Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka ikääntymiseen liittyvien menetys kromosomissa Y (LOY) normaaleissa hematopoieettisten solujen on tunnettu ilmiö, fenotyyppiset seuraukset LOY ovat olleet vaikeasti. Kuitenkin LOY on todettu yhdessä tupakoinnin, lyhyempi selviytyminen ja kohonnut syöpäriski. Ehdotettiin, että LOY verisolujen voisi tulla ennakoivaa biomarkkereiden miehen syövän synnyn.

Tavoitteet, Methods Havainnot

tutkimiseksi yhdistys LOY veren solujen kehittymisen riskiä paksusuolen (CC) ja eturauhasen syöpiä (PC), olemme analysoineet DNA-näytteet perifeerisestä verestä 101 CC miehillä (keski-ikä 60,5 ± 11,9 v), 70 PC potilasta (keski-ikä 68,8 ± 8,0 vuotta) ja 93 tervettä ohjaus miehillä (keski-ikä 65,8 ± 16,6 vuotta). Menetelmiin kuului yhteistyössä monistuminen homologiset sekvenssit kromosomissa Y ja muut kromosomien avulla multiplex määrällisiä loisteputki (QF) PCR seuraa automaattinen tunnistus ja analyysi ABI 3500 Genetic Analyzer. Keskimääräinen Y /X-suhde oli merkitsevästi pienempi koko ryhmän syöpäpotilaiden (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) verrattuna kontrolleihin (1,015 ± 0,15), sekä CC (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10

-9) ja PC potilaat (0,941 ± 0,06; p = 0,00012), kun analysoidaan erikseen. Monimuuttuja regressioanalyysimme korjattuna LOY ja ikä osoitti, että LOY on merkittävämpi ennustaja syövän läsnäolon kuin ikä, ja että ikä ei luultavasti osaltaan lisännyt useita aiheita kanssa havaittavissa LOY syöpäpotilailla kohortissa.

johtopäätös

Yhteenvetona tuloksemme tukevat viimeaikaiset havainnot yhdistyksen LOY verisolujen kanssa syövän syntymistä miehillä.

Citation: Noveski P, Madjunkova S, Sukarova Stefanovska E, Matevska Geshkovska N, Kuzmanovska M, Dimovski A, et al. (2016) menetys Y kromosomi ääreisverenkierrossa on peräsuolen ja Eturauhassyöpä Potilaat. PLoS ONE 11 (1): e0146264. doi: 10,1371 /journal.pone.0146264

Editor: Ezio Laconi, University of Cagliari, ITALIA

vastaanotettu: 14 syyskuu 2015; Hyväksytty 15 joulukuuta 2015 Julkaistu: 8. tammikuuta 2016

Copyright: © 2016 Noveski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat hanketta 13-3595 /1 opetus- ja tiede, tasavallassa Makedoniassa (ja DPK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

menetys Y-kromosomi (LOY) on hyvin tunnettu ilmiö, joka liittyy ikääntymiseen ja havaittiin vaihtelevalla taajuudet luuytimen soluissa [1,2] tai ääreisverisoluissa [3,4] terveistä vanhempia miehiä. Yhdistys LOY hematologiseen syöpiin on ollut vaikeasti. Kuitenkin LOY on raportoitu leukemiat [5,6,7,8] ja potilailla ennustettu olevan huono vaste syöpähoidon [9]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen kanssa potilailla, jotka osoittivat LOY yli 75% [10] tai 100% altistuneen solujen [11]. Viimeaikaiset tutkimuksessa, LOY kahdessa erillisessä ääreisverenkierron solufraktiois- löytyi huomattavasti korkeampi taajuus LOY CD34 + solut potilailla, joilla on myelodysplastinen oireyhtymät verrattuna miehillä ilman hematologisia sairauksia [12]. Tutkimus osoittaa mitään yhdistyksen välillä LOY ja hematologisten syöpien on myös julkaistu [13].

yhteenliittymä LOY on raportoitu syöpäsolujen urothelial virtsarakon syöpään [14], haimasyöpä [15], ruokatorven syöpä [16], pään ja kaulan alueen syöpä [17], munuaissolukarsinooma [18] ja syöpäsolulinjoissa maksasolusyövän [19]. Nämä tutkimukset ovat keskittyneet LOY kasvain itse markkerina syövän alatyypin ja /tai sairauden etenemistä ja mahdolliseen tulokseen.

