Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuvaamme onnistunut soveltaminen uusi lähestymistapa tuottaa dimeerinen Myc estäjiä muokkaamalla ja reversiibelisti yhdistävät aikaisemmin kuvatut kaksi pieniä molekyylejä. Me syntetisoitiin kaksi suunnattua kirjastot monomeereista, joista kukin käsittää ligandin, liitin, ja bioorthogonal liitoselementti, tunnistaa optimaalinen dimeerin kokoonpano tarvitaan estämään Myc. Havaitsimme yhdistelmiä monomeerien, kutsutaan itsejärjestyvien dimeerinen estäjiä, mikä näkyy synergistinen inhibitio Myc-riippuvaisen solujen kasvua. Olemme vahvistaneet, että nämä dimeerinen inhibiittorit suoraan sitoutua Myc estämällä sen vaikutuksen Max ja vaikuttaa transkriptioon MYC riippuvaisten geenien. Ohjaus yhdistelmiä, jotka eivät pysty muodostamaan dimeerin ei ole mitään synergistisiä vaikutuksia näissä määrityksissä. Yhdessä nämä tiedot vahvista uusi lähestymistapa tuottaa enemmän tehokkaita ja selektiivisiä Myc mukaan koottavia pienemmiltä, ​​alempi affiniteetti komponentteja. Tämä lähestymistapa antaa mahdollisuuden kehittää uusia terapeuttisia vastaan ​​Myc ja muut haastava proteiini: proteiini vuorovaikutus (PPI) kohde luokkiin.

Citation: Wanner J, Romashko D, Werner DS, May EW, Peng Y, Schulz R, et ai. (2015) Käännettävä Linkage kahdesta erillisestä pienmolekyylisalpaajilla Myc Luo dimeerinen Inhibitor ja parannettu vahvuuden toimii Myc Yli-ilmentävien Cancer Cell Lines. PLoS ONE 10 (4): e0121793. doi: 10,1371 /journal.pone.0121793

Academic Editor: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

vastaanotettu: 08 joulukuu 2014; Hyväksytty: 19 tammikuu 2015; Julkaistu: 15 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Wanner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Coferon, Inc. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP ja ST ja LDA aikaan tutkimuksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat nivelletty ”Kirjoittaja maksut-osiossa.

Kilpailevat edut: JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP, ST ja LDA ovat sidoksissa Coferon Inc aikaan tutkimuksen. LDA on nyt sidoksissa Assembly Biosciences, Inc. MP, FB ja DEB ovat perustajat ja osakkeenomistajat Coferon, Inc. JW, KWF, DSW ja LDA ovat kirjailijoita patenttihakemuksen esittämän Coferon Inc, joka kattaa molekyylit on kuvattu tässä käsikirjoitus. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

käyttö pienten molekyylien kuten lääkkeitä estävät syöpä tavoitteet on tehnyt valtavasti harppauksia viimeisten 20 vuoden aikana lukuisia huumeita rutiininomaisesti kliinisessä käytössä on laaja valikoima erilaisia ​​syöpiä. Tämä lähestymistapa on ollut erityisen menestyksekäs entsymaattista tavoitteet, jos sitoutumiskohta on hyvin määritelty, erillinen tasku proteiini, joka otollisia järkevä suunnittelu erittäin voimakkaita estäjiä. Kuitenkin pyrkimyksiä laajentaa käyttöä pienten molekyylien kohdistaa suurempia tai häiriintynyt pinta-alat, jotka ovat kriittisiä säätelemiseksi proteiini-proteiini vuorovaikutusten (PPI) ovat täyttyneet enemmän vähäistä menestystä. Prototyyppisiä PPI-inhibiittorit ovat yleensä kooltaan suuria ja niillä on huono huumeiden kaltaisia ​​ominaisuuksia ja niin on rajoitettu hyödyllisyys klinikalla. On siis selvää, että innovatiivisia lähestymistapoja tarvitaan täysin mahdollistaa löytö lääkkeiden suuri määrä mitä pidetään yleisesti terapeuttisesti merkityksellisinä mutta undruggable tavoite luokat monilla sairauksien aloilla.

