Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Huolimatta kynnyksellä FDA-hyväksyttyjä hoitomuotoja on rajallinen määrä käytettäviä tavoitteita (kinaasien ja mTOR), PFS munuaissyöpä (RCC) on laajennettu vain yhdestä kahteen vuosina johtuen lääkeresistenssin kehittymisen. Täällä arvioida uusia terapeuttisia RCC, joka on suunnattu exportin-1 (XPO1) estäjä.

Materiaalit ja menetelmät

RCC-soluja käsiteltiin oraalisesti käytettävissä XPO1 estäjä, KPT-330, ja solujen elinkelpoisuus ja anneksiini V (apoptoosin) määritykset, ja solusyklin analyysit suoritettiin tehokkuuden arvioimiseksi KPT-330 kaksi RCC solulinjoissa. Immunoblottauksella ja immunofluoresenssilla analyysi tehtiin vahvistamaan mekanismeja XPO1 eston. Tehoa ja on-kohde vaikutuksista KPT-330 analysoitiin edelleen in vivo RCC ksenograftin hiirissä, ja KPT-330-resistentit solut perustettiin arvioida mahdollisia mekanismeja KPT-330 vastus.

Tulokset

KPT-330 heikennetty RCC elinkelpoisuuden kautta kasvun eston ja apoptoosin induktio sekä in vitro että in vivo, prosessissa, jossa lisääntynyt ydinvoiman lokalisointi p21 by XPO1 esto oli merkittävä rooli. Lisäksi KPT-330 resistenttien solujen pysyi herkkiä nykyisin hyväksytty RCC multi-estäjät (sunitinibi, sorafenibi) ja mTOR estäjät (everolimuusille temsirolimuusi), mikä viittaa siihen, että nämä kohdennetut terapeuttiset jäisivät käyttökelpoisia toisen linjan terapeuttisina seuraavat KPT-330 käsittely.

Johtopäätös

suullisesti-käytettävissä XPO1 estäjä, KPT-330, edustaa uutta tavoitetta RCC joiden teho in vivo lähestyy sunitinibin. Lisäksi solut vastustuskykyisiä KPT-330 säilyttävät kykynsä reagoida saatavilla RCC terapeuttiset viittaa uudenlainen lähestymistapa hoitoa KPT-330-naiivi sekä kestävät RCC potilaita.

Citation: Wettersten HI, Landesman Y, Friedlander S, Shacham S, Kauffman M, Weiss RH (2014) Erityinen esto Nuclear viejä Exportin-1 vaimentaa Munuaiset Syöpä kasvu. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10,1371 /journal.pone.0113867

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 31 lokakuu 2014; Julkaistu: 02 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Wettersten et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health myöntää 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1, ja 1R01DK082690-01A1 sekä Karyopharm Therapeutics. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vaikka osa työstä rahoittivat, ja jotkut kirjoittajat palveluksessa, jonka Karyopharm tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Lisäksi yksikään koe tai päätelmät paperin vaikuttivat millään tavalla Karyopharm.

Johdanto

Munuaissyöpä (munuaissyöpä, RCC) on 13

th eniten yleisin syöpä maailmassa ja on yksi harvoista syöpien, joiden esiintyvyys lisääntyy, tämä toteamus ei pelkästään takia parantuneet diagnostiset tekniikat [1], [2]. Oireita RCC ovat usein hienovaraisia ​​tai jopa poissa, niin että yli puolet potilaista diagnosoidaan muuten usein aivan etäpesäkkeitä, samalla kun arvioidaan muihin sairauksiin, kuten akuutti munuaisen vamma [3]. Vaikka viiden vuoden eloonjääminen niille, joilla esiintyy paikallisia RCC on yli 70%, niille, joilla on etäpesäkkeitä, viiden vuoden eloonjääminen putoaa synkkä 16-32%. Noin puolet RCC potilaista kehittyy edennyt sairaus ja vaativat systeeminen hoito. Huolimatta kynnyksellä useita FDA-hyväksyttyjä kohdistettuja hoitomuotoja viime vuosien, jotka rajoittuvat usean estäjät ja mTOR-inhibiittorit, elinaika ilman taudin etenemistä (PFS) on laajennettu vain yhdestä kahteen vuotta näiden kohdennettujen terapeuttisten johtuu suurelta osin kehitystä lääkeresistenssin [4]. Näin ollen, on tärkeää kehittää uusia terapeuttisia tavoitteisiin muita kuin kinaasien ja mTOR kautta.