Useat tutkimukset ovat tutkineet mosaiikki LOY perifeerisen veren soluissa suhteessa taudin esiintyminen. Yhdistys löydettiin ensisijainen maksakirroosi [20], autoimmuunityroidiitti [21], mutta ei mies rintasyöpä [22]. Suuri kohortti SNP array perustuvat tutkimukset löytyi yhdistys mosaiikki LOY ääreisverisoluissa lisääntynyt syöpäriskiä, ​​lyhyempiä selviytymisen ja tupakointi [23,24].

Me täällä esitellä tulokset yhdistyksen tutkimuksen LOY ääreisverisoluissa sairastavien miesten peräsuolen ja eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Oppiaineet

tutkittiin 101 sairastavien miesten peräsuolen syöpä (keski-ikä 60,5 ± 11,9 vuotta ), 70 sairastavien miesten eturauhassyöpää (keski-ikä 68,8 ± 8,0 vuotta) ja 93 terveelle miehelle väestössä (keski-ikä 65,8 ± 16,6 vuotta). Syöpäpotilailla rekrytoitiin Department of Urology, lääketieteellisen tiedekunnan, Skopje, tasavallassa Makedoniassa ja saatettiin Farmakogeneettisellä Laboratory, Farmasian tiedekunta, samalla kun DNA-näytteet terveiden verrokkien saatiin DNA pankki on RCGEB ”Georgi D. Efremov ”. Jotkut kliinis ominaisuudet kasvaimia syöpäpotilaiden esitetään taulukossa 1. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Makedonian Academy of Sciences ja Arts (hyväksynnän nro 2010/1) ja eettiselle komitealle Farmasian tiedekunta, University Ss Cyril ja Metodi (hyväksynnän nro 03-95), Skopje, tasavallassa Makedoniassa. Kaikki koehenkilöt ovat antaneet kirjallisen tietoisen suostumuksen tutkimukseen osallistumisesta mukaan Helsingin julistuksen.

DNA eristys

DNA eristettiin kokoverestä. Hajotuksen jälkeen, leukosyyttien pelletoitiin ja hajotettiin proteinaasi K: lla ja DNA uutettiin sen jälkeen standardi fenoli-kloroformilla protokollaa.

määritys mosaiikki LOY veren

läsnäolo LOY määritettiin multiplex määrällisiä fluoresenssi polymeraasiketjureaktio (QF-PCR) alunperin kehitetty havaitsemiseksi microdeletions vuonna AZF alueilla Y kromosomi ja kromosomi aneuploidioiden potilaalla on miesten hedelmättömyys [25,26]. Suhteellinen määrä Y-kromosomin arvioitiin kautta chromosomeY /chromosomeX (Y /X) suhde fluoresoivan signaalin yhteistyön monistetaan lyhyet sekvenssit Y-X homologisia amelogenin geenit (

Amely

ja

AMELX

).

AMELX

sisältää 6 emäsparin (bp) deleetion introni 1, joka puuttuu

Amely

niin, että co-monistetut fragmentit ovat kooltaan 112 bp kromosomi Y ja 106 bp: X-kromosomissa ja erotetaan helposti ja kvantifioidaan kapillaarielektroforeesilla (~ 1: 1-suhde 112/106 ep piikkien normaalilla miespuolisella DNA-näytteitä ja niillä on ainoastaan ​​106 bp huippu naisten DNA-näytteet) [27]. Vääriä positiivisia tuloksia kadotessa tai kromosomin X ohjasivat monistamisen 152 emäsparin fragmentti