Yhtenä lähestymistapa, jolla vastataan haastavampaa huumeiden tavoitteet kehitämme uutta teknologiaa, jotta koottavia pienten molekyylien suuriin dimeerisiä estäjiä, ensin kuvanneet Barany ja työtovereiden [1]. Teknologiafoorumin mahdollistaa toimituksen dimeerinen molekyylien suuri sitova jalanjälki estävän biologisiin tavoitteisiin, jotka ovat usein kyseenalaiseksi perinteisen lääketieteellisen kemian lähestymistapoja (Fig. 1A). Dimeerit koostuvat kahdesta monomeerien, joista kukin käsittää ligandin, joka on liitin, ja bioorthogonal liitoselementti. Fysiologisissa olosuhteissa, monomeerit voidaan nopeasti tasapainottua dimeerien muodostumisen kautta palautuvia kovalenttisten sidosten välinen linkkeri elementtejä. Linkkerien on suunniteltu alhaisen molekyylipainon ryhmiä, jotka voidaan helposti liittää kohdennettuja ligandeja kautta vastaaviin liittimiin. Ligandit, linkkerit ja liittimet voivat kaikki muuttaa virittää ominaisuuksia monomeerien ja voidaan optimoida hyvän lääkkeen kaltaisia ​​ominaisuuksia halutun farmakokineettisen profiilin. Optimoitu monomeerit voi imeytyä, jakautumista kudoksiin, ja menevät soluihin. Kun solun sisällä, monomeerit voidaan sitoa kohteena suoraan, jolloin tavoite ajaa koottavia dimeerin. Vaihtoehtoisesti monomeerit voidaan tasapainottua uudelleen solun sisällä muodostaen dimeerin liuoksessa, ja dimeeri voi suoraan sitoa ja inhiboida kohteena. Se, missä määrin kukin polku myötävaikuttaa estävä vaikutus riippuu luontaisista affiniteetit ligandien niiden sitoutumiskohdat kohde, liitin pituus, ja dimerointi vakio linkkereitä palveluksessa. Joko polku johtaa kohdeproteiinin on sidottu dimeerejä, jolla on suurempi affiniteetti ja suuremmalla spesifisyydellä kuin mukaisista monomeereista. Avain Tämän lähestymistavan etuna on, että se mahdollistaa solunsisäisen sukupolven suuren molekyylin estäjä, hyvin kohdistettu proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen pinnoille, samalla kun säilytetään kyky hyödyntää, lääkkeen kaltaisia ​​ominaisuuksia pienen molekyylin osia.

A) Kaavamainen esitys itsejärjestyvien dimeeri lähestymistapaa. Eri monomeerien (sininen ja vihreä), joka muodostuu ligandin, liitin ja pariksi bioorthoganol linkkerin toimitetaan soluihin, ylittää solukalvon ja reagoivat muodostaen aktiivisen dimeerisen inhibiittorin soluissa. Dimeeri kokoonpano voi esiintyä solun miljöössä tai mielenkiintoisen kohteen. B) Kaavamainen esitys boronihapon /dioli tasapainon aikana käytettiin dimeerien muodostumiseen. Trigonal tasomainen, neutraalit lajit ovat tasapainossa ladattu kiraalisella tetraedrisiä. Tietyn dioli, solu miljöössä pH 7.4 tasapainot määräytyvät pKa boronihappojen palveluksessa ja jonka pKa boronaattiryhmän esterit muodostettu. Rasemisoitumista kiraalisen varautuneitten tapahtuu hyvin nopeasti ja biologisen tavoite tulee valitsemaan edullisimpia dimeerin. C) Yhteenveto kirjaston suunnittelu: Rakenteet kahden perusmolekyyleille C01 (vasemmalla) ja C02 (oikealla) ja kiinnitys kantoja; liittimet ovat joko alkyyliketjujen tai PEG-yksikköä; R ja R ’ovat sidoksissa liittimien kautta amidi- tai hiili-sidoksen; synteettiset tiedot valittujen kirjaston jäsenten annetaan täydentävässä kokeellisia menettelyjä.