p21 oli alun perin kuvattu sykliiniriippuvaisen-kinaasin estäjä (CKI) sykliini-CDK2, -CDK1, ja – CDK4 /6-komplekseja, joiden ekspressio on klassisesti säätelee p53 [5]. Kuitenkin vuosien varrella on osoitettu olevan pleiotrooppisimpien, ja toisinaan näennäisesti ristiriitaisia, vaikutukset soluproliferaatioon, apoptoosin, ja vanhenemista syövän ja verisuonitautien riippumaton p53 [5], [6]. Yleensä, kun p21 on sijaittava tumassa, se sitoutuu sykliini-CDK-komplekseja ja siten inhiboivat niiden toimintaa solusyklin etenemistä, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen [5]. Kuitenkin, kun p21 on sijaittava sytosolin osastoon, se estää apoptoosin komplekseja pro-apoptoottiset proteiinit, kuten pro-kaspaasi-3 tai ASK [7], [8]. Yhdenmukaisesti näiden oletettujen mekanismeja, aikaisemman työn laboratoriossamme ovat osoittaneet, että lisääntynyt soluliman p21 on merkki huonon ennusteen RCC potilailla [9], toteaminen havaittu myös muissa syövissä [10], [11].

ydinaseiden viejä, exportin11 (XPO1; CRM1), ohjaa nucleo-sytoplasman lokalisointi yli 200 Nuclear Export Signal (NES) sisältävä proteiineja, joista monet ovat tuumorisuppressorin proteiineja (tsps), mukaan lukien p21 [12]. Aiemmin on osoitettu, että XPO1 inhibiittorit on terapeuttinen vaikutus RCC [13]. Tässä tutkimuksessa testasimme tehoa KPT-330, suun kautta käytettävissä XPO1 estäjä, joka on tällä hetkellä vaiheen I /II kliinisissä kokeissa, arvioida sen mahdolliset kliiniset, joko yksinään tai yhdistelmänä hoidon kehittyneissä RCC. Nyt näyttää, että todennäköisesti mekanismilla liittyvä solunosasijaintia p21, tämä suullisesti-käytettävissä XPO1 estäjä edustaa elinkelpoisen uuden terapeuttinen vaikuttava edustaa tähän asti testaamattomia tavoite RCC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

RCC solulinjat ACHN ja 786-O saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD) ja arvioitava säännöllisesti läsnäolo Mycoplasma. Normaali ihmisen munuaisen proksimaalisen epiteelin (NHK) solut saatiin Lonza (Allendale, NJ). Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml streptomysiiniä ja 100 mg /ml penisilliiniä, 5% CO

2 37 ° C: ssa. Nämä kaksi solulinjaa valittiin tutkia tehokkuuden KPT-330 sekä primaarisen kasvaimen peräisin olevat solut (786-O, jota voidaan pitää ”aikaisin” kasvaimet) sekä metastaattisen soluja (ACHN).

Materiaalit

Lipofectamine RNAiMAX transfektioreagenssia, Stealth RNAi negatiivinen kontrolli siRNA, ja Stealth RNAi XPO1 siRNA saatiin Life Technologies (Grand Island, NY). KPT-330 syntetisoitiin Karyopharm Therapeutics (Natick, MA). Sunitinibi ja sorafenibi vapaa emäs saatiin LC Laboratories (Worburn, MA). Everolimuusin ja temsirolimuusi olivat lahja tri Prasit klo Inception Sciences (San Diego, CA). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine saatiin Sigma (St. Louis, MO). Kaniinin polyklonaalista anti-XPO1-vasta-aineen ja hiiren monoklonaalinen anti-p53-vasta-aine saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-p21WAF1 /Cip-vasta-aine saatiin Millipore (Bedford, MA). Kanin monoklonaalista anti-p21WAF1 /Cip-vasta-aineen ja anti-kani-IgG (H + L), F (ab ’) 2-fragmentti (Alexa Fluor 488-konjugaattia) saatiin Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Vuohen anti-hiiri, ja vuohen anti-kani-HRP-konjugoitu IgG saatiin Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield HardSet kiinnitysväliaine DAPI saatiin Vector Laboratories (Burlingame, CA).