TAF9B

kromosomissa X alukkeilla, jotka myös co-monistamiseen 148 emäsparin homologinen sekvenssi kromosomissa 3. Suhde piikin alojen kahden yhteistyössä monistetut fragmentit (148/152 ep; kromosomi 3 /kromosomi X) on ~ 2: 1 normaaleissa miehen DNA-näytteitä ja ~ 1: 1 normaalissa naisen DNA-näytteitä.

poistot tai päällekkäisyyksiä

Amely

alue suljettiin pois kaksi muuta alukesarjoilla. Ensimmäinen monistaa homologisia jaksoja

DAZL

kromosomissa 3 (kaksi kopiota 217 ep: n fragmentti) ja

DAZ

geenit kromosomissa Y (neljä kappaletta 214 ep: n fragmentti). Toinen alukesarja vahvistaa

MYPT2

kromosomissa 1 (175 ep: n fragmentti) ja kaksi homologiset sekvenssit (180 bp fragmentit) kromosomista Y. Alukesekvensseillä ja PCR-olosuhteet multiplex QF-PCR kuten muualla on kuvattu [ ,,,0],26]. Co-monistettu fluoresoivasti leimattu PCR-tuotteet ajettiin Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer kanssa LIZ500 sisäisenä standardina ja analysoitiin GeneMapper 4.1 ohjelmisto (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Edustavia electrophoregrams kahdesta aiheita, joista kanssa amelogenin Y /X-suhde ~ 1 ja yksi amelogenin Y /X-suhde on 0,28, on esitetty kuviossa 1.

Electrophoregrams peräisin koehenkilöillä, joilla a) normaali amelogenin Y /X suhde (suunnilleen sama piikin alueilla X-kromosomin ja Y-kromosomi sekvenssit) ja b) potilaalle peräsuolen syövän ja lisäsi merkittävästi solujen osuus kanssa LOY (amelogenin Y /X-suhde on 0,28).

jotta validoida QF-PCR-menetelmää on käytetty kahta erilaista DNA-näytettä: yksi normaali uros näyte (46, XY), ja yksi näyte, joilla on Turnerin oireyhtymä (45, X0) (jäljittelemään solujen LOY). Molemmat näytteet sekoitettiin eri suhteissa edustaa näytteitä 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% ja 90% LOY. Ennen analyysin sekä näytteet säädettiin sama konsentraatio. Nukleiinihappo- konsentraatio ja näytteen puhtaus määritettiin NanoVue ™ Plus Spektrofotometri (GE Healthcare, Little Chalfont, Yhdistynyt kuningaskunta), kun taas tarkka kaksijuosteinen DNA: n konsentraatio mitattiin Qubit

® dsDNA HS iinianalyysikitissä on Qubit 2,0 fluorometri (Thermo Fisher tieteelliset, Waltham, Massachusetts, USA). Kun molemmat mittaukset DNA pitoisuudet ja puhtauden sekä näytteet olivat identtiset.

toistettavuus Y /X-suhde määritys mitattiin toistamalla QF-PCR-monistus ja analysointi 11 potilailla, joilla amelogenin Y /X-suhde alle 0,80 . Lisäksi variaatiokerroin on amelogenin Y /X-suhde laskettiin toistuvilla QF-PCR-analyysit suoritettiin 14 potilaalla on Y /X suhde 0,8-1,0 ja 12 aiheita välillä 1,0-1,2. Eliminoimiseksi Puolueellisuuden eri PCR asetettu ups, PCR-reaktiot on kolmannes terveiden verrokkien ja kaksi kolmannesta syöpäpotilaiden tehtiin samanaikaisesti kussakin PCR kulkee.

