Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy on evoluutiossa säilytetyn prosessi vastaa hajoamisen ja kierrätyksen sytoplasman komponenttien autolysosomes. Kohdistaminen AR akseli on standardi strategia eturauhassyövän hoidossa; kuitenkin, rooli AR autophagic prosesseissa ei vieläkään täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että AR vaikuttivat kielteisesti AR degrader Celastrol aiheuttama autophagy. Knockdovvn AR AR-positiivisten syöpäsolujen johti parannettu autophagy. Ektooppinen ilmentyminen AR AR-negatiivinen eturauhasen syöpäsolujen tai vahvistuksen funktiona AR signaloinnin AR-positiivisten solujen, johti poistaminen autophagy. Koska miR-101 on estäjä autophagy ja sen ilmentyminen väheni yhdessä AR prosessissa Celastrol aiheuttama autophagy oletamme, että AR estää autophagy kautta transaktivaation

miR-101

. AR sitoutumiskohta määriteltiin ylävirtaan

miR-101

geenin lusiferaasireportterista ja siru määritykset. MiR-101 ilmaisu korreloi AR tilaansa eturauhassyövän solulinjoissa. Esto Celastrol aiheuttaman autophagy AR on vaarantunut estämällä miR-101; kun taas transfektointi miR-101 johti eston Celastrol aiheuttaman autophagy huolimatta AR ehtyminen. Lisäksi mutageneesin AR sitova sivusto

miR-101

geeni vähensivät tukahduttamista autophagy AR. Lopuksi, autophagy inhibitio miR-101 matkivat havaittiin parantaa sytotoksista vaikutusta Celastrol eturauhassyöpäsoluissa. Tuloksemme osoittavat, että AR estää autophagy

kautta

transaktivaatiota

miR-101

, mikä yhdistelmä miR-101 jäljittelee kanssa Celastrol voi edustaa lupaavaa terapeuttista lähestymistapaa eturauhassyövän hoitamiseksi.

Citation: Guo J, Huang X, Wang H, Yang H (2015) Celastrol indusoi Autophagy mukaan kohdistaminen AR /miR-101 eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (10): e0140745. doi: 10,1371 /journal.pone.0140745

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 30 syyskuu 2015; Julkaistu 16. lokakuuta 2015

Copyright: © 2015 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukevat Natural Science Foundation of Heilongjiangin maakunnassa, Kiina (C201432), Innovation Research Project Harbin, Kiina (2012RFLXS011) ja tieteellisen tutkimuksen säätiö Palautettu Overseas Chinese Scholars, State Opetusministeriö.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy on säilynyt prosessi vastaa liikevaihdon pitkän eli proteiineja tai poistaminen vahingoittuneiden soluelimiin eukaryoottisoluissa. Se säätelee joukko autophagy liittyvien geenien (ATGs), jotka ovat mukana aloittamisesta, autophagosome muodostumisen ja kypsymisen [1]. Autophagy tapahtuu normaalisti alhaisella-tasojen, mutta indusoituu vasteena korostaa ärsykkeet, mukaan lukien nälkään, hypoksia, tai hormonin puutetta [2]. Lisääntynyt autophagy voi tarjota hyötyä syöpäsolujen käsitellä ehtoja, jotka eivät ole suotuisia hengissä.

Celastrol, triterpenoidi eristää perinteisen kiinalaisen lääketieteen ”Thunder of God Vine” on osoittanut tehokkuutta suhteessa ihmisen eturauhassyöpää

in vitro

ja

in vivo

[3, 4]. Se edistää epävakauden androgeenireseptorin (AR) estämällä Hsp90 tai aktivoitumista kalpaiini [5, 6]. AR on jäsen steroidi superperheen ligandin transkriptiotekijöitä. Sillä on tärkeä rooli kehittymisessä ja etenemisessä eturauhassyöpä, jolloin androgeenien puute hoidon lääketieteellisessä tai kirurgisen kastraation on standardi strategia eturauhassyövän hoitoon [7]. Estää AR signalointireitti on osoitettu laukaisevan autophagy AR positiivinen eturauhassyövän solulinjoissa, mikä on edullista solun selviytymisen tai solukuoleman riippuen käytetystä spesifisiä inhibiittoreita ja solujen yhteyksissä [8-11]. Induktio autophagy havaittiin parantavan solujen elinkyky androgeenideprivaatio ja hypoksiaa tai alle nälkään olosuhteissa [8, 9, 11]. AR degrader osoitettiin indusoivan solujen kuolemaa induktion autophagy [10]. Useita molekyylejä, kuten Grp78 ja AMPK on osoitettu olevan osallisena säätelyssä androgeenideprivaatio aiheuttama autophagy [8, 9]. Kuitenkin, kuten transkriptiotekijän, mekanismi, jonka AR säätelee autophagy ei ole täysin ymmärretty. Meidän microarray tiedot osoittivat, että miR-101 ilmentyminen alassäädetty kun autophagy indusoitiin Celastrol. MiR-101 on raportoitu estäjänä autophagy, joka tukahduttaa sekä induktion ja kypsymisen autophagy suuntaamalla