KPT-330 sunitinibi sorafenibi everolimuusi, ja temsirolimuusi liuotettiin DMSO in vitro -tutkimuksissa. KPT-330 yhdistettiin ajoneuvot poloksameeri 188 (Pluronic F68, joka on saatu Spectrum Laboratory Products, Inc.) ja PVP K-29/32 (Plasdone K-29/32; saatu ISP Technologies, Inc.) liuoksessa ja sunitnib oli liuotetaan kasviöljy varten in vivo.

Immunoblottausmääritys

Immunoblottausmääritys oli kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun tarvittaessa hoitoja, solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), hajotettiin hajotuspuskurissa, ja solulysaatit immunoblotattiin. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja tutkittiin sopivia vasta-aineita. Sitten kalvot koetettiin HRP tagged anti-hiiri tai anti-kani IgG. Signaalia ei havaittu käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) ratkaisuja. Densitometria-analyysi suoritettiin käyttäen ImageJ 1,440 ohjelmisto (https://imagej.nih.gov/ij) ja sen jälkeen, kun normalisoinnin kuormituksen valvonta (β-aktiini) edellä on esitetty kunkin immunoblottaus.

Immunofluoresenssi

kun osoitettuun hoito kahdeksassa hyvin kammiossa dioja, immunofluoresenssilla tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja sijoitetaan estopuskurissa. Sen jälkeen soluja inkuboitiin osoitetun vasta-aineen, inkuboitiin anti-kani-IgG (H + L), F (ab ’)

2 Fragment (Alexa Fluor 488 Konjugaatti), ja peitettiin Vectashield DAPI. Näytteet tutkittiin konfokaalimikroskopialla.

MTT-määritystä

Solujen elinkelpoisuus määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille, ja sen jälkeen tarvittaessa hoitoja, soluja inkuboitiin MTT-liuosta /media seoksen. Sitten MTT-liuos poistettiin ja siniset kiteinen sakka kussakin kuopassa liuotettiin DMSO: hon. Näkyvä Kunkin kuopan absorbanssi 540 nm: ssä kvantitoitiin käyttäen mikrolevylukijaa.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin käyttäen MUSE- Cell Analyzer (Millipore, Billerica, MA) seuraten valmistajan ohje. Lyhyesti, sen jälkeen, kun asianomaiset hoidot, solut pestiin PBS: llä ja värjättiin propidiumjodidilla (PI). Värjäyksen jälkeen solut käsiteltiin solusyklin analyysi.

anneksiini V-määritys

anneksiini V Dead Cell määritys suoritettiin käyttäen MUSE Cell Analyzer seuraavia valmistajan ohjeita. Lyhyesti, kun sopiva hoitoja, soluja inkuboitiin anneksiini V ja Dead Cell Reagent (7-AAD) ja tapahtumia kuollut, myöhään apoptoottiset, varhainen apoptoottiset, ja elävät solut laskettiin.

Immunohistokemia

Biogenex I6000 automatisoitu immunostainer käytettiin suorittamaan IHC on formaliinilla parafiiniin upotettuja ksenograftit. Antigeeni noudettiin höyryssä kanssa Cell Marque Declere reagenssia. Taustaa estettiin Biogenex Virta lohko. Ensisijainen vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, mitä seuraa tunnistus kaksivaiheinen, Hi-Def Polymer Detection Kit Cell Marque, jonka jälkeen Cell Marque DAB kromogeenina. Näytteet vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, poistetaan, ja peitettiin. Käytimme seuraavia ensisijainen vasta: P21 (Abcam) ja Ki67 (Cell Marque). Millipore Apoptoosi pakkaus käytettiin mukaan valmistajien protokollan.

siRNA transfektion

Lipofectamine RNAiMAX transfektioreagenssi sekoitettiin Stealth RNAi siRNA seuraten valmistajan ohjeita. Sitten soluja inkuboitiin seosta kasvualustan ilman penisilliiniä /streptomysiiniä varten sopiva aika transfektioon siRNA: iden ja knockdown vahvistettiin immunoblottauksella.

