Krooninen sairaus

tiivistelmä

kudoshypoksia indusoi uudelleenohjelmoinnin solujen aineenvaihduntaa ja voi johtaa normaalin solun transformaatio ja syövän etenemistä. Hypoksia indusoituvat kerroin 1-alfa (HIF-1α), avain transkriptiotekijä, on tärkeä rooli mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää taustalla sääntelyn signalointireitille mahasyövän käyttäen mahasyövän kudosnäytteet. Integrointi geeniekspressioprofiili ja transkription säätelyelementin tietokanta (TRED) pyrittiin tunnistamaan HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STST3 ← STAT1 geeni reittejä ja niiden säänneltyjen geenit. Tiedot osoittivat, että oli 82 ilmentyvät eri geenejä, jotka voitaisiin säännellä näiden viiden transkriptiotekijöitä mahasyövässä kudoksissa ja nämä geenit muodostivat 95 asetusta tilat, joista seitsemän geenit (MMP-1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, ja TFF3 ) olivat navan molekyylejä, joita säädellään vähintään kaksi näistä viidestä transkriptiotekijöiden samanaikaisesti ja liittyi hypoksia, tulehdus, ja immuunijärjestelmän häiriö. Real-Time PCR ja western blot osoitti lisääminen HIF-1α mRNA ja proteiini tasoilla sekä TIMP1, TFF3 mRNA-tasojen mahasyövän kudoksissa. Tiedot ovat ensimmäinen tutkimus osoittaa HIF-1α-säänneltyjen transkriptiotekijöiden ja niitä vastaavat verkon geenien mahasyövässä. Lisätutkimuksia suuremmalla otoskoko ja toimivampia kokeita tarvitaan vahvistaa nämä tiedot ja sitten kliinistä biomarkkereiden löytö ja hoitostrategia mahasyövän.

Citation: Wang J, Ni Z, Duan Z, Wang G Li F (2014) Altered Expression of Hypoksia-indusoituva Factor-1α (HIF-1α) ja sen säätelygeenit mahasyövän kudoksia. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10,1371 /journal.pone.0099835

Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia National Natural Science Foundation of China (# 81320108025 ja # 81271897), Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (# 20110061120093), Kiina Postdoctoral Science Foundation (# 20110491311 ja # 2012T50285), Foundation of Jilin maakunnan Health Department (# 2011Z049), Foundation Jilinin maakunnassa Science and Technology osasto (# 20130522013JH ja # 20140414048GH) ja Norman Bethune Program Jilin University (# 2012219). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa, joka vaikuttaa noin 800000 henkilöä ja 65000 syöpään liittyvien kuolemaa vuodessa [1]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että poikkeava solujen aineenvaihduntaan on keskeinen aikana kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemistä [2], [3]. Erityisesti, kyseeseen energia-aineenvaihduntaan on sisällytetty nousevana tunnusmerkki syövän [4] ja epänormaalin energia-aineenvaihduntaa on havaittavissa eri ihmisen syövän, eli syöpäsolu ohjelmoida niiden aineenvaihduntaa kasvu Glykolyysivaiheen sijasta mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation tuottamaan solun energia [5]. Kudoshypoksia on keskeinen liikkeellepaneva voima, joka johtaa solujen aineenvaihduntaa uudelleen ohjelmointi [6]. Hypoksiaolosuhteissa ympäristö, solu Glykolyysivaiheen indusoituu ja johtaa lisätä solujen lisääntymistä ja puolestaan ​​muodostaa noidankehä hypoksian leviämisen kasvava hypoksia, jotka edistävät solujen transformaatio ja syövän etenemisen [7]. Geeni- tasolla, hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) on ensisijainen happiherkkien transkription aktivaattori ja auttaa solujen mukauttaa alhaisen hapen paine (hypoksia) [8]. HIF-1 koostuu konstitutiivisesti β-alayksikön ja hypoksia-indusoituva α-alayksikköä. Jälkimmäinen (HIF-1α) on vain stabiloidaan hypoksisissa olosuhteissa ja säätelee HIF-1 transkriptionaalista aktiivisuutta [9]. Tähän mennessä HIF-1α on osoitettu aktivoivan useita kohdegeenien, joissa on ensiarvoisen tärkeää näkökohtaa syövän biologian, kuten erytropoieesin angiogeneesi, glukoosin aineenvaihduntaa, solujen lisääntymistä /eloonjäämisen ja apoptoosin [10]. HIF-1α voivat olla vuorovaikutuksessa monien muiden syöpään liittyvien transkriptiotekijöiden (TF: t) ja muodostavat kompleksin TF-geenin transkription sääntelyverkon aikana syövän kehittymisen ja etenemisen. Siten käsitys ei yllättäen esiin, että syöpäsolut ovat ero ja patologinen transkription kuviot verrattuna normaaleihin soluihin [11]. Aiemmat tutkimukset osoittivat säätely ylöspäin HIF-1α ilmentymisen mahasyövässä kudosten ja solujen [12], [13], kun taas juuri taustalla sääntelymekanismeja ovat vielä määrittelemättä. Näin ollen tässä tutkimuksessa käytimme Affymatrix eksoni Arrays tunnistamaan ero geeniekspressioprofiili mahasyövän kudoksissa, ja suorittaa reaaliajassa PCR ja western blot -analyysit tietoja vahvistettaessa. Olemme edelleen rakennettu poikkeavasta TF-geenin transkription sääntelyyn liittyvän verkon HIF-1α ilmentymistä integroimalla transkription säätelyelementin tietokanta (TRED) [14] ja geeniekspressioprofiili avulla cytoscape ohjelmistoa. Tämä tutkimus voi tunnistaa järjestelmällisesti näyttely liittyy kopioinnin säätely tilat liittyvät hypoksia ja antaa oivaltavia tiedot tulevaa biomarkkereiden löytö ja uusi hoitostrategia mahasyövän.

Tulokset ja keskustelu

profilointi erilaisesti ilmaistuna geenien mahasyövässä verrattuna normaaleihin kudoksiin

tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien mahasyövän, käytimme Affymatrix eksoni Arrays jotka sisältävät 17800 ihmisen geenejä profiloida viisi paria mahasyövän ja normaaleissa kudoksissa (potilaiden tiedot olivat osoittivat taulukossa S1). Löysimme yhteensä 2546 eri tavoin ilmaistuna geenejä, joista 2422 oli säädelty ja 124 olivat alassäädetty (taulukko S2). Erityisesti, HIF-1α oli merkittävästi ilmentyy voimakkaasti mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa (P 0,01). Olemme edelleen vahvisti microarray data suorittamalla kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR ja western blot toisessa 10 paria mahasyövän vs. normaaleissa kudoksissa (potilaiden tiedot olivat osoitti taulukossa S1). HIF-1α mRNA ilmaisun osoitti 2,55 ± 0,56 taittaa sääntelyä kasvainkudoksissa vs. terveisiin (p 0,01); western blot-analyysi osoitti selvästi toisistaan ​​suhteellinen proteiinin tiheys HIF-1α syövän kudoksissa (0,41 ± 0,24) vs. terveisiin (0,17 ± 0,15), jossa p 0,01, tuloksia voidaan nähdä kuva 1 ja kuva S1. Itse asiassa edellinen tutkimus osoitti, että HIF-1α oli läsnä kaikissa ihmisen ja hiiren kudoksissa hypoksiaolosuhteissa [15] ja mahasyövän kudoksissa [12], [13], yliekspressio joka liittyi huonoon ennusteeseen mahasyövän potilaista [12 ], [13]. Niinpä analysoitiin edelleen HIF-1α yli-ilmentyminen liittyvät TF: ien ja niiden mahdolliset kohdistaminen geenien mahasyövässä kudoksissa.

