvioitiin (kukin ryhmä; n = 5). Tulokset esitetään keskiarvona ± SE.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen JMP versio 5 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE (keskivirhe). Erot ryhmien arvioitiin käyttämällä Pearsonin chi-neliö testi, toistuvan toimenpiteiden varianssianalyysi (ANOVA) analyysi, tai parittomalla Studentin t-testiä. Vakuutusmatemaattisten eloonjäämiskäyrät saatiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmää, ja vertailut tehtiin käyttäen log-rank-testejä. Yhden ja usean analyysit tehtiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien mallia vaikutusten tutkiminen histopatologisen ja molekyylitason tekijät (BDNF ja TrkB ilmentymistilanne) läsnä primaarikasvaimen näyte eloonjäämiseen (OS). Liittyvät muuttujat selviytymisen kanssa P-arvo on alle 0,05 vuonna yhden muuttujan analyysiin, käytettiin monimuuttujamenetelmin. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaksipuoliset P-arvojen 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

BDNF mRNA tasolla CRC kudoksissa

BDNF mRNA ilmaisun suhteen, suhteessa GAPDH, CRC kudoksissa oli 0,122 ± 0,230 (keskiarvo ± SD), jotka vaihtelevat 0-+1,357. Tilastollista analyysiä varten BDNF mRNA ilmaisun arvot kahtia niin alhainen tai korkea. Sulku arvo BDNF mRNA-tasolla määritettiin enintään ennustearvon käyttäen OS perustuu vastaanottimen toimineiden (ROC) käyrä analyysi. Sata ja kahdella potilaalla oli korkea BDNF mRNA ilmaisun ( 0,037), kun taas 121 potilaalla oli alhainen BDNF mRNA ilmaisun. Kuten taulukosta 1, BDNF mRNA ilmaisun tasolla CRC kudoksissa havaittiin merkitsevästi yhteydessä synkroninen maksan etäpesäke (P = 0,007) ja synkroninen vatsakalvon etäpesäkkeiden (P = 0,026). Ei merkittävää yhteyttä välillä havaittiin BDNF mRNA CRC kudosten ja muita kliinispatologiset muuttujiin.

TrkB mRNA tasolla CRC kudoksissa

Mukaan TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA), koetin TrkB (Pitoisuus ID, Hs00178811_m1) on suunniteltu span eksonin 6/7 rajoja. Vastaavat alukkeita monistamaan fragmentteja, jotka sisältävät eksonit 6-7, joka koodaa solunulkoisen osan TrkB-reseptori. Siksi tämä aluke ja koetin asettaa havaitsee sekä täyspitkä TrkB (TrkB.FL) ja katkaistun TrkB (TrkB.T1) [35].

TrkB mRNA ilmaisun suhteen, suhteessa GAPDH, CRC kudokset oli 0,054 ± 0,141 (keskiarvo ± SD), jotka vaihtelevat 0-+1,149. ROC-käyrä osoitti, että raja-arvo TrkB mRNA oli 0.002 (enintään ennustearvo OS). Sataseitsemänkymmentä potilasta oli korkea TrkB mRNA ilmaisu, kun taas 52 potilaalla oli alhainen TrkB mRNA ilmaisun. Kuten on esitetty taulukossa 1, TrkB mRNA-tasolla CRC kudoksissa havaittiin olevan merkittävästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke (P = 0,022). Ei merkittävää yhteyttä välillä havaittiin TrkB mRNA tasolla CRC kudosten ja muita kliinispatologiset muuttujiin.