Tilastollinen

erot kahdella ryhmää analysoitiin Studentin t-testiä arvioituaan varten tasa varianssien kanssa Levene`s testi. Korrelaatio kahden muuttujan analysoitiin Pearsonin korrelaatiokerrointa (r). Toteamisraja laskettiin keskihajonta vasteen ja kulmakerroin regressiosuora [28]. Erot avulla toistettujen mittausten analysoitiin Pariksi näytteitä t-testiä. Monimuuttuja logistista regressiota käytettiin mallintamaan yhdistyksen LOY ja iän muuttujat syöpä läsnäoloa. Merkitsevyystaso pidettiin kun p-arvo oli pienempi kuin 0,05. Variaatiokerroin rinnakkaisista mittauksista laskettiin kanssa MedCalc for Windows, versio 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Belgia) mukaan niiden kuvattujen menetelmien. Tietojen analyysit kaikille muille tilastolliset testit suoritettiin käyttämällä Statistical Package for Social Sciences, Versio 19 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Tulokset

validointi amelogenin Y /X huipun suhde menetelmänä havaitsemiseksi mosaiikki LOY punasolujen testaus toistettavuutta

Normal 46, XY DNA-näyte ja yhdeksän sekoitetaan DNA-näytteitä eri osuudet 46, XY ja 45, X0 DNA-näytteet monistettiin kolmena kappaleena ja vastaavien amelogenin Y /X-suhde saatiin kullekin osuuden. Korrelaatio analyysi perustuu keskimäärin arvoihin kolmena mittaukset osoittivat voimakas negatiivinen korrelaatio (r = -0,999, p = 8.03×10

-13) välillä prosenttiosuus 45, X0 näyte ja amelogenin Y /X-suhde.

toteamisraja (LOD) LOY laskettiin 4,6%, käyttäen keskihajonta ja kulmakerroin regressioviivana keskimääräisten arvojen kolmena mittausten (kuvio 2).

pisteitä on keskimäärin amelogenin Y /X-suhde arvot mikä vastaa 0%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% ja 90% 45, X0 sekoitettu DNA-näytteistä. Regressiosuora arvioitiin käyttäen prosenttiosuus 45, X0 näyte itsenäisinä ja amelogenin Y /X-suhde kuin riippuva muuttuja. Slope (t) ja keskihajonta (σ) regressiosuoran käytettiin laskemiseen toteamisrajalla kaavalla LOD = 3.3σ /s [28].

toistettavuus amelogenin Y /X-suhteet arvioitiin 37 aiheista. Alhainen variaatiokerroin 4,62% ​​ja mitään merkittävää eroa keinoja kahden mittauksen (p = 0,1097, Parilliset T-testi) vahvistavat, että QF-PCR on luotettava menetelmä arvio siitä amelogenin Y /X-suhteet.

Mosaic LOY verisolujen merkittävästi liittyy syövän läsnäolon

Olemme analysoineet Y /X-suhde käyttäen QF-PCR 264 DNA-näytteet eristetään leukosyyttien ääreisveren potilailla, joilla peräsuolen syöpä (n = 101 ), eturauhassyöpä (n = 70) ja terveiden verrokkien (n = 93), sovitettu iän. Jakelu Y /X-suhteet esitetään histogrammit kuvassa 3. keskiarvo Y /X-suhde oli merkitsevästi pienempi syöpäpotilailla (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) kuin kontrollit (1,015 ± 0,15) . Tilastollinen merkittävyys säilyy myös silloin, kun keskimääräinen Y /X suhteet peräsuolen potilailla (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10

-9) ja eturauhassyövän potilailla (0,941 ± 0,06; p = 1.15×10

-4) analysoitiin erikseen.

keskiarvot ja keskihajonnat ovat myös osoittaneet.