a ja b, Detection of HIF-1α, TIMP1 ja TFF3 mRNA: n ilmentymisen mahasyövän vs. normaaleissa kudoksissa PCR: ää ja qRT-PCR. Tasot HIF-1α, TIMP1, TFF3 mRNA oli 2,55 ± 0,56, 1,58 ± 0,25, 2,16 ± 0,59 taittuu säädellään ylöspäin tuumorikudoksissa vastaavasti verrattiin terveisiin. * P 0,01. c ja d, Western blot-analyysi HIF-1α-proteiinia. Tuumorikudoksissa ilmaistuna korkeamman tason HIF-1α-proteiinia verrattuna terveisiin [p 0,01 (d). N, normaali kudosten C, syöpä kudokset (c)].

tunnistaminen HIF-1α yli-ilmentymisen liittyvä TF: ien ja niiden mahdollisia kohdistaminen geenien mahasyövässä kudoksissa

tunnistamiseksi HIF-1α yli-ilmentymisen liittyvä TF: t ja niiden mahdollisten kohdistaminen geenejä, transkription säätelyelementin tietokanta (TRED) tarjoaa ainutlaatuisen työkalu analysoida sekä

cis

– ja

trans

– säätelyelementtejä nisäkkäillä, joka auttaa ymmärtämään paremmin kattavan geeni asetusten ja sääntelyn verkostoja erityisesti tasolla transkription määräyksiä. Siten käyttäen integraatio geeniekspressioprofiili ja sääntelyn tietoja TRED, analysoimme HIF-1α ja muut neljä HIF-1α liittyvien transkriptiotekijöiden (eli NFκB1, BRCA1, STAT3 ja STAT1), jotka olivat kaikki säädellään ylöspäin mahasyövän kudosten ja havaitsi, että ne muodostivat nämä TF-geeni säätelyverkkojen 82 geenejä, 79 joista säädelty ja 3 alassäädetty (taulukko S3). Kuvio 2 osoitti bi-klustereita analyysi Näiden 82 ilmentyvät eri geenien mahasyövässä kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin.

Jokainen rivi edustaa geeniä ja kukin sarake edustaa näyte, ”C” sarakkeet alareunassa edustavat syöpä kudoksia, ”N” saraketta edustavat normaaleissa kudoksissa. 1 Punainen korkean ilmentymisen syövän verrattuna normaaliin ja 1 vihreä heikkoa ilmentymistä syövän verrattuna terveisiin.

Tämän jälkeen tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID ) [16] sovellettiin toiminnallinen merkinnästä näistä 82 erilaisesti ilmaisi geenejä. Olemme lueteltu alkuun neljä sairaus luokkia, jotka liittyvät näihin 82 poikkeavien geenien (taulukko 1) ja totesi, että merkittävin luokka on Cancer 29 geenien seurasi Infection (18 geenit), Cardiovascular (25 geenit) ja Immuunijärjestelmän sairaus (26 geenit) .

tunnistaminen mahalaukun syöpään liittyvien transkriptiotekijä-geeni (TF-geeni) verkon

Perustuu transkription säätelyelementin tietokantaan ja geeniekspressioprofiili rakensimme transkriptionaalinen sääntelyverkon liittyvä ja HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STST3 ← STAT1 näillä 82 geenien mahasyövässä kudoksissa. Tuloksemme osoittivat, että nämä 82 geenit voivat muodostaa 95 erilaista sääntelyä tiloissa (kuvio 3A) ja yksityiskohtainen TF-geenisäätelyn tilat on listattu taulukossa S4.

Red piireissä A ovat jopa geenien, kun taas vihreä ympyrät ovat alas geenien ja keltaisten kolmioiden nämä viisi näppäintä TF: iä. B, Lyhyt puitteissa tämän verkon. Ympyrät ovat ryhmittyneet geenit ja geenien lukumäärän näkyy sisälle. Suunta nuoli on lähteeltä Target.