ACHN ksenografti Hiirikoe

UC Davis Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) komitea erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen. Kaikki eläin menettelyt suoritettiin noudattaen Kalifornian yliopiston IACUC. Mies joilta puuttuu kateenkorva Nu /Nu-hiiriin injektoitiin 5 x 10

5 ACHN solua ihon alle kylkeen alueelle. Syövän etenemistä seurattiin viikoittain tämä paksuudeltaan (kasvaimen tilavuus = pituus x leveys x leveys /2). Kun kasvain koot saavutti noin 80-100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään (ajoneuvon sunitinibi KPT-330 matala tai korkea annos, tai KPT-330 alhainen ja sunitinibille) varten lääkehoitoon. Ajoneuvon ryhmä, ajoneuvon liuokset (Pluronic F-68 ja PVP K-29/32 seoksen ja kasviöljy) annettiin suun kautta (kaksi kertaa viikossa ja viisi kertaa viikossa vastaavasti, n = 8). Sillä sunitinibi ryhmä, ajoneuvon ratkaisu KPT-330, Pluronic F-68 ja PVP K-29/32 seoksen, ja sunitinibipitoisuutta (40 mg /kg) annettiin suun kautta (kaksi kertaa viikossa ja viisi kertaa viikossa vastaavasti, n = 8) [15]. Sillä KPT-330 pieni ryhmä, pieniä annoksia KPT-330 (7,5 mg /kg) ja kasviöljyä annettiin suun kautta (kaksi kertaa viikossa ja viisi kertaa viikossa vastaavasti n = 8). Sillä KPT-330 korkea ryhmä, suuri annos KPT-330 (15 mg /kg) ja kasviöljyä annettiin suun kautta (kaksi kertaa viikossa ja viisi kertaa viikossa vastaavasti n = 8). Sillä KPT-330 alhainen ja sunitinibi ryhmä, pieniä annoksia KPT-330 (7,5 mg /kg) ja sunitinibin (40 mg /kg) annettiin suun kautta (kaksi kertaa viikossa ja viisi kertaa viikossa vastaavasti n = 8). 25 vuorokauden kuluttua hoidon jälkeen eläimet tapettiin ja kasvaimen kudokset kerättiin 10% formaliinilla immunohistokemiaa analyysiä.

Tilastolliset menetelmät

in vitro-tutkimuksissa, vertailut keskiarvojen suoritettiin käyttäen riippumaton näytteitä t-testiä. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. In vivo tutkimuksessa, kasvaimen kasvua verrattiin pareittain kaikkien hoitojen käyttäen Tukey HSD menetelmällä.

Tulokset

vaimennus XPO1 mukaan KPT-330 estää RCC elinkelpoisuus läpi solusyklin pysähtymiseen ja induktio apoptoosin

ensimmäinen vahvisti, että KPT-330 heikennetty tasot XPO1 kahdessa RCC solulinjoissa samaa suuruusluokkaa (0,1 uM) sitä, joka on havaittu aiemmin kehitetty estävät tätä ydin- kuljettimen (Fig. 1A) [13]. Arvioidaan tehokkuuden XPO1 inhibition KPT-330 kohti solujen selviytymistä, olemme päättäneet, että solujen elinkelpoisuus vastauksena tähän estäjä oli ilmeistä pitoisuutena 0,1 uM RCC solulinjoissa mutta kertaluokkaa suuremman annoksen (10 uM) normaalissa munuaistiehyiden epiteelin (NHK) solut (Fig. 1 B), toteaminen mahdollisesti lisääntyneen XPO1 tasolle RCC kudoksissa verrattuna normaaliin munuaisen kudoksia, jotka olemme aikaisemmin osoittaneet, [13]. Alkaa tutkia mekanismeja KPT-330 aiheuttama vähentynyt solujen elinkelpoisuutta RCC, solusyklin ja apoptoosin analyysi tehtiin. Kun inkuboitiin KPT-330, molemmat RCC solulinjoja lisääntyi solujen G2 /M-vaiheen solusyklin yli 10% (kuvio. 1C), sekä apoptoottista solua osa noin 10% (kuvio . 1D ja Fig. S1), mikä viittaa siihen, että vähentynyt elinkelpoisuus RCC solujen KPT-330 kautta tapahtuvaa molemmat solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosin induktion.