Erilaisia ​​bioorthogonal linkkerit ovat sopivia tähän teknologia-alustan. Me ja muut ovat kuvanneet atomi-tehokas aryyliboronihapolla linkkerit, jotka voivat palautuvasti dimerisoimaan eri katekolien ja

cis

-alkyyli diolin kumppanit vesipitoisissa olosuhteissa [1, 2, 3, 4] (Fig. 1 B). Boronihappojen ja kumppani diolit tasapaino saavutetaan nopeasti, jossa dimerointi vakioita tyypillisesti JlM mM alue [5, 6]. Tärkeää on, että dimerointi vakio voidaan säätää substituentteja. Esimerkiksi käyttöön steerisen vaikutuksia joko linkkerin osa disfavors boronaattiesteri hydrolyysi, siirtää monomeeri-dimeeri tasapainon kohti dimeerin muodostumista, mikä parantaa dimeroitumisen vakioita [7, 8] ja voi kääntää parantaa tehokkuudet tuloksena dimeerisen estäjä. Sekä boronihapon ja diolin linkkerit voidaan liittää haluttuun ligandien kautta monenlaisia ​​liittimen osien avulla helpon synteettisiä menetelmiä. Tätä teknologiaa voidaan soveltaa mihin tahansa kohde-, joka käsittää kaksi tai useampia proksimaalinen sitoutumiskohtaa, joka voi olla silloitettu ligandien, joissa sopivia liittimiä ja linkkereitä. Tyypillisesti dimeerit irtoavan kohdistaa hitaampi off-hinnat, mikä johtaa pitkäaikaiseen eston kohteena.

Tässä olemme käyttäneet tätä tekniikkaa kehittää estäjiä vastaan ​​c-Myc (kutsutaan Myc jäljempänä) transkriptio tekijä. Myc kuuluu perheeseen transkriptiotekijöiden jonka muut jäsenet ovat myös MycL ja MycN ja nämä transkriptiotekijät on tärkeä rooli säätelyssä solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja erilaistumista [9, 10]. Myc on normaalisti tiukasti säädeltyä, mutta sen ekspressiotaso voidaan merkittävästi lisätä syövän, ja tämä uskotaan olevan merkittävä tekijä kasvaimen biologiaan. Myc aktiivisuutta voidaan vapautettu lisäämällä ilmentymistä joko geenin monistaminen [11] tai geenin translokaatiota [12]. Suppeammilla tapauksissa, erityisesti Burkittin lymfooma,

Myc

-geeni on mutatoitunut [13, 14], mikä voi johtaa vakaampaan proteiini [15, 16]. Toimiakseen biologisesti, Myc muodostaa heterodimeerin kumppaninsa Max, ja tuloksena saatu dimeeri sitoutuu promoottori motiiveja, rekrytoi transkription aktivointi komplekseja, ja lopulta aktivoi Myc-riippuvaisia ​​geenejä. On selvää, että inaktivointi Myc voi johtaa merkittäviin antituumorivaikutuksia hiirimalleissa syövän [17, 18]. Lisäksi toiminnalliset inaktivointi Myc normaalissa kudoksessa käyttäen hallitseva negatiivinen muoto (OmoMyc) on hyvin siedetty [19], joka tukee käsitystä, että terapeuttisesti kohdistaminen tämän reitin voi olla keino hoitaa syöpää.

Lukuisia suoran ja epäsuoria menetelmiä on kehitetty kohdistaa Myc biology [20]. Äskettäin pieniä molekyylejä, jotka estävät BET perheen epigenetic lukija proteiinien ja vaikutuksista