Jotta voidaan paremmin ymmärtää sääntelyverkon, rakensimme lyhyt verkon puitteissa (kuva 3B). Transcription factors HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STST3 ← STAT1 pystyivät muodostamaan puitteissa sääntelyverkon jolla säädetään suoraan 21, 45, 2, 12, ja 10 geenit, vastaavasti. NFκB1 oli suoraan säätelee HIF-1α ja se oli totta, että suurin osa sääntely-verkon suoraan säätelee HIF-1α (21/82) ja NFκB1 (45/82), avain sääntelyviranomaisten liittyvät hypoksia ja tulehdusta syövissä [ ,,,0],17]. Mahalaukun syöpä on ominaista kudoshypoksia ja krooninen tulehdus (kuten

Helicobacter

pylori). Meidän nykyisessä tutkimuksessa, HIF-1α oli merkitsevästi säädellään ylöspäin mahasyövän verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa (P 0,01). Lisäksi nykyinen tiedot osoittivat, että ilmentyminen on yli 20 geeniä, jotka ovat suoraan säätelee HIF-1α muutettiin mahasyövän kudoksissa, mukaan lukien NFκB1, avain säädin molekyylin tulehdusta ja syövän [18] ja kohdentamista NFKB voisi olla hyödyllistä kemopreventiossa erilaisten ihmisen syöpien [19].

alavirtaan sääntely reitin verkko säätelee pääasiassa STAT3 (12/82) ja STAT1 (10/82), jäsenet signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription perhe ( STAT). STAT signalointi Jak on kanoninen polku säädellä geenejä, jotka ovat mukana monissa fysiologisissa prosesseissa siirtämällä signaaleja solukalvon tumaan [20]. Säännellä paracrine sytokiinisignaloinnin ja muutoksia metastaasien, STST3 kykenee sekä aiheuttamaan kasvaimen sisäiseen ja ulkoiseen vaikutukset [21]. Targeting Jak-STAT3 signalointireitistä pidetään mahdollisena terapeuttinen strategia, varsinkin kun otetaan kasvaimen tulehduksen ja immuniteetin [21]. Jatkuva vapautuminen geenien jatkuvasti aktivoitu NFKB ja STST3 kasvaimen mikroympäristössä on kaksi ratkaisevan tärkeää näkökohtaa tulehduksen ja pahanlaatuisten etenemisen [17]. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu osuuskunta vaikutus STAT3 ja HIF-1α aktivoituessa geenien hypoksiaolosuhteissa ympäristön munuaissolusyövässä soluihin [22]. Erityinen mekanismi Jak-STAT aktivointi, erityisesti STST3 mahasyövän Vielä on selvitettävä, vaikka nykyinen tiedot osoittivat merkittävästi suuremman JAK1, STAT3 ja STAT1 ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa.

Toimintoanalyysi navan -genes

tietty transkriptiotekijä voi säädellä kymmeniä, ellei satoja, kohdegeenien, kun taas yksi geeni voitaisiin säätelevät useat eri TF: iä geenien säätelyverkkojen. Niinpä oletetaan, että navan geenit on säätelevät useat transkriptiotekijät samanaikaisesti mahasyövän, joka voi olla synergistisiä vaikutuksia ihmisten syövän synnyn. Nykyisessä tutkimuksessa, tunnistimme seitsemän geenien (kuten MMP-1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, ja TFF3), joka voidaan suoraan säädellä ainakin kaksi keskeistä transkriptiotekijät, useimmat niistä ovat napa solmuja, jotka yhdistävät kanssa NFκB1 ja STATs reitti (kuvio 4). Koska transkriptiotekijät säätelevät kohdegeenien kautta transkriptio-riippui tavalla moduloida niiden mRNA: n ekspression, tässä suoritimme qRT-PCR ekspression tutkimiseksi TIMP1 ja TFF3 mRNA kaksi kohdegeenien HIF-a suhteellinen ekspressio TIMP1 ja TFF3 mRNA 1,58 ± 0,25 ja 2,16 ± 0,59 taittaa-säädellään kymmenen kasvainta vastaan ​​normaaleissa kudoksissa, vastaavasti (kuvio 1).