ATG4D

,

RAB5A

ja

STMN1

[12]. Lisäksi AR sitomiskohta ennustettiin ylävirran alueella

miR-101

geeni [13]. Nämä havainnot pyydetään meidän hypoteesia, että Celastrol indusoi autophagy kohdistamalla AR /miR-101 eturauhasen syöpäsoluja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tarkistanut AR sitoutumiskohdan ylävirran alueella

miR-101

geenin lusiferaasireportterista ja siru määritykset. Ekspression miR-101 havaittiin korreloivan AR asema eturauhassyövän solulinjoissa. Huolimatta AR ehtyminen mukaan Celastrol, transfektoimalla miR-101 matkivat LNCaP-soluissa johti eston autophagy. Kun miR-101 oli tukossa, AR estoa autophagy oli helpottunut. Lisäksi mutageneesi AR sitoutumiskohdan ylävirran alueella

miR-101

geenin vähensivät inhibition AR-välitteistä autophagy.

Materiaalit ja menetelmät

Chemical ja oligonukleotideja

Celastrol ostettiin Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Kaikki oligonukleotidit syntetisoitiin Ribio (Guangzhou, Kiina) ja seuraavat sekvenssit: miR-101 jäljittelevät, 5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3 ’; miRNA matkivat Negatiivinen kontrolli (Ncontrol) # 22: 5’-UUUGUACUACACAAAAGU ACUG-3 ’, miR-101-estäjän: 5′-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3′; miRNA-estäjä Ncontrol # 22: 5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 ’. siRNA AR: 5’-GGTGATCACAGGATAGGTATT-3 ’, siRNA valvonnasta: 5′-GGGCCATGGCA CGTACGGCAAG-3’.

Soluviljely ja solujen transfektio

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP, 22Rv1 , DU145 ja PC-3 saatiin Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian (Shanghai, Kiina), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Biological teollisuus, Israel) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2/95% ilmaa.

androgen nälkään, LNCaP-soluja viljeltiin fenolipunattomassa RPMI 1640 media (Gibco BRL Co. Ltd., USA), joka sisälsi 1% hiilellä erotettua FBS: ää (Invitrogen, Eugene, OR, USA) 24 tuntia ennen kokeita.

transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Ohimenevä transfektio pEGFP-C1-AR tai tyhjän vektorin (Addgene) suoritettiin LNCaP tai PC-3-soluja. Transfektion jälkeen väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 1 nM R1881. Vakaa transfektointi pEGFP-C1-AR tai tyhjän vektorin suoritettiin DU145 soluissa. Soluja esikäsiteltiin R1881 (1 nM) 24 tunnin ajan ennen koetta. LNCaP-solut transfektoitiin pEGFP-LC3 (Addgene) ja valitaan 0,8 mg /ml G418: aa (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Saksa), jolloin saatiin stabiilit transfektantit.

Plasmidit

pGL3-Basic oli antelias lahja tri Li Yu (Harbin Institute of Technology, Kiina). Tuottaa reportterirakenteet, pGL3-B-miR-101-L ja pGL3-B-miR-101-S, joka on 1793 emäsparin DNA-fragmentin ylävirtaan

miR-101

geeni, joka sisältää ennustetun AR sitova päällä ja sen lyhyempi fragmentti on deletoitu ennustetun AR sitoutumiskohdan monistettiin käyttämällä alukkeita 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCT ACAT-3 ’; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCCACCCAGCTCACC-3 ’, ja 5′-CGCAC GCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3′; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCC ACCCAGCTCACC-3 ’, vastaavasti, ja kloonattiin pGL3-Basic-vektoriin. Reportteri-konstrukti, joka sisältää 300 emäsparin fragmentti ennustetun villityypin AR sitoutumiskohta, pGL3-B-miR-101-WBS, monistettiin PCR: llä käyttämällä alukkeita 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3 ’, ja 5’-CCGCTCGAG CTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC- 3 ’. Mutaation aiheuttamiseksi ennustettu AR sitoutumiskohdan pGL3-B-miR-101-WBS (nimetty pGL3-B-miR-101-MBS), kaksivaiheinen PCR suoritettiin. Ensimmäisessä vaiheessa PCR, seuraavia alukkeita (mutatoidut nukleotidit ilmaistaan ​​pienempi tapauksissa): 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCC TACAT-3 ’; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ’, 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAA AGTTA-3′; ja 5’-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3 ’käytettiin. PCR-tuotteita käytettiin templaattina toisen vaiheen PCR käyttäen ulompaa alukeparia,.