Myc

geeniekspressiota ovat osoittaneet erinomaisia ​​prekliinisen teho Myc kasvain malleja [21, 22, 23] ja tällä hetkellä kliinisissä kokeissa. Useat ryhmät ovat myös raportoineet pienmolekyylisalpaajien jotka sitoutuvat suoraan Myc ja estää sen vuorovaikutus Max [24, 25]. Nämä inhibiittorit, alun perin käyttöön Prochownik et ai, sitoutua mikromolaarinen affiniteetilla ja häiritä Myc: Max vuorovaikutus sekä estävät leviämisen Myc-ilmentävä kasvain solulinjoissa. Kaksi tällaista pieniä molekyylejä, 10058-F5 ja 10074-G5, on osoitettu sitoutuvan itsenäisesti ja samanaikaisesti häiriintyneestä konformaatiota perus helix-loop-helix leusiinivetoketjun (bHLHZip) domeenin Myc, estäen siten sen vuorovaikutus Max [26 , 27, 28]. Lisäksi tiivis analogeja 10058-F4 ja 10074-G5 vastaavanlaisia ​​ja parannettu tehot on kuvattu [29, 30, 31, 32, 33].

Olemme hyödyntäneet meidän teknologia-alustan kehittää itsejärjestyvät dimeerinen estäjät Myc näiden aikaisemmin kuvattu pieniä molekyylejä kuten meidän alkaa yksittäisten ligandien. Nämä molekyylit ovat lisämuunnetut oheen liitettyjen liittimien ja linkkerit suunniteltu helpottamaan palautuvia dimeerimuodostus. Osoitamme, että uusi inhibiittorit suoraan sitoutuvat Myc parantunut affiniteetti yli nykyisten pienmolekyylisalpaajien häiritä Myc: Max vuorovaikutus

in vitro

, ja vaikuttaa ilmentymistä MYC geenien soluissa johtaen antiproliferatiivisia vaikutuksia in Myc-ilmentäviä tuumorisolulinjoja.

Materiaalit ja menetelmät

yhdiste Synthesis

täydellinen kuvaus synteettisiä reittejä molekyylien kuvattu tässä paperissa löytyy S1 File .

Soluviljely, leviämisen ja Synergy analyysi

K562 (CCL-243), Daudi (CCL-213), Raji (CCL-86) ja MV4-11 (CCL-9591) solujen ostettiin suoraan American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja rutiininomaisesti viljeltiin suositelluissa olosuhteissa. Kasvua ja lisääntymistä määritettiin käyttämällä Cell Titer 96 Aqueous One Solution (Promega, Madison, WI). Kaikki solut maljattiin 10000 solua per kuoppa elatusaineeseen selkeästi 96-kuoppaiselle levylle. 3 päivän kuluttua yhdisteen hoidon reagenssia lisättiin, ja absorbanssi 490 nm: ssä luettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kontrolli levy yhdistettä laimennettuna mediassa samoina pitoisuuksina käsiteltiin samalla tavalla ja nämä arvot vähennetään solusta levyn tiedot ohjata mihinkään yhdisteen häiriöitä määrityksessä. Synergia määritettiin käyttäen Bliss mallia itsenäisyyden.

Solulyysi ja Western blotting

Drug käsitellyt solut pestiin PBS: ssä ja hajotettiin RIPA-puskuriin (täydennetty proteaasi ja fosfataasiestäjät) (Sigma, St. Louis, MO), jäillä 30 minuuttia. Kokonaisproteiinia pitoisuudet määritettiin käyttäen BCA-pakkausta (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blotit suoritettiin ratkaisemalla proteiinien SDS-PAGE: lla ja siirtää nitroselluloosakalvoille. Membraanit tutkittiin vasta-aineita: c-Myc (9E10) (sc-40); HRP konjugoitua GAPDH (FL-335) (sc-25778 HRP) (kaikki Santa Cruz Biotechnology); Max (AF4304) (R Halkaistut PARP (Asp214) (D64E10) XP (5625; Cell Signaling). Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista hiiren tai kanin (1: 5000) (GE Healthcare) tai vuohen (1: 1000) (R 50 uM. Fig. 3A ja taulukko 1) vastaa tuoreen raportin avulla vanhempien ligandeja 10058-F4 ja 10078-G5, joka osoitti affiniteetit 39,7 uM ja 31,7 uM varten Myc samanlaisessa SPR määritys [35]. Sen sijaan yhdistelmä E07 + N12 sidottu Kd 8,6 uM, huomattava parannus eri monomeerien. Havaitsimme samanlaisia ​​datan E08 + N11 dimeeriä. Erityisesti havaitsimme saturaatiositoutumisen yhdistelmien kanssa stoikiometria dimeerin sitovien alle, sulje pois mahdollisuutta, että yhdiste aggregaatiota aiheuttama dimeroitumisen vastasi tehostunutta sitoutumista havaittu.