Ellipses ovat napa geenejä, jotka säätelevät transkriptiotekijät, kolmiot ovat nämä viisi transkriptiotekijöitä TF-geenin sääntelyverkon.

lisäksi perheen matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) on tärkein soluväliaineen remodeling entsyymejä, aktiivisuus, joka on tulosta vuorovaikutuksesta kasvainsolujen ja kasvaimen mikroympäristössä ja on tiukasti kontrolloitua jonka transkriptionaalista aktivaatiota, kuten monimutkainen proteolyyttinen aktivaatioputouksen sekä endogeenisen järjestelmä kudoksen metalloproteinaasien estäjiä (TIMP: t) [23]. MMP-1 on raportoitu olevan mukana mahalaukun syöpäsoluinvaasiota [24]. Lisäksi TLR2 on jäsen Toll-kaltainen reseptoreihin ja sillä on keskeinen rooli taudinaiheuttajan tunnistaminen ja aktivointi synnynnäisen immuniteetin aktivoimalla NFKB. TLR2 voivat toimia initiaattorina antaa tartunnan tai vaurioituneiden solujen toisen mahdollisuuden kehittyä syöpäsoluihin ja kontrolloimaton solujen lisääntymistä [25]. Samaan aikaan Fc-fragmentti IgG, matalan affiniteetin IIIa-reseptorin (FCGR3A, joka tunnetaan myös CD16a) kuuluu Fc-gamma-reseptorin perhe (FCGR).

FCGR3A

polymorfismi liittyy alttius tietyille autoimmuunisairauksien ja FCGR3A on tärkeä rooli poistamalla immuunikompleksien kehosta ja osallistuu myös sytotoksisia vasteita kasvainsoluja vastaan ​​ja infektoivia aineita [26]. Interferoni säätelytekijän (IRF) -1 on myös immuuni aktiivisen molekyylin ja tulehduksellinen prosessi säädin, aktivointi IRF-1: n ja NF-KB: n havaittiin samanaikaisesti aktivoida melanooma [27]. Lisäksi, polymorfismia apilatekijän 3 (

TFF3

) promoottorin liittyy mahasyövän herkkyys [28] ja TFF3 on säätelevät sekä HIF-1 ja NFKB [29]. Yliekspressio TFF3 oli itsenäinen indikaattori eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista [30]. Jälleen FAS (tunnetaan myös TNFSF6 /CD95 /APO-1) kuuluu tuumorinekroositekijän reseptorin superperheen (jäsen 6) ja on keskeinen rooli säätelyssä ulkoisella apoptoosireitin [31]. Alennettu FAS ilmentyminen liittyy lisääntynyt riski syövän downregulation FAS-välitteisen apoptoosin [32]. Kuitenkin nykyinen data osoitti ristiriitaisia ​​korkean ekspressiotason FAS mahasyövän kudoksissa ilmoitus lisätutkimusta tarvitaan vahvistaa sitä. Kaiken kaikkiaan muuttunut näiden geenien ilmentymistä mahasyövän kudoksissa on vielä todentaminen biomarkkereina mahasyövän diagnoosin ja ennusteen. Nämä geenit ovat ratkaisevia tulehdusta ja immuunijärjestelmän liittyvä tauti, joka voi lisäksi osoittaa, miten tärkeää on

Helicobacter

pylori mahasyövän kehittymistä ja etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue yksilöt

yhteensä 15 mahasyöpäpotilaista rekrytoitiin syövän ja kaukainen normaalia kudosta kokoelma The First sairaalan Jilin University, Changchun, Kiina. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea College of Basic Medical Sciences, Jilin University, kutakin potilasta suostunut kirjallisesti tietoisen suostumuksen muodossa. Aineisto analysoitiin anonyymisti. Kaikki kudokset otettiin leikkauksen huoneeseen ja snap-jäädytetään ja säilytetään nestemäisessä typessä 10 minuutin kuluttua resektio. TNM ja histologinen luokitus suoritettiin mukaan Maailman terveysjärjestön (WHO) kriteerit.