Co-ilmentymä BDNF ja TrkB CRC kudoksissa

Yhdeksänkymmentäneljä potilailla havaittiin sekä korkea BDNF ja TrkB mRNA ilme. Tämä potilasryhmä luokiteltiin ilmensivät sekä BDNF ja TrkB. Kuten taulukosta 1, co-ilmentymä BDNF ja TrkB CRC kudoksissa havaittiin merkitsevästi yhteydessä synkroninen maksan etäpesäke (P = 0,03) ja synkroninen vatsakalvon etäpesäkkeiden (P = 0,013). Ei merkittävää yhteyttä välillä havaittiin TrkB mRNA tasolla CRC kudosten ja muita kliinispatologiset muuttujiin.

ennustetekijöiden vaikutusta BDNF, TrkB, ja toinen ilmentymä BDNF ja TrkB kolorektaalisyövässä kudoksissa

kuvassa 1 Kaplan-Meier -käyrät BDNF (A), TrkB (B), ja toinen ilmentymä BDNF ja TrkB (C), tässä järjestyksessä. CRC potilailla, joilla on korkea BDNF mRNA ilmaisun (n = 102) oli merkittävästi huonompi OS kuin ne, joilla on alhainen BDNF mRNA ilmaisun (n = 121, log-rank testi, p = 0,0066). Samoin CRC potilailla, joilla on korkea TrkB mRNA: n ilmentymisen (n = 171) oli merkittävästi huonompi OS kuin ne, joilla on alhainen TrkB mRNA: n ilmentymisen (n = 52, log-rank testi, p = 0,0474). CRC potilaille, joiden kasvaimet koekspressoi BDNF ja TrkB (n = 94) oli merkittävästi huonompi OS kuin muiden ekspressiokuviota (n = 129, log-rank testi, p = 0,0348).

(A ): vertailu eloonjäämisaste potilasryhmien korkea BDNF mRNA ilmaisun (n = 102) ja ne, joilla on alhainen BDNF mRNA ilmaisun (n = 121). (B): vertailu eloonjäämisaste potilasryhmien korkea TrkB mRNA: n ilmentymisen (n = 171), ja ne, joilla on alhainen TrkB mRNA: n ilmentymisen (n = 52). (C): vertailu eloonjäämisaste potilasryhmät, joilla on korkea koekspressio BDNF ja TrkB: n (n = 94) ja ilman sitä (n = 129). TrkB mRNA ilmaisu osoittaa mRNA transkriptipitoisuuksissa sekä TrkB.FL ja TrkB.T1.

BDNF ja TrkB proteiinin ilmentymistä perus- ja etäpesäkkeitä

immunohistokemia osoitti, että BDNF-proteiinia ( A, B) on ilmaistu sytoplasmassa ihmisen CRC soluja ja että TrkB proteiini (C, D) on ilmaistu tumassa ihmisen CRC-soluja (kuvio 2). Potilailla, joilla molemmilla primaarikasvaimen (A, C) ja vatsakalvon etäpesäkenystyröiden (B, D), ihmisen CRC solujen vatsakalvon etäpesäkenystyröiden ilmaistaan ​​sekä BDNF ja TrkB, samoin ne on primaarikasvaimen. Olemme vahvisti, että anti TrkB-vasta-ainetta (R P 0,05.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että eksogeeninen BDNF lisää kasvainsolujen elinkelpoisuuden TrkB-ilmentävien CRC-soluja, ja että TrkB-reseptori estäminen voi tarjota voimakas keino estämään kasvaimen kasvua.

BDNF edistää maahanmuuttoa TrkB ilmentäviä CRC solujen

vaikutuksen tutkimiseksi BDNF kasvaimen solun liikkuvuus, DLD1 soluja käytettiin

in vitro

muuttoliike määrityksiä. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, BDNF lisäsi merkittävästi migraation DLD1 solujen, verrattuna ei-käsiteltyihin kontrolleihin. K252a vähensi muuttavia kykyä DLD1 soluja, mikä oli lähes identtinen kuin käsiteltyihin kontrolleihin. K252a seuraa BDNF esti muuttavia kykyä DLD1 solujen verrattuna BDNF hoitoon. Edustaja kuvia edellä Tulokset on esitetty kuviossa 5A. Kvantitatiivinen analyysi solumigraation myös kuvassa (kuva 5B).