A) estäjät osoittavat kyllästää sitoutumisen Myc SPR kokeita. Equilibrium Response Units (RU), normalisoitu maksimikonsentraatioilla tyydyttyneitä arvot yksittäisissä kokeissa, on merkitty (keskiarvo ± SEM) funktiona inhibiittorin pitoisuus. B) Annos-vaste-käyriä inhiboimiseksi Myc: Max vuorovaikutusta määritettiin ELISA: lla. Tiedot esitetään murto-osana aktiivisuus verrattuna DMSO käsitellyn kontrollinäyte ja piirretään keskiarvo 2-5 kokeissa ± SD. X-akseli tarkoittaa pitoisuutta kunkin käytetyn monomeerin.

Sen varmistamiseksi, että dimeerinen estäjä ajoi parantunut sitoutuminen Myc, syntetisoimme analogi N12, joka oli samanlainen kaikessa, paitsi siitä puuttuu dioliryhmä vaaditaan reaktioon sen boronihapon vastine (C12, Fig. 2C). C12 yksin tai yhdessä E07 oli Kd-arvot 50 uM (Fig. 3A ja taulukko 1), joiden perusteella voidaan päätellä, että kyky muodostaa dimeerin oli tärkeää parantaa sitoutumisen näiden monomeerien.

Seuraava kysytään sitovat näitä dimeerejä ja Myc voivat häiritä vuorovaikutus sen transkription kumppanin Max. Kehitimme ELISA käyttäen puhdistettua Myc ja Max proteiini, joka antoi meille mahdollisuuden mitata vaikutuksia Myc: Max sitova. ELISA-levy ensin päällystetty Max proteiinin ja yhdisteet esi-inkuboida Myc-proteiinia ennen lisäämistä Max-päällystetylle levylle. Perusteellisen pesemisen jälkeen Myc sitoutuminen Max havaittiin käyttäen anti-Myc-vasta-ainetta. Alussa testattiin vanhemman ligandimolekyyleihin C01 ja C02, ja havaittiin pieni esto joko monomeerien (IC

50 30 uM) tai yhdistelmä (IC

50 23 uM) on Myc: Max vuorovaikutus (S1 taulukko). Me seuraavaksi keskittyneet yksi tunnistettu dimeerisiä estäjät, E07 + N12 ja tutkittiin samalla tavalla, että yksittäiset monomeerit E07 ja N12 ei juuri estämällä Myc: Max vuorovaikutus (IC

50 24 uM ja 30 uM; Fig. 3B ja taulukko 1). Sen sijaan yhdistelmä E07 + N12, annostellaan suhteessa 1: 1, inhiboivat Myc sitoutumisen Max annoksesta riippuvalla tavalla (IC

50 3,3 uM) (Fig. 3B ja taulukko 1), joka on 8-kertainen parannus yli aktiivisin yksittäinen monomeeri. Huomaamme samanlaisia ​​vaikutuksia dimeerinen estäjän E08 + N11 (taulukko 1).

ohjaus yhdistelmä C12 kanssa E07 pystynyt osoittamaan aktiivisuutta Myc: Max ELISA pidemmälle aktiivisuus E07 yksin (Fig. 3B) , mikä viittaa siihen, että kyky E07 + N12 dimeroitua ajoi parantunut estovaikutus. Rajoitettu vaikutuksia havaittiin kanssa ylimääräisiä ei-dimeroitavat ohjaus yhdistelmä E08 + C11 (taulukko 1).