RNA: n eristys ja mikrosirujen hybridisaatio ja skannaus

Kudos-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, CA, USA) ja puhdistettiin edelleen käyttämällä RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus määritettiin sitten käyttämällä UV2800 UV-spektrofotometri (UNIC, NY, USA) ja A260 /A280-suhde 1.8~2.0 ja RNA-pitoisuus oli vaihteli välillä 100 ng /ul ja 1 ug /ul.

GeneChip Human eksonin 1.0 ST (Affymetrix, CA, USA) käytettiin profiloida ilmennetty eri geenien mahasyövän kudoksissa vs. terveisiin protokollan mukaisesti toimittamat Affymetrix (P /N 900223). Lyhyesti, 1 ug RNA: ta templaattina käytettiin käänteisesti cDNArksi ja cDNA näytteet digestoitiin osaksi cDNA-fragmenttien endonukleaaseilla ja sitten merkitty DNA leimausreagenssi tarjoamia Affymetrix. Tämän jälkeen leimattu cDNA näytteitä käytettiin koettimina hybridisoitua array pelimerkkejä inkuboimalla 45 ° C: ssa ja pyöritettiin 60 rpm: n nopeudella 17 tunnin ajan. Sen jälkeen pestään ja värjätään hakkeen hybridisaation jälkeen, hake skannattiin käyttäen GeneChip- Scanner3000 kanssa GeneChip- Operating Software (GCOS). Kaikki välineet, sirut, ja reagenssit olivat kaikki ostettu Affymetrix.

Analyysi ilmentyvät eri geenien syöpää vastaan ​​normaaleissa kudoksissa

GeneChip- Operating Software levitettiin analysoida pelimerkkejä ja purkaa raakakuvia signaali data. GEO aineistot on NCBI määrä Tutkimuksemme on: GSE56807. Raaka-signaalin data sen jälkeen toi ja analysoitu Limma algoritmi tunnistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Lineaarinen mallien ja empiiriset Bayes menetelmät olivat tietojen analysointiin. Tämä esti geeni, jolla on hyvin pieni poimu muutos tuomitaan kun ilmennetty eri vain takia vahingossa pienen jäljellä SD. Tuloksena P-arvot korjattiin käyttäen BH FDR algoritmia. Geenit katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri, jos molemmat FDR arvot oli 0,05 (ohjaamalla odotettu FDR korkeintaan 5%) ja geeniekspressiota osoittivat vähintään 2-kertainen muuttuu syövän ja niiden vastaavat normaalit kudokset kanssa Log2FC 1 tai log2FC -1, P-arvo 0.05.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR

qRT-PCR-analyysi, alle 5 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi, 1

st säikeen cDNA Synthsis Kit (Takara , Dalian, Kiina); ilmentymisen mRNA ihmisen HIF-1α, TIMP1 ja TFF3 tutkittiin qRT-PCR: llä SYBR Esiseos Ex Taq (Takara, Dalian, Kiina) ja Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System. Suhteellinen ilmentyminen mRNA normalisoitiin p-aktiinin ilmentymistä vertailevalla Ct menetelmällä (2

-ΔΔCt, ACt = Ct

kohde-Ct

β-aktiini, ΔΔCt = ACt

kasvaimeen ACt

normaali). Kaikki alukkeet suunniteltiin Primer Premier 6 Ohjelmisto primeerisekvenssit monistamista lueteltiin taulukossa 2. Tiedot qRT-PCR analysoitiin GraphPad Prism versio 5.0, erot ryhmien arvioitiin tilastollisesti näyte yksisuuntaista Studentin t-testi p arvo 0,05 pitää merkittävinä.