PGL3-B-miR-101W konstruktio PCR-monistuksella on 2166 bp: n DNA-fragmentti, joka sisälsi sekä AR sitoutumiskohta ja miR-101-geenin sekvenssi käyttäen alukkeita 5′-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ’, 5′-CCGCTCGAGAT GTTACCACGCCATTTA-3′, ja kloonaus pGL3-Basic-vektoriin. Sen mutantti muoto pGL3-miR-101m, on tuotettu kaksivaiheisella PCR, kuten on kuvattu edellä käyttäen kahta alukeparia, jotka sisältävät mutantti AR sitoutumiskohdan 5’-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ’; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ’, ja 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAAAGTTA-3′; 5’-CCGCTCGAGATGTT ACCACGCCATTTA-3 ’. Letters pienillä kirjaimilla osoittaa mutatoidun nukleotidit.

Quantitative real-time PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Yhteensä 1,0 ug kokonais-RNA: ta käytettiin syntetisoimaan komplementaarinen DNA käyttäen EasyScript Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi SuperMix (transgeeniset, Peking, Kiina). qPCR tehtiin ekspression määrittämiseksi tasojen kunkin geenin käyttämällä seuraavia alukkeita: ATG5: 5′-GCAAGCCAGACAGGAAAAAG-3 ’, 5′-GACCTTC AGTTGGTCCGGTAA-3′; ATG7: 5’-CAGGAGATTCAACCAGAGAC-3 ’, 5′-AGAT ACCATCAATTCCACG G-3′; AR: 5’-CAGCAACAGCAGCAGGAAGC-3 ’; 5’-CTTT TGCATTCGGCCAATGG-3 ’; GAPDH: 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ’; 5’-G GCATGGACTGTGGTCATGAG-3 ’. Pri-miR-101: 5’-GTATTTCGTAGGACAGG-3 ’; 5’-TCTACAGGAAGCGAGT-3 ’. Data normalisoitiin GAPDH-ilmentymisen tasoja.

miRNA ilmentyminen analysoitiin kuten on raportoitu julkaisussa Shi

et ai

[14]. Lyhyesti, kokonais-RNA (1 ug) polyadenyloituina käyttäen Poly (A) Tailing Kit (Ambion Inc, Foster, CA) seuraten valmistajan ohjeita. Sen jälkeen kun fenoli-kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella, RNA käänteistranskriboitiin kanssa EasyScript käänteistranskriptaasia (transgeeniset, Peking, Kiina) ja 0,5 ug poly (T) sovittimen 5′-GCTGTCA ACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT (24) N (A /C /G ) -3 ”mukaan valmistajan protokollia (Invitrogen, Eugene, OR, USA). MiR-101-ekspressio määritettiin käyttäen alukkeita 5′-GCTGTCAACGATACGCTA-3 ’ja 5′-CAGTACTGTG ATAACTGAA-3’. Tiedot esitettiin keskiarvona kolmesta kokeesta ja normalisoitiin endogeenistä U6-RNA ΔΔCT menetelmää.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin käyttäen RIPA-puskuria, joka sisälsi 10 mM Tris HCl: lla (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia, 0,8% Triton X-100 ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Mannheim, Saksa). Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu [15]. Lyhyesti, 40 ja 100 ug proteiineja per kuoppa erotettiin polyakryyliamidigeelillä ja sitten sähkölaitteita siirrettiin PVDF kalvoja. 2 h kuluttua estää, kalvot pestiin ja tutkittiin seuraavat primaaristen vasta-aineiden: kanin anti-LC3, hiiren anti-p62 ja anti-PARP (Cell Signaling Technology, USA), hiiren anti-GAPDH (KC-5G4) (KANGCHEN , Shanghai, Kiina), hiiri AR (sc-816) ja hiiren PSA (sc-7316) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Proteiinin ilmentymistä havaittiin ECL (PPLYGEN, Peking, Kiina) ja visualisoitiin käyttäen LI-COR Odyssey 2800 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

DU145 eturauhassyövän solut maljattiin 24-kuoppalevyille (1 x 10

5 per kuoppa) 24 tuntia ja ko-transfektoitiin 300 ng reportteri konstruktien (pGL3-B-miR-101-L, pGL3-B-miR -101-S, pGL3-B-miR-101-WBS, pGL3-B-miR-101-MBS tai pGL3-Basic), 300 ng pEGFP-C1-AR tai pEGFP-C1 plasmidit ja 10 ng pRLSV40 (Promega , San Luis Obispo, CA, USA) käyttäen Lipofectamine 2000 jälkeen transfektion jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi R1881 (1 nM), ja kerättiin 24 tuntia myöhemmin. Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin käyttäen Dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) on Turner TD20 /20 luminometria ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

ChIP määrityksissä

ChIP suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [16]. Lyhyesti, DU145 tai LNCaP-solut transfektoitiin pEGFP-C1-AR tai pEGFP-C1. 24 tunnin kuluttua transfektion väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 1 nM R1881: ssa yön yli. Solut kerättiin ja silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään hypotoniseen puskuriin (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl

2 ja 10 mM KCI), jota seurasi homogenointi. Kerätyt tumat suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin ja sonikoitiin keskimäärin DNA pituus 200-1000 bp. Alikvootit (1%) ja leikattua DNA poistettiin syötteenä, ja loput käytettiin yksittäisten ChlP reaktiota tasapuolisesti. Kromatiinin liuokset esiselkeytettiin lisäämällä proteiini A-sepharose (GE Healthcare, Fairfield, USA) 2 tuntia ja inkuboitiin 10 ug: AR-vasta-aineen tai IgG negatiivisena kontrollina yön yli 4 ° C: ssa. Proteiini /DNA-immuunikompleksien kerättiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa, pestiin laimennuspuskurilla (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA: ta ja proteiini-inhibiittori cocktail) ja eluutiopuskuria (0,1 M NaHCO

3 ja 1% SDS). Proteiini /DNA ristisidosten palautettiin lisäämällä NaCl lopulliseen konsentraatioon 200 mM ja sen jälkeen inkuboimalla 65 ° C: ssa 4 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun DNA: n puhdistus suoritettiin PCR havaitsemiseksi miR-101 ilmentyminen käyttämällä seuraavia alukkeita: 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTA CAT-3 ’, ja 5′-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3’. PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeeleillä (2%) ja etidiumbromidilla.

Konfokaalimikroskopia

LNCaP-solujen GFP-LC3 ilmentymisen ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Jälkeen Celastrol käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä kolme kertaa. Sitten solut läpäiseviksi 0,05% (v /v) Triton X-100, värjättiin DAPI (Invitrogen, Eugene, OR, USA) ja analysoitiin käyttäen konfokaalimikroskoopilla (Zeiss, LSM510). Määrä GFP-LC3 punctate kvantifioitiin. Positiiviset solut, jotka sisälsivät viisi tai useampia puncta valittiin. Viisikymmentä solua kunnossa koetta kohti analysoitiin.

MTT määrityksissä

LNCaP solua maljattiin 96-kuoppalevylle (5000 /kuoppa). Käsittelyjen jälkeen, MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tuntia, jotta täydellinen katkaisu tetratsoliumsuolan metabolisesti aktiiviset solut. Soluhajotuspuskurin (20% SDS, 20 mM HCl: a) lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka jälkeen kolorimetrinen käyttämällä iMark Microplate Absorbanssi Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 595 nm: ssä.

Colony muodostuminen määritykset

LNCaP-soluja käsiteltiin Celastrol läsnä ollessa tai poissa ollessa miR-101 matkivat tai negatiivinen kontrolli tai bafilomysiini A1 (Sangon biotekniikka, Shanghai, Kiina) 24 tuntia. Käsittelyjen jälkeen, LNCaP-soluja (500 /kuoppa) ympättiin kuudella-kuoppalevylle ja niitä viljeltiin 15 päivää ilman häiriöitä. Sitten solut kiinnitettiin 4% formaldehydillä PBS: ssä ja värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeitä, joiden yli 50 solut laskettiin.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-tilasto-ohjelmalla. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, kaksi ryhmän vertailuja suoritettiin käyttäen pariksi Studentin t-testiä. Tietoja useista ryhmistä analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA, jota seurasi Dunnettin testi. Kaikkien testien merkitsevyystaso määriteltiin * tai #,

P

0,05; **,

P

0,01.

Tulokset

Celastrol indusoi autophagy ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

kohdistaminen AR Celastrol eturauhassyövän hoitoon on osoitettu useat ryhmät [3, 5]. Koska AR-inhibitio liittyy autophagy induktio, onko Celastrol voivat aiheuttaa autophagy ihmisen eturauhasen syöpäsolujen määritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 1, induktio autophagy liittyvien geenien

ATG5

ja

ATG7

havaittiin varhaisessa ajankohtina jälkeen Celastrol hoidon LNCaP eturauhassyövän soluissa (kuvio 1A). ATG7 toimii ubikitiinipromoottori E1 kaltainen entsyymi, kun taas ATG5 toimii ubikinaation substraatti tai E3-muistuttavan entsyymin kahdessa vaiheessa ubikitinaation menetelmä [1]. Mukaisesti tehtäviä autophagy induktio,

ATG7

osoitti korkeamman ilmaisun ja aikaisemmin vastaus kuin

ATG5

upon Celastrol käsittely (kuvio 1A). Sekä ATG5 ja ATG7 tarvitaan rekrytointi LC3, mikrotubuleihin liittyvää proteiinia, joka leviää sytoplasmassa, jotta autophagosome kalvo. Visualisoida LC3 rekrytointi, LNCaP-solut transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa GFP-merkitty LC3. GFP-LC3 puncta havaittiin kasvavan merkittävästi 6 h hoidon Celastrol (kuvio 1 B ja 1 C). Mukaisesti, muuntaminen LC3-I sen lipidejä muotoon LC3-II, tunnusmerkki autophagy, havaittiin kuluttua 3-6 h hoitojen ja kasvoi selvästi jälkeen 12-24 tunnin jälkeen (kuvio 1 D). p62 on reseptorin autophagosome kalvon, joka hajoaa lysosomissa jälkeen autophagosome fuusion kanssa [17]. p62-proteiinin taso laskettiin sen jälkeen, kun 6-24 h hoito Celastrol (kuvio 1 D), joka edelleen varmistaa, että Celastrol indusoi autophagy LNCaP-soluissa.

Lapsen LNCaP-soluja (A, D) tai transfektoitujen solujen GFP-LC3 (B, C), käsiteltiin Celastrol 2,0 pM merkitty kertaa. mRNA ilmaisuja autophagy liittyvien geenien mitattiin qPCR (A). RQ, suhteellinen määrä. GFP-LC3 transfektoidut solut värjättiin DAPI käsittelyjen jälkeen. GFP-LC3 puncta havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla (B) ja määrällisesti C. Solut, jotka sisälsivät yli 5 puncta valittiin viisikymmentä solut analysoitiin kunkin hoidon. D, Proteiiniekstraktit immunoblotattiin vasta-aineita LC3, P62 ja GAPDH (latauskontrollina). Tähdellä merkitsevät merkitys verrattuna ohjaus (0 h). *,

P

0,05; **,

P

0,01.

AR ekspressiotasoja korreloivat käänteisesti Celastrol aiheuttama autophagy

Samalla näytteiden ylhäältä, AR proteiini pieneni by Celastrol aikana autophagy asiakkuutta prosesseja. Celastrol hoito aiheutti huomattavaa laskua AR ekspressiotasot 3-6 tunnin ajankohtina ja lähes täydellinen ehtyminen 12-24 tunnin ajankohtina (kuvio 2A). Mukaisesti edellä havaintojen siRNA knockdown AR AR positiivinen LNCaP johti ~ 2-kertaiseen LC3-I LC3-II muuntaminen (kuvio 2B). Kontrolliin verrattuna, p62-proteiinin väheni AR siRNA (kuvio 2B), mikä osoittaa, että AR säätelee negatiivisesti autophagy. Synteettinen androgeenireseptorin R1881 käytettiin aktivoimaan endogeenisen AR signaloinnin LNCaP, joka oli osoituksena lisääntynyt proteiinin tasot AR ja sen tavoite PSA (kuvio 2C). AR aktivaatiota, autophagy estyi mikä näkyy lisääntyminen P62 tason ja puoli-kertainen väheneminen LC3-II /LC3-I-suhde (kuvio 2C), joka edelleen varmistaa, että AR: lla on negatiivinen rooli autophagy sääntelyä. Lisäksi, pEGFP-AR transfektoitiin LNCaP. Jälkeen Celastrol käsittely laski muuntaminen LC3-I LC3-II havaittiin pEGFP-AR transfektoituja soluja verrattuna mock transfektion (kuvio 2D), joka osoittaa, että pakko AR yliekspressio inhiboi autophagy laukaisi Celastrol. Celastrol indusoi myös autophagy AR negatiivinen DU145-solut, joita voitaisiin tukahduttaa eksogeeninen AR (kuvio 2E).

A, LNCaP-soluja käsiteltiin Celastrol 2,0 uM ilmoitettu kertaa, proteiini taso AR paljastui Western blottaus käyttämällä GAPDH latauskontrollina. B, LNCaP-solut transfektoitiin AR siRNA tai kontrolloida siRNA 24 h, vaikutukset AR Knockdown ja autophagy induktio varmistettiin Western-blottauksella käyttämällä AR, LC3, P62 ja GAPDH (latauskontrollina) vasta-aineita. C, LNCaP-solut altistettiin androgeenireseptorin nälkään kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”, jota seurasi 1 nM R1881 hoitoa 24 tuntia. AR ja tavoitteensa PSA, sekä autophagic päättäjät LC3 ja p62 havaittiin Western-blottauksella käyttämällä GAPDH latauskontrollina. LNCaP (D) tai DU145 (E) transfektoitiin pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai tyhjän vektorin (EGFP-V). D, Transfektion jälkeen, LNCaP-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi R1881 (1 nM) ja käsiteltiin kanssa tai ilman Celastrol (CEL), 2,0 uM 24 h (D). E, DU145 stabiilisti transfektoidut solut esikäsiteltiin R1881 (1 nM) 24 tuntia ennen Celastrol kohtelu D. LC3 havaittiin Western-blottauksella käyttämällä GAPDH latauskontrollina.

AR välittää tukahduttaminen miR-101 ilmentyminen Celastrol hoitoja

Jos haluat nähdä miRNA osallistumista prosessissa Celastrol aiheuttama autophagy, LNCaP-soluja käsiteltiin Celastrol 12 tuntia aiheuttaa autophagy. MiRNA array suoritettiin ja se osoitti, että ilmentyminen miR-101, joka on autophagy estäjä, väheni Celastrol (tuloksia ei ole esitetty). Suppressio miR-101 ilmentyminen Celastrol varmistettiin RT-PCR, joka paljasti ~ 3-kertainen väheneminen pri-miR-101 ja kypsä miR-101 LNCaP-soluissa Celastrol käsittely (kuvio 3A, vasen ja keski). Tähän liittyi lähes täydellinen loppuminen AR (kuvio 3A, oikealla), mikä viittaa siihen, positiivinen korrelaatio AR ja miR-101 ilmaisun jälkeen Celastrol hoidon. AR on transkriptiotekijä ja sen sitoutumispaikasta on ennustettu ylävirran alueella

miR-101

geeni [13]. Siten on mahdollista, että AR on välittäjäaine tukahduttaminen miR-101 ilmentyminen Celastrol. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, ensin määritetään, onko AR voisi sitoutua ennustettu AR sitoutumiskohdan ylävirran alueella

miR-101

geenin lusiferaasireportterilla määrityksiä. Lusiferaasireportteri- konstruktit tuotettiin, kuten on esitetty kuviossa 3B. pGL3-B-miR-101-S (ilman ennustettu AR sitoutumiskohtaan) osoitti noin 5-kertainen laski lusiferaasiaktiivisuus verrattuna pGL3-B-miR-101-L (jossa fragmentit, jotka kuuluvat ennustettu AR sitoutumiskohta) (kuvio 3C ). Lisäksi pGL3-B-miR-101-MBS jossa AR sitoutumiskohtaan mutatoitunut osoitti ~ 5-kertainen laski lusiferaasivaikutusta verrattuna pGL3-B-miR-101-WBS, joka sisälsi villityypin sitoutumiskohta (kuvio 3C) , mikä osoittaa, että tämä spesifinen sekvenssi on vastuussa AR tunnistamiseen. Seuraavaksi käytimme ChIP Määrityksissä, jos AR voisi sitoutua tämän sekvenssin. DU145-solut transfektoitiin pEGFP-AR tai pEGFP-V. Nuclear proteiinit eristettiin ja immunosaostettiin joko AR-aine tai kontrolli IgG. Kuten odotettua, miR-101 fragmentti, joka sisältää sitoutumiskohdan monistettiin erityisesti transfektoiduissa soluissa pEGFP-AR (kuvio 3D ylempi), jotka osoittavat, että AR voitiin palkata tähän sivustoon. LNCaP-solut,

miR-101

fragmentti monistettiin jälkeen mock transfektion (kuvio 3D alhaalla), joka osoittaa, että endogeeninen AR voitaisiin rekrytoidaan ARE on

miR-101

. Lopuksi, AR yli-ilmentyminen täysin pelastettu pri-miR-101 ja kypsä miR-101 ilmaisuja jälkeen Celastrol hoidon, joka esittää AR välittävä

miR-101

transkriptio alennuksia, Celastrol käsittely (kuvio 3E).

, miR-101 ja AR ilmauksia jälkeen Celastrol (CEL) käsittely. **,

P

0,01 verrattuna DMSO. B, Skemaattinen lusiferaasireportteri rakentaa kuin yksityiskohtaisesti ”Materiaalit ja menetelmät”. Villityypin ja mutantti AR sitovat kohdat oli merkitty kursiivilla viiva ja rajat, vastaavasti. C, DU145-solut transfektoitiin ilmoitetuilla toimittaja rakentaa läsnä ollessa pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai pEGFP-C1 (EGFP-V) plasmidin 24 tuntia, ja sitten havaittu lusiferaasiaktiivisuutta. pRLSV40 plasmidi kotransfektoitiin normalisointia. **,

P

0,01, välillä EGFP-AR ja EGFP-V transfektioissa. D, siru määritys. Solu otteita DU145 tai LNCaP-solut transfektoitiin pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai pEGFP-C1 (EGFP-V) immunosaostettiin AR-vasta-aineen tai normaali hiiri-IgG. Input oli 1/100 sonikoidaan kromatiinin ennen immunosaostuksella. PCR suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. E, LNCaP pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai tyhjän vektorin (EGFP-V) käsiteltiin Celastrol (CEL, 2,0 uM) tai DMSO: ssa 3 h, pri-miR-101 ja kypsä miR-101 tasot määritettiin qPCR. Tähdellä merkitsevät merkitys välillä EGFP-AR ja EGFP-V transfektioissa. *,

P

0,05; **,

P

0,01.

AR säätelee miR-101 ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

AR tila voivat vaikuttaa miR-101 ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Real-Time PCR paljasti, että ekspressiotasot pri-miR-101 sekä kypsä miR-101 olivat merkitsevästi korkeammat AR-positiivisia LNCaP ja 22Rv1 soluja kuin, että AR-negatiivinen DU145 ja PC3-soluissa (kuvio 4A). AR pudotettiin siRNA LNCaP (kuvio 4B, vasemmalla) tai 22Rv1 soluissa (kuvio 4B, oikealla). AR Knockdown alensivat ilmauksia kypsän miR-101, joka oli verrattavissa vähenemiseen pri-miR-101 sekä LNCaP ja 22Rv1 soluissa (kuvio 4C). Pakko AR ilmaisu aiheutti miR-101 pinta nousi AR-negatiivisten DU145 ja PC3-soluissa (kuvio 4D). Samoin eksogeeninen AR myös lisääntynyt miR-101 ilmaisuja jälkeen Celastrol hoidon (kuvio 4D). LNCaP-solut, endogeenistä AR uudelleen aktivoida R1881 jälkeen androgeenien puute. AR aktivointi (kuvio 4E, ylempi), ilmaus tasot miR-101 oli voimistunut (kuvio 4E). Nämä tulokset osoittavat, että AR pääasiassa säätelee

miR-101

transkription, mutta ei kypsymistä.

A-ilmaisujen pri-miR-101 ja kypsä miR-101 määritettiin AR positiivinen tai negatiivinen solu riviä qPCR. **,

P

0,01 kahden verrattuna ryhmään. B, LNCaP tai 22Rv1 solut transfektoitiin AR siRNA tai ohjata siRNA (ctrl siRNA). AR Knockdown vaikutukset todennettiin Western-blottauksella. Ilmauksia pri-miR-101 ja kypsä miR-101 määritettiin qPCR (C). *,

P

0,05

verrattuna

ohjaus siRNA. D, DU145 tai PC-3-solut transfektoitiin pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai tyhjän vektorin (EGFP-V) ja käsiteltiin DMSO: ssa tai Celastrol (CEL, 2 uM) 24 tuntia. Expressions kypsien miR-101 määritettiin qPCR. *,

P

0,05 välillä EGFP-AR ja EGFP-V transfektioissa. E, LNCaP-soluja käsiteltiin R1881: tä (1 nM) ja 24 h sen jälkeen, kun androgen nälkään, kuten on kuvattu kuviossa 2C. AR-proteiinin tasot määritettiin Western-blottauksella käyttämällä GAPDH latauskontrollina. MiR-101 ilmaisuja määritettiin qPCR. **, P 0,01

versus

DMSO.

AR estää Celastrol aiheuttaman autophagy säätelemällä

miR-101

eturauhassyöpäsoluissa

Seuraavaksi määritetään, onko AR säätelee negatiivisesti Celastrol aiheuttama autophagy estämällä miR-101 ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa. MiR-101 matkivat käytettiin lisäämään miR-101 tason LNCaP-soluissa. Jossa miR-101 upregulation lisäämällä miR-101 matkivat (kuvio 5A, ylempi), pohjapinta taso autophagy estyi (LC3-II /LC3-I aleni puoleen) (kuvio 5A, alhaalla). Vaikka AR vähennys Celastrol oli suotuisa autophagy induktio, lisäämällä miR-101 matkivat johti autophagy esto on osoituksena puoli kertainen väheneminen LC3-II /LC3-I-suhteen ja lisäys p62 tason (kuvio 5A, alhaalla). Vuonna DU145 soluissa, stabiili ilmentyminen eksogeenisen AR voisi upregulate miR-101 ilmaisun ja voi tukahduttaa autophagy laukaisi Celastrol. Kun miR-101 estyi lisäämällä miR-101 estäjä, määritettynä qPCR (kuvio 5B, ylempi), autophagy pelastettiin riippumatta AR yli-ilmentymisen (kuvio 5B, alhaalla). Nämä tiedot viittaavat siihen, että negatiivinen rooli AR pelataan säätelyssä autophagy riippuu sen loppupään tavoitteista. Lisäksi pari miR-101 ekspressiorakenteet, pGL3-B-miR-101-W, joka sisältää villityypin ARE, ja pGL3-B-miR-101-M, joka on mutantti ARE luotiin. pGL3-B-miR-101-W merkittävästi parannettu miR-101 ilmaisu kuin pGL3-B-miR-101-M kotransfektion eksogeenisen AR DU145-soluissa kanssa tai ilman Celastrol jälkeen (kuvio 5C). Mukaisesti miR-101 tasoilla, kotransfektion pGL3-B-miR-101-W, jota voidaan transaktivoidun AR osoitti enemmän tukahduttaminen on autophagy on pohjapinta tasolla tai Celastrol indusoi verrattuna pGL3-B-miR-101 M, joita ei tunnista AR (kuvio 5C), mikä osoittaa, että AR estää Celastrol aiheuttaman autophagy kautta transaktivaation miR-101.

onko miR-101 voi vaikuttaa AR tukahduttaminen on Celastrol aiheuttamaa autophagy, AR positiiviset LNCaP-solut transfektoitiin miR-101 matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC) ja 24 h (A), ja sen jälkeen vielä 24 h hoito Celastrol (2,0 uM, CEL). MiR-101-tasot määritettiin RT-PCR: llä. #,

P

0,05

versus

NC transfektio ilman Celastrol treament. **,

P

0,01 välillä miR-101 ja NC transfektiot kanssa Celastrol hoitoon. Proteiini tasot LC3 ja p62 sekä AR määritettiin Western-blottauksella käyttämällä GAPDH latauskontrollina. B, AR negatiivinen DU145 solut transfektoitiin pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) tai tyhjän vektorin (EGFP-V) läsnä ollessa miR-101 estäjä (miR-101 Inh) tai negatiivinen kontrolli (NC). Soluja inkuboitiin Celastrol (2,0 uM, CEL) vielä 24 tuntia. MiR-101-tasot määritettiin RT-PCR: llä. #,

P

0,05

versus

EGFP-V plus NC transfektioiden. *,

P

0,05 välillä EGFP-V ja EGFP-AR läsnäollessa miR-101 estäjä. Proteiinin tasot AR, LC3and p62 havaittiin Western-blottauksella. C, DU145-solut transfektoitiin pGL3-B-miR-101-W (villityypin AR sitoutumiskohta) tai pGL3-B-miR-101-M (mutantti AR sitoutumiskohtaan), sekä AR-ekspressiovektoriin (EGFP- AR) tai tyhjän vektorin (EGFP-V) 24 tunnin ajan, sitten käsiteltiin DMSO: ssa tai Celastrol (CEL, 2,0 uM) vielä 24 tuntia. MiR-101-tasot määritettiin RT-PCR: llä. #,

P

0,05

versus

EGFP-V plus pGL3-B-miR-101-M transfektioissa. *,

P

0,05 välillä pGL3-B-miR-101-M ja pGL3-B-miR-101-W transfektioissa. Proteiini tasot AR, LC3 ja p62 havaittiin Western-blottauksella käyttämällä GAPDH latauskontrollina.

AR moduloi miR-101 ilmaisu vaikuttamatta solukuoleman

Koska AR vähentäminen myös aiheuttaa alentuneen solujen elinkelpoisuuden, onko havaittu miR-101 tukahduttaminen ja autophagy induktio johtuivat solukuolemaa määritettiin. LNCaP-soluja käsiteltiin AR-antagonistin MDV3100 (Enzalutamide) eri aikoina. Kuten odotettua, AR proteiini vähentynyt (kuvio 6A).