Self-kokoonpano dimeerit estävät selektiivisesti Myc: Max sitoutumalla DNA

Vakiinnutettuaan että dimeerit sitoutuvat myc ja estää sen sitoutumisen Max halusimme seuraavaksi vahvistaa, että nämä inhibiittorit estivät selektiivisesti biologista aktiivisuutta myc on soluvapaa koe. Muodostumista Myc: Max heterodimeerin vaaditaan sen kykyä sitoutua DNA-sekvenssejä ja käynnistää transkription aktivaatio Myc-riippuvaisten geenien. Max on lisäksi kyky muodostaa homodimeerejä, jotka voivat sitoutua samaan DNA-sekvensseihin, mutta yleensä tukahduttaa geenin ilmentymisen [9, 10]. Siksi suoritettiin elektroforeesigeeliä liikkuvuuden siirtymän määrityksellä onko meidän estäjät ollut selektiivisyys inhiboimaan Myc: Max heterodimeerejä DNA yli Max: Max homodimeerejä.

inkubointi Max proteiinin E-box oligonukleotidi johti DNA- kaistansiirtymäjärjestelmä ohjeellinen Max: Max homodimeerit (Fig. 4A). Lisääminen Myc pienensi määrän Max: Max homodimeerien ja ulkonäkö Myc: Max heterodimeerejä monimutkaisissa DNA. Kumpikaan monomeerien, E07 tai N12 ollut mitään havaittavaa vaikutusta Myc: Max tai Max: Max komplekseja, mutta E07 + N12 aiheutti annosriippuvaisen laskun tasojen Myc: Max monimutkainen. Erityisesti lasku Myc: Max kompleksi on kääntäen korreloi tasojen nousu Max: Max monimutkainen, mikä viittaa siihen, dimeeri on nimenomaan estää Myc: Max vuorovaikutus, mikä vapauttaa Max homodimerize ja sitoutua DNA: han.

Geeliliikkuvuuden shift määritys osoittaa vaikutuksia Myc: Max DNA kompleksin muodostumisen dimeerisen estäjä E07 + N12 (A) ja ei-dimeroitavat ohjaus yhdistelmä E07 + C12 (B). Yhtyeet edustavat proteiini-DNA-kompleksi tai paljaalla DNA näkyvät oikealla puolella kunkin paneelin. Annettuina pitoisuuksina ovat uM.

Kuten edelleen todisteita siitä, että muodostumisen dimeerisen inhibiittorin oli kriittinen estävä aktiivisuus, suoritimme samanlaisia ​​kokeita ei-dimeroitavat ohjaus monomeerin C12 (Fig. 4B) . Toisin kuin E07 + N12, yhdistelmä E07 + C12 ei ollut vaikutusta sitoutumiseen Myc: Max tai Max: Max komplekseja DNA. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​vaikutuksia näiden yhdisteiden SPR määrityksessä ja ELISA.

Yhdessä nämä soluttoman koetulokset osoittavat, että itsejärjestyvien dimeerinen salpaajia löydetty solussa määritykset voivat suoraan sitoutua Myc ja estää sen vuorovaikutus Max, joka tukee on-kohde toimintamekanismi nämä inhibiittorit. Lisäksi muiden kuin dimeroitavat ohjaus monomeerejä vahvistaa, että kyky muodostaa suuren molekyylipainon dimeerinen estäjä on avain kyky kohdistaa Myc-proteiinin.

Self-kokoonpano dimeeri on kriittinen solujen aktiivisuuden myc-inhibiittorit

solutonta kokeissa oli selvästi osoitettu, että kyky koottavien dimeerin oli tärkeää ajo parantunut estovaikutus verrattuna myc-proteiinin. Tämän testaamiseksi matkapuhelinverkossa yhteydessä vertasimme vaikutus solujen elinkelpoisuudesta E08 + N11 dimeeri versus ei-dimeroitavat ohjaus yhdistelmä E08 + C11. Hoito Daudi-solujen E08 + N11 aiheutti huomattava vähennys solujen elinkelpoisuuden 72 tunnin jälkeen hoidon, kun taas E08 + C11 yhdistelmä ei ollut vaikutusta solujen elinkykyä (Fig. 5A, vasen paneeli). Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että solujen käsittely suhteellisen suuria pitoisuuksia ( 50 uM) pienen molekyylin Myc estäjät 10058-F4 ja 10078-G5 alentavan Myc-proteiinin tasot [31, 35] ja niin käytimme tätä mitata vaikutuksista dimeerejä on Myc-reitin.