RCC-solujen 786-O ja ACHN kasvatettiin -60% yhtymäkohdassa ja käsiteltiin KPT-330 ilmoitetuilla annoksilla 24 tuntia ja immunoblottaus suoritettiin spesifisillä vasta-aineilla (A). RCC ja NHK-soluja kasvatettiin -30% konfluenssiin, käsiteltiin KPT-330 ilmoitetuilla annoksilla 72 tuntia, ja MTT-analyysit suoritettiin (B). Solusyklin analyysi (C) ja anneksiini V-määrityksellä (D) suoritettiin sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubaation DMSO (jatkuu) tai KPT-330 (1 uM). * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman.

XPO1 esto rajoittuu p21 tumaan RCC-soluissa, mutta ei normaalissa munuaisen epiteelisolulinja

Lisääntynyt sytosolin p21, jonka on osoitettu estävän apoptoosin [5] ja siten mahdollisesti estää kasvaimen valvontaa, on osoitus huono ennuste RCC [9]. Tästä syystä ja ottaen huomioon tunnetun kiinteistön ydinvoiman p21 lieventävien solusyklin etenemisen, kysyimme, onko ydinvoiman p21 vaaditaan KPT-330 aiheuttaa havaitut vaikutukset RCC soluissa. Kun visualisoidaan immunofluoresenssilla sytokemian, p21 osoitettiin rajoittuu pääasiassa tumaan jälkeen KPT-330 kohtelu sekä RCC solulinjoissa (Fig. 2A). Yhdenmukainen solusykliä koskevat tiedot, KPT-330 ei muuttanut lokalisoinnin p21 NHK soluissa (kuvio. 2A); Tämä saattaa selittää epäonnistumisen KPT-330 laskevan selviytyminen normaaleissa soluissa ja on merkitystä tulevaisuuden kliinisiä käännös näiden havaintojen (

vide infra

). Mielenkiintoista, p21-tasot täydennettiin KPT-330 RCC soluissa (Kuva. 2B), mikä viittaa siihen, että p21 ei ollut ainoastaan ​​rajoittunut tumassa mukaan KPT-330, mutta osoitti myös kohonneeseen, todennäköisesti välittämisessä havaittu G2 /M solusyklin pysähtymiseen ( ks. 1C ja [16]).

RCC-solujen 786-O ja ACHN kasvatettiin -60% konfluenssiin ja käsiteltiin KPT-330 ilmoitetuilla annoksilla 24 tuntia. Immunofluoresenssi suoritettiin konfokaalimikroskopialla (20x), ja solujen lukumäärä, joissa p21 on pääasiassa tumassa laskettiin kolmessa satunnaisesti valituilla aloilla ja jaettuna solujen kokonaismäärästä (A). Immunoblottaus suoritettiin spesifisillä vasta-aineilla (B). Sininen, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

siRNA esto XPO1 lisääntynyt ydinvoiman p21 RCC soluissa

spesifisyyden osoittamiseksi KPT-330 tasoilla ja lokalisointi p21, ja että nämä vaikutukset ovat koska XPO1 inhibition, RCC (786-O ja ACHN) solut transfektoitiin joko siRNA spesifinen XPO1 tai sekoitetun sekvenssin ohjaus siRNA. Molemmat solulinjat osoittivat alentuneesta XPO1 mukana kokonaismäärän lisääntymiseen p21 upon XPO1 taintumisen (Fig. 3A), jossa immunofluoresenssivärjäyksen osoittavat, että p21 rajoittuu pääasiassa tumaan näissä olosuhteissa (Fig. 3B), samanlainen kuin mitä havaittiin jossa KPT-330 (kts. 2B). Näin ollen, vaikutusta KPT-330 p21 johtui nimenomaan XPO1 vaimennus.