Western blot-analyysi

Noin 1 mm

3 kudosnäytteiden kiillotettiin nestemäistä typpeä, sitten homogenisoitiin soluhajotuspuskurin (Beyotime, Kiina) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, poistettiin solujätteestä sentrifugoimalla 10000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus analysoitiin Bradfordin proteiinimäärityksellä (Bio-Rad, USA). Koko proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (0,45 um) 2 tuntia. 2 h kuluttua estää 5% maito TBST, inkuboitiin membraanin kanssa hiiren anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) 1:200 laimennus ja hiiren anti-β-aktiini (proteintech, USA) 1: 2000 laimennus 4 ° C: ssa 12 h ja sen jälkeen 2 h inkuboimalla vuohen anti-hiiri-IgG (proteintech, USA) 1:2000 laimennus. Pesun mukaan TBST, havaittu kalvo signaaleja käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin ECL (Beyotime, Kiina). Image J ohjelmisto sovellettiin kvantitatiivinen analyysi HIF-1α-signaalin voimakkuuksia normalisoitu β-aktiini tasot. Tiedot analysoitiin GraphPad Prism versio 5.0, erot ryhmien arvioitiin tilastollisesti näyte yksisuuntaista Studentin t-testi p-arvo 0,05 pitää merkittävinä.

rakentaminen transkriptiotekijän geeni verkko perustuu geenien ilmentymisen profiili ja transkription säätelyelementin tietokanta

Transcription (TF) geeni verkko rakennettiin perustuen geeniekspressioprofiili ja transkription säätelyelementin tietokanta (TRED) käyttäen cytoscape ohjelmistot mukaan sääntelyn vuorovaikutusta ja ero ilmaisun arvot jokaisesta TF ja geeni. Vierusmatriisi ien ja geenien tehtiin määrite suhteet kaikkien geenien ja TF: istä. Ellipsin TF-geeni verkko edustaa geenejä punaisella (up-säännelty) ja vihreä (alassäädetty), kolmiot edustaa transkriptiotekijät. Suhde TF ja niiden tavoitteet esittävät nuolet, nuolen oli lähteeltä Target.

Analyysi liittyvän sairauden geenien ja geenien polku merkintä

Tietokanta Annotation, visualisointi ja Integrated Discovery (DAVID) toiminnallinen merkintä ohjelmisto levitettiin analysoida toiminnallisia rikastamista poikkeavien geenien. ”GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS” mahdollisuutta, tiedot tauti yhdistyksen rikastuminen geeniryppäät. Valitsimme ”GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS” tunnistaa taudin luokan rikastamiseen ja ”KEGG_PATHWAY” for koulutusjakson väkevöimistä Benjamini menetelmällä määritetään merkittävän rikastamisen score≥1.3.

tukeminen Information

Kuva S1.

Western blot-analyysi HIF-1α 10 paria mahasyövän ja normaalit kudokset.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099835.s001

(DOC) B Taulukko S1.

Potilaat tiedot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099835.s002

(DOC) B Taulukko S2.

Yhteenveto 2546 ilmentyvät eri geenien mahasyövän kudoksissa verrattuna kaukainen normaaleissa kudoksissa. Geeniekspressiotasot mahasyövän kudoksissa vs. kaukainen normaalit kudokset olivat vähintään 2-kertainen erilainen p-arvo 0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099835.s003

(XLSX)

Taulukko S3.

Yhteenveto these82 differentiaalisesti ilmentyvien geenien TF-sääntelyverkon mahasyövän kudoksissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099835.s004

(XLSX) B Taulukko S4.

95 asetuksessa tilat muodostetaan 82 ero geenien TF-geenisäätelyprote- verkkoon. Kaikki asetuksen tiedoista on lähtöisin transkription säätelyelementin tietokanta (TRED).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099835.s005

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitämme myös Medjaden Bioscience Limited (Hong Kong, Kiina) muokkausta ja oikoluku tämän käsikirjoituksen.