Käyttämällä monimuuttuja logistinen regressio olemme mallinnettu prosenttiosuus LOY (päätellä amelogenin Y /X-suhde) ja ikä arvioida niiden vahvuus ennustaa syövän läsnäoloa. Molemmat ennustaja muuttujia käytettiin jatkuvien muuttujien kun tulos oli syövän läsnäoloa eikä syöpää referenssinä (taulukko 2). LOY prosenttiosuus ennustaa syövän läsnäolo on merkittävä vahvuus (p = 2.043×10

-9), kun taas ikä osoitti vain rajatapaus merkitys (p = 0,024). Kaksi ennustaja muuttujia mallissa viittaavat siihen, että ikääntymiseen säädettäessä varten LOY prosenttiosuutta ei lisää syöpäriskiä läsnäoloa meidän kohortin syöpäpotilaita.

Keskustelu

Useat tutkimusryhmät tutkivat ei-invasiivisia syövän biomarkkereiden parantaa varhaisen diagnoosin ja hoidon syöpäpotilailla. Äskettäin LOY on ehdotettu mahdolliseksi biomarkkeri eri syöpiä miehillä. Tiedot suuret ikäluokat liittyy LOY ääreisverenkierrossa kanssa riskit kuolleisuusriskiä ja ei-hematologinen syöpä kuolleisuus [23]. Uudistetut tapausverrokkitutkimukset liittämällä mosaiikki LOY ääreisverisoluissa lisääntynyt riski syövän tarvitaan.

myötävaikuttaa selvennetään roolia LOY perifeerisen veren syövän biomarkkerina miehillä, olemme suorittaneet tapauksessa verrokkitutkimus sairastavien miesten kahta eri syöpien.

menetelmää käytimme perustui välillisestä määrittämiseen LOY läsnäolo QF-PCR, mitataan huipun suhde alojen fluoresoivasti leimattuja PCR-fragmenttien kiinteän pituisia edustavat homologiset sekvenssit Y-kromosomin ja joitakin muita kromosomi. Tämän menetelmän, jolla mitataan huipun suhde alueilla käytetään laajalti nopean sikiödiagnostiikkaa yhteistä kromosomin aneuploidioiden [29]. Sitä käytetään myös havaitsemiseen sukupuolikromosomeiksi aneuploidioiden sekä poistoista ja uudelleenjärjestelyihin AZF alueiden Y-kromosomi [25]. Toisin kuin sytogeneettinen analyysi viljeltyjen verisolujen (vain T-lymfosyytit), joka on aikaa vievä ja altis teknisiä esineitä, kuten kromosomin menetyksen aikana preparaatin [3], QF-PCR-menetelmää suoritetaan DNA eristettiin leukosyyteistä kokoverestä ja se on edullinen ja kestävä. Emme voineet verrata tuloksia amelogenin Y /X-suhteet käyttäen suora laskenta solujen sytogeneettinen analyysi, mutta olemme vahvistanut menetelmämme simuloimalla LOY käyttämällä 45, X0 DNA-näyte. Korkea korrelaatio 45, X0 prosenttiosuus ja amelogenin Y /X-suhde vahvistaa, että QF-PCR on luotettava menetelmä arviointiin Y /X-suhteet. Vaikka on olemassa raportteja

Amely

alleelinen keskeyttämisen seurauksena poistamisen tällä alueella Y-kromosomi, tihennetystä pääasiassa raportoitu aasialaisilla [30,31,32]. Emme ole havainneet menetys

Amely

miehillä mukana tässä tutkimuksessa sekä yli 4000 mies analysoidut näytteet laboratoriossamme läsnäolon yleisin kromosomi aneuploidioiden, isyys- ja miesten hedelmättömyys (julkaisematon data).

tutkimuksessamme olemme mukana sairastavien miesten eturauhasen ja peräsuolen syöpä. Vaikka amelogenin Y /X-suhde ei anna tarkkaa arvoa prosenttiosuus solujen LOY keskimääräinen suhde saatujen arvojen sisällä samoissa koeolosuhteissa edustavat noin heijastuksen laajuuden LOY varten tutkittu ryhmille. Keskimääräinen Y /X suhteet olivat merkittävästi vähemmän peräsuolen potilailla kuin eturauhassyöpä potilailla. Mitä suurempi osuus potilaita, joilla LOY meidän kohortin syöpäpotilaita on yhdenmukainen viimeaikaisten havaintojen osoittavat merkitsevästi useammin sukupuolikromosomeiksi monosomiat potilaalla on keuhko- ja virtsarakon syöpä verrattuna terveisiin kontrolleihin [33].