RCC (786-O ja ACHN) soluja kasvatettiin -60% konfluenssiin ja transfektoitiin sekoitetun sekvenssin valvontaa tai XPO1- erityiset siRNA 48 tuntia. Immunoblottaus suoritettiin spesifisillä vasta-aineilla (A) ja immunofluoresenssilla tehtiin konfokaalimikroskopialla (20x) (B). Solujen lukumäärä, joissa p21 on pääasiassa tumassa laskettiin kolmessa satunnaisesti valituilla aloilla ja jaettuna solujen kokonaismäärästä. Sininen, nucleus (DAPI); Green, p21. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

Oraalisesti annetut KPT-330 heikennetty kasvaimen kasvua, liittyy lisääntynyt ydinvoiman p21

Ennen kääntää tämän työn sängyn, tehoa KPT- 330 RCC hiiren ksenograftimallissa arvioitiin. Kun ihon alle istuttaa kasvaimia tuli käsin kosketeltava, hiiriä hoidettiin sunitinibilla (40 mg /kg), KPT-330 pieni (7,5 mg /kg) ja korkea (15 mg /kg) annoksina, yhdistelmä sunitinibin ja KPT-330 pieni annos, tai ajoneuvo (joka oli sama KPT-330 ja sunitinibin). Sunitinibi hyödynnettiin sekä huumeiden valvonta ja mahdollisena yhdistelmähoidon osakas vuodesta sunitinibin on ensimmäinen rivi hoitoa RCC [17]. Sekä KPT-330 suuren annoksen ja yhdistelmä sunitinibin ja KPT-330 pienen annoksen esti RCC kasvua merkittävästi verrattuna ajoneuvon (Fig. 4), mikä viittaa siihen, että KPT-330 voidaan käyttää yhtä hoitoa ja on myös hyödyllistä, kun yhdistetään nykyinen ensimmäinen rivi terapeuttinen sunitinibi.

5 x 10

5 ACHN solut injektoidaan subkutaani- sen kylkeen alueelle. Kun kasvaimet olivat käsin kosketeltava, hiiriä hoidettiin ajoneuvo, sunitinibipitoisuutta (40 mg /kg), KPT-330 pieni (7,5 mg /kg), KPT-330 korkea (15 mg /kg) tai sunitinibin ja KPT-330 alhainen 25 päivää kuten edellä materiaalit ja menetelmät. Kasvaimen kasvu seurattiin kaliiperin (kasvaimen tilavuus = pituus x leveys x leveys /2) ja kasvaimen kasvu (kasvaimen tilavuus päivänä X /kasvaimen päivänä 0) laskettiin. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

Validoida paikan tavoite vaikutuksista KPT-330, Ksenograftikudoksista käsiteltiin lopettamisen jälkeen immunohistokemiaa analyysiä. Verrattuna kontrolliin Ksenograftikudoksista, KPT-330 (korkea annos) hoidetuista eläimistä osoitti kasvua p21 tumavärjäystä, lisääntymistä apoptoosin merkki Apoptag värjäys, ja lasku värjäytyminen leviämisen markkeri Ki67 (Fig. 5), kaikki vastaa meidän in vitro huomautuksia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että KPT-330 vaimentaa RCC kasvua estämällä solujen kasvua ja apoptoosin induktio RCC ksenograftimallia, ja että sääntely p21 lokalisointi on keskeinen rooli tehoa KPT-330.

jälkeen tekemisestä kuvatun kokeen kuvassa. 6, Ksenograftikudoksista kerättiin ja prosessoitiin immunohistokemia, jossa on esitetty vasta-aineiden, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Bar = 20 um.

KPT-330 resistenttien solut olivat herkkiä FDA hyväksyi terapeuttisia RCC

Koska esiintyy usein kemoterapian resistenssin RCC hoidetuilla potilailla kohdistettuja hoitomuotoja, se on kriittinen tarjota vaihtoehtoisia terapeuttisia vaihtoehtoja niille, jotka voivat kehittyä vastustuskykyä XPO1 eston kanssa ehdotetun strategian tässä tutkimuksessa. Arvioimaan mekanismi, jonka RCC solut tulevat vastustuskykyisiksi KPT-330, keskityimme VHL-mut 786-O-solut, koska VHL mutaatio on nähtävissä noin 90%: RCC potilaista [18]. 786-O-soluja aluksi inkuboitiin alhainen (50 nM) pitoisuutta KPT-330, ja sarjoittain siirtyi median kasvavien pitoisuuksien kanssa KPT-330 yli kuuden kuukauden ajan. Solut, jotka alkoi kasvaa 1 uM KPT-330 määriteltiin ”KPT-330 kestävä”; parentaalisesta 786-O-solut (P), yhteensä kaksi erillistä resistenttejä solulinjoja perustettiin (R1 ja R2). Kuten on määritelty, R1 ja R2 solut olivat vähemmän herkkiä KPT-330 kuin P-soluissa, kun käsiteltiin erilaisilla annoksilla KPT-330 (Fig. 6A), jossa ei ole vaimennusta XPO1 (Fig. 6B). Mielenkiintoista, lokalisointi p21 ei muuttunut KPT-330 resistentit solut (Fig. 6C), mikä edelleen tukee tärkeyttä tämän proteiinin KPT-330 signalointi.

