Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska tarkoituksena valaista etiologiaa radioresistance, selvitimme geneettisiä muutoksia ei-säteilyresistenteille vs. resistenttejä ruokatorven syöpäsolujen hankittu pitkäaikaisilla fraktioitua säteilyä. Löysimme AKR1C3, joka on aldo-keto-reduktaasin ilmaistaan ​​harvoin useimmissa ihmisen kudoksissa ilmaistuna suurempi radioresistance-hankittu soluja. Tukahduttaminen AKR1C3 kautta RNAi tai kemiallinen -inhibiittorit palauttivat herkkyys hankitun kasvainsolujen ja ksenografti BALB /c-nude-hiiriin ionisoivan säteilyn (IR). Cellular seuranta oksidatiivista stressiä AKR1C3-koholla soluista osoitti, että IR aiheuttama ROS kertymistä ja samanaikaisen DNA-vaurioita merkittävästi lievittää, ja tällainen suojaava seuraus hävisivät AKR1C3 knockdown. Nämä havainnot paljastaa mahdollisen osallistumisen AKR1C3 poistoon solujen ROS ja selittävät ainakin osittain hankitun radioresistance mukaan AKR1C3 yli-ilmentymisen. Retrospektiivinen analyysi ruokatorven karsinoomien ilmoitti myös merkittävä ilmentymä AKR1C3 radio kestävä mutta ei radio-herkkä kirurgisten näytteiden. Tutkimuksemme voi tarjota mahdollisen biomarkkereiden ennustamiseen ennusteeseen sädehoidon ja jopa ohjata kohdennettu hoito ruokatorven syöpä ja muita kasvaimia.

Citation: Xiong W, Zhao J, Yu H, Li X, Sun S, Li Y , et ai. (2014) Kohonnut ekspressio AKR1C3 lisää resistenssiä syöpäsolujen säteilylle kautta modulaatio Oksidatiivinen stressi. PLoS ONE 9 (11): e111911. doi: 10,1371 /journal.pone.0111911

Editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Kanada

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 02 lokakuu 2014; Julkaistu 24. marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Mukaan PLoS One vaatimus ja MIAME ohjeita, meidän microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus kuin GSE61620, GSE61772 ja GSE61816.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Basic Research Program of China (973 Program 2010CB12300 DM Zhou), National Natural Science Foundation of China (91029711, 20932001 ja 20852001) sekä rahoitus Opetusministeriö (20110001110054). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ionisoiva säteily (IR) on tehokkain nonsurgical hoito useimmille kasvainten [1]. Tällainen terapeuttinen interventio yleensä perustuu vuorovaikutukseen IR ja vesimolekyylien soluissa, joka tuottaa liiallinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja siten asettaa syöpäsolujen laajaperäisissä oksidatiivisen stressin [2]. Erittäin epävakaa ROS reagoivat DNA ja muiden makromolekyylien läheisyydessä tuottaen geenivirheen, kromosomipoikkeavuus ja muita vaurioita [3]. Mitokondriot vahinkoja IR voi johtaa jopa pitkittyneen oksidatiivisen stressin ja siten edelleen vahingot DNA ja muiden solun molekyylien [4]. Kertyminen DNA-vaurioita on tärkeä tekijä laukaisee IR aiheuttama epäonnistuminen solunjakautumisen ja lisääntymistä, joka johtaa solun apoptoosin [5].

Huolimatta terapeuttisen merkityksen, IR vastus on merkittävä este syövän hoidossa [ ,,,0],6]. On raportoitu, että korjaus IR aiheuttama DNA-vaurioita, joko kaksinkertainen katkeamisen tai yhden lohkon vikoja, on yksi tärkeä mekanismi taustalla syövän uusiutumiseen ja radioresistance [7] – [11]. Poisto IR syntyvän ROS by antioksidanttientsyymejä muodostaa vaihtoehtoisen mekanismin johtaa radioresistance. Glutationiperoksidaasi (GPX), peroxiredoxin (TPX) ja superoksididismutaasi (SOD), suurin luokka antioksidanttientsyymejä, on tällainen kyky vähentää IR aiheuttamaa ROS kertymistä [12] – [14]. Tietyt syöpäsolut ja syövän kantasoluja sisältävät suuremman ilmaus antioksidantti entsyymejä ja ovat siten edullisesti säästyvät säteilytys [15], [16]. Discovery solun muiden osallistuvien entsyymien torjumaan oksidatiivisen stressin voi olla apua diagnosointiin ei-herkkien potilaiden sädehoidon ja jopa ohjata tehokkaasti kohdennettua hoitoa pahanlaatuisten kasvainten.

Ruokatorven syöpä on yleisin syöpä, jolla on 5 vuoden eloonjäämisaste 5-19% [17]. On vahvaa näyttöä siitä, että radioresistance ruokatorven syöpään voi olla synnynnäinen,

ts.

Liittyvät sukupuolen ja etnisen alkuperän tai indusoida elintapojen kuten tupakointi [18]. Siksi ruokatorven syöpä voi tarjota Ideaalimallin tunnistamista solun tekijöitä, jotka radioresistance indusoituu. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että hankkimisesta radioresistance samaan aikaan kohonnut ilmentyminen AKR1C3 ruokatorven syöpäsoluissa, ja tukahduttaminen AKR1C3 ilmaisun palautti herkkyyttä hankitun kasvainsolujen ja ksenografti eläinten ionisoiva säteily (IR). Lisäksi solu seuranta oksidatiivista stressiä AKR1C3-koholla soluista osoitti, että ROS kertymistä ja samanaikaisen DNA-vaurioita merkittävästi lievittää, ja tällainen suojaava seuraus hävisivät AKR1C3 knockdown. Retrospektiivinen analyysi osoitti merkittävän AKR1C3 ilmentymistä säteilyresistenttejä mutta ei vastustuskykyisten kirurgiset ruokatorven karsinoomat. Meidän havainnot voivat tarjota uuden biomarkkereiden ennustamiseksi ei-herkkien potilaiden sädehoidon ja jopa ohjata kohdennettu hoito ruokatorven syöpä ja muita kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja säteilytys

KY170 ja TE13, kaksi ihmisen ruokatorven okasolusyöpä syöpäsolun linjat, ja niistä säteilyresistenteille solulinjoja KY170R ja TE13R toimitettiin lahjana osasto radiologia, MD Anderson Cancer Center, USA. Nämä solulinjat, alun perin ilmoittamat on japanilainen ryhmä [19], oli todennettu ja testattiin tarjoaja käyttämällä lyhyitä tandem repeat profiloinnin ja karyotyping testejä. Soluja siirrostettiin alle 1 kuukausi ennen kokeilua. Osajaetta osa-kalusto käytettiin esitettyjen tutkimusten täällä. Soluja viljeltiin runsaasti glukoosia RPMI 1640 (

Invitrogen

), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (

HyClone

) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa ja jakaa 3-4 päivän välein. Kasvainsolujen säteilytys suoritettiin kanssa 6MV-X-ray lineaarikiihdytin.

RNAi, AKR1C3-hiljentäminen vakaa solujen

AKR1C3 kohdistus shRNA ja scramble-shRNA kasetteja rakennettiin PCR: llä käyttäen ylös -primer (hU6 promoottori): TGGATCCaaggtcgggcaggaagag, down-pohjamaali (ryntäily): AGGATCCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCGTCCTTT; down-aluketta (shRNA1): 5′-AGGATCCAAAAACCA GAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ’, (shRNA2): 5′-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCG AGTAGTGGAGATTTCTGTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3′, (shRNA3): 5’-AG GATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ’. Kasetit saatu kloonattiin pSD31 konstitutiivista ilmentymistä shRNA seuraamalla menetelmää, joka on määrätty aiemmin [19]. Lentivirusvektori tuotanto suoritettiin Invitrogenin vakioyhteyskäytäntöä. Kokeilut lentivector vakaa transduktio suoritettiin seuraavasti: 1 x 10

6 replikonin solujen T25 pulloon ympättiin ja transdusoitiin päivänä 2 läsnäollessa 8 mg /ml polybreeniä. Valinta suoritettiin päivän 3 jälkeen 800 ng /ml puromysiiniä kunnes emosoluilta rinnakkain kokeiluja täysin kuollut.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä ja kasvaimen säteilytys

yksisolukerroksen solujen räjähdysmäinen vaiheessa kasvu säteilytettiin käyttäen 6 MV-X-ray lineaarikiihdytin on sopiva annos (2, 4, 8 Gy), ja säteilytettyjä soluja maljattiin kasvaa kuuden kuopan levyillä. Kun oli inkuboitu 7-10 päivää, elossa solut värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin sitten. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti. Kasvaimen säteilytys suoritettiin seuraavasti: kun halkaisija ksenograftikasvaimissa saavuttanut 6-8 mm, takajalat on ksenografti hiiriä säteilytettiin yhden annoksen (15 Gy). Säteilytyksen jälkeen kasvaimen kasvua seurattiin jopa 36 päivää.

RNA ja Microarray

RNA uutettiin kustakin viljellyistä solulinjasta käyttämällä SV Yhteensä RNA Isolation Kit (

Promega

) mukaan valmistajan protokollaa. Uutettu RNA käsiteltiin sitten RNase-Free DNaasia set (

QIAGEN

) poistamaan kaikki kontaminoivat genominen DNA mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Gene profilointi, kolmena kappaleena, suoritettiin Illumina Shanghai Corporation käyttäen mikrosiru on valaista Human-6 V3 ja kerättiin ja analysoitiin Illuminated Beadstudio Sovellusohjelmisto (GSE61620, GSE61772 ja GSE61816). Geenit, joiden Illumina DifferScore on ≥20 katsottiin edustavan ylössäätöä, kun taas niille, joilla on Illumina DifferScore on ≤-20 katsottiin alassäätöä. P 0,05 osoitti merkittävää eroa.

Reaaliaikainen RT-PCR

Eristetty kokonais-RNA määrä määritettiin UV spektrofotometrin (

Eppendorf

) ja sitten 1,0 ug RNA käänteiskopioitiin käyttämällä First Strand cDNA Synthesis Kit (

TOYOBO, Japani

) satunnaisella alukkeita reaktiotilavuudessa 20 ui. PCR-reaktio suoritettiin käyttäen Go Taq qPCR