Koska LOY on raportoitu liittyvän iän, olemme Hyväksytty meidän syöpäpotilaiden ja ohjaamaan muita kuin syöpäpotilailla iän ja sen jälkeen mallinnettu ikä ja LOY prosentuaalinen syövän esiintymisen ennusteita. Tulokset osoittivat, että lisääntynyt määrä koehenkilöiden LOY meidän kohortin syöpäpotilaiden todennäköisesti eivät vaikuta heidän ikänsä.

Tarkkaa mekanismia, jolla solut menettävät Y-kromosomi ei ole tiedossa. Yksi ehdotettu mekanismi on vaikutusta telomere lyhenemistä aikana ikääntyminen, joka johtaa raastin epävakauden ja hajoaminen Y-kromosomi, joka on lyhyempi telomeres kuin autosomeiksi [34]. Toinen ehdotettu mekanismi liittyy omaisuutta Y-kromosomin jäljitellä myöhään S-vaiheessa [21], mikä lyhentää solusyklin (ja menettää Y-kromosomi) voisi antaa proliferatiivista etua sairaus vaikuttaa organismin. Erilaisia ​​reittejä voidaan aktivoida, mikä johtaa eri leviämisen hinnat ja useita hematopoieettisten solujen LOY eri syöpien vastauksena signaaleihin syöpäsoluja. Vaihtelu genomin eri syövän populaatioissa voi lisäksi mukauttaa vastetta hematopoieettisten solujen syöpäsolun signaaleja. Muita todisteita tästä ehdotettu mekanismi signaalin aiheuttamaa LOY liittyy siihen, että tupakointi on ohimenevä ja annoksesta riippuvaa mutageeninen vaikutus LOY-asema [24]. Myös tämä mekanismi hyväksyy ehdotetun vaikutuksen muuttama kudos microenvironmental signalointi somaattiseen kehityksestä ikätasolle riippuvaisella tavalla [35]. Äskettäin klonaalisia hematopoieesin somaattisista mutaatioista osoitettiin paitsi yhä yleisempää vanhuksia mutta myös lisätä riskiä hematologisten maligniteettien ja kuoleman [36,37], sitä mahdollisuutta, että kaikki kuolinsyyt johtuu lisääntynyt riski sydän- ja verisuonisairaudet [36]. Nämä tutkimukset analysoidaan vain yhden nukleotidin variantteja ja pienet indeleitä eivätkä raportoi suurta poikkeamaa kuin Y-kromosomin menetyksen. Myös suuret kromosomipoikkeavuuksien ( 2Mb) on autosomeiksi DNA verestä todettiin olevan yleisempiä yksilöiden kiinteitä kasvaimia kuin syöpä-vapaa henkilöille [38]. Olisi mielenkiintoista nähdä esiintyminen LOY, somaattisten mutaatioiden ja /tai tietyntyyppisiä kromosomipoikkeavuuksien liittyvät ja esittää yhteen samoissa soluissa tai solutyyppejä. Jos terveys vajaatoiminta edistää samanaikainen esiintyminen erityyppisten geenimutaatioiden, Helposti havaittavissa mosaiikki LOY voisi tulla arvokas biomarkkereiden.

Yhteenvetona tulokset meidän tapauskontrollitutkimuksessa osoitti vahvan yhteyden syövän esiintymisen ja mosaiikki LOY vuonna ääreisverenkierron miesten vaikuttanut paksusuolen ja eturauhasen syöpä on kaksi yleisintä kiinteitä kasvaimia miehillä. Ne tukevat myös viimeaikaiset tutkimustulokset yhteenliittymän LOY veren kanssa karsinogeneesissä miehillä.