KPT-330 kestävä 786-O (R1 ja R2) solut perustettu, kuten on kuvattu tekstissä, ja nämä sekä vanhempien (P) soluja käsiteltiin KPT-330 osoitetussa annoksina 72 tuntia, jonka jälkeen MTT-analyysit suoritettiin (A). R1, R2 ja P-soluja käsiteltiin KPT-330: ssa 24 tuntia sitten immunoblottauksella ja immunofluoresenssilla tehtiin. Solujen lukumäärä, joissa p21 pääasiassa tumassa laskettiin kolmessa satunnaisesti valituilla aloilla ja jaetaan solujen kokonaismäärä (Blue, nucleus (DAPI), Green, p21) (B). * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

arvioitava mahdollisuudet pelastaa hoitoja, selviytyminen resistenttien solujen arvioitiin tavanomaisilla kohdennettuja tekijöille. Kun KPT-330 resistenttejä soluja käsiteltiin kunkin nykyisin hyväksytty RCC estäjät (sunitinibia ja sorafenibia) ja mTOR estäjät (everolimuusi ja temsirolimuusin), R1 ja R2 solut säilyttivät herkkyytensä samalla tavalla P-soluissa (kuvio. 7), mikä tarkoittaa, että tavanomainen suunnattu terapeuttisia voitaisiin hyödyntää toisen linjan hoito, jos potilaille kehittyy vastustuskykyä KPT-330.

KPT-330 kestävä 786-O (R1 ja R2) ja vanhempien (P) soluja käsiteltiin KPT-330 osoitetussa annokset 72 tuntia, jonka jälkeen MTT-testit suoritettiin. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

Keskustelu

Uusi hoitomuotoja kehittynyt RCC on hyväksynyt FDA lähes joka vuosi vuodesta kynnyksellä sorafenibia, ensimmäinen suunnattu RCC terapeuttinen. Kuitenkin, vaikka nämä lääkkeet laajennettu PFS niille metastasoitunutta RCC on vain yhdestä kahteen vuosina johtuen lääkeresistenssin kehittymisen; tilannetta potilailla, joilla on edennyt sairaus tehdään synkempi se, että on olemassa, mutta rajallinen ohjelmistoon saatavilla terapeuttisten kohteiden (tällä hetkellä vain kinaasien ja mTOR) [4]. Siksi on ratkaisevan tärkeää tunnistaa uusia tavoitteita RCC jotka eroavat nykyisin käytössä. Valossa aikaisempien tutkimusten osoittavat, että XPO1 estäjät on terapeuttinen vaikutus RCC in vitro ja in vivo [13], tässä tutkimuksessa arvioitiin tehoa ja mekanismi KPT-330 XPO1 estäjä, joka on tällä hetkellä vaiheen 1 tutkimuksissa sen määrittämiseksi, mahdollista kliinistä käyttöä KPT-330 Advanced RCC. Todellakin, tulokset useiden meneillään olevasta vaiheen I /II kliiniset kokeet KPT-330 (selinexor; clinicaltrials.gov) viittaavat siihen, että suun KPT-330 on selvä syövän vastaista aktiivisuutta hyväksyttävällä siedettävyys useiden kiinteiden ja hematologisten maligniteettien, mutta on niukasti tietoa tämän agentti RCC eikä mekanistista tietoja.

Sytosoliset p21 on merkki huonon ennusteen RCC, ja se voitaisiin mahdollisesti käyttää sellaisenaan markkerina muiden syöpien, kuten rintasyövän, että on ominaista by yli-ilmentynyt soluliman p21 [10]. Molemmat inkuboitaessa

in vitro

useita RCC solulinjoissa ja kun suun kautta

in vivo

ihmisen hiiren RCC ksenografti, KPT-330 lisääntynyt ydinvoiman p21 kautta spesifinen esto XPO1, jolloin tuloksena on merkittävä lasku RCC solujen elinkelpoisuuden läpi solusyklin pysähtymiseen (ja proliferaation esto in vivo) ja apoptoosin induktio. Yllättävää oli minimaalinen vaikutus KPT-330 normaalein munuaistiehyiden epiteelin solujen elinkelpoisuuden tai p21 lokalisointi näissä soluissa, toteamus joka tukee todennäköisyys minimaalinen haitallisia vaikutuksia munuaisten (sekä muut urut) funktio potilailla, jotka annetaan tämän huume. Kun tumassa, p21 pidätykset solusyklin sitomalla sykliini /CKD komplekseja kaikissa vaiheissa, kun taas kun sytosoliin, p21 inhiboi apoptoosia vaikuttamalla proapoptoottisten proteiineja kuten pro-kaspaasi 3 ja ASK [5]. Niinpä meidän tulokset osoittavat, että ydinvoiman p21 osallistuu mekanismi, jonka KPT-330 vaikuttaa RCC soluja, hypoteesin tukee se seikka, että NHK soluja, joiden p21 lokalisointi ei vaikuttanut KPT-330 eivät olleet niin herkkiä KPT-330 kuin RCC solut ja KPT-330 resistentit solut eivät paikallistaa p21 tumaan.

moniin syöpiin, tumasta proteiinien tehostetun aikana taudin etenemisen ja voi itse asiassa edistää prosessia lääkeresistenssin [19]. Esimerkiksi korkeampia XPO1 ilmaisun korreloivat positiivisesti asteen etenemiseen sekä lisääntynyt leviämisen hintojamme gliooman [20], haimasyöpä [21], ja kohdunkaulan syöpä [22]. Perustuu tietoihin, on todennäköistä, että tumasta p21 by XPO1 on voimakkaampi RCC kuin NHK soluissa sytosolin p21 kasvaimissa on lisääntynyt, etenkin niissä RCC tapauksissa huonompi ennusteet [9]. Tämä havainto (vähemmän vaikutuksia XPO1 esto normaaleissa soluissa kuin syöpäsoluja) on yhdenmukainen muiden julkaistujen tutkimusten kanssa SINE osoittavat, että SINE tavoite sairaat solut säästäen normaalit solut [12]. Lisäksi meidän havainnot että KPT-330 resistenttien solujen säilyttivät herkkyytensä kaikki nykyiset FDA hyväksyi kohdennettuja terapeuttisia kehittynyt RCC (sunitinibi, sorafenibi everolimuusi, ja temsirolimuusi) ehdottaa, että potilailla, jotka eivät KPT-330 tai joille vastus kehittyy, voisi silti vastata näihin vanhempien lääkkeiden [4].

Johtopäätökset

Tulokset kuvassa osoittavat, että XPO1 esto KPT-330 vaimentaa RCC elinkelpoisuus läpi solusyklin pysähtymisen sekä apoptoosin induktion ja että kasvoivat ydinvoiman p21 by XPO1 esto on tärkeä rooli tehokkuuden KPT-330 RCC. Osoitamme, että KPT-330 voimistaa antituumorivaikutuksen Sunitinibin johtaa täydelliseen inhibitioon RCC kasvaimen kasvua in vivo tämän yhdistelmän kanssa. Lisäksi meidän tiedot tukevat todennäköisyyttä, että potilaat resistenttejä KPT-330 vastaa vanhempien kohdennettuja terapeuttisia. Koska kehittynyt RCC on huono ennuste jopa kohdistettuja hoitomuotoja, työmme esittelee KPT-330 uutena terapeuttinen RCC, jota voidaan nopeasti siirtää osaksi kliinisen keskustelussa tehon arvioimiseksi yksinään tai yhdistelmänä hoitoa muilla RCC terapeuttisten.

tukeminen Information

Kuva S1.

KPT-330 indusoi apoptoosin RCC soluissa. RCC-solujen 786-O ja ACHN kasvatettiin -60% konfluenssiin. Anneksiini V koe suoritettiin sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubaation DMSO tai KPT-330 (1 uM), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Avainnuksen näkyy.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0113867.s001

(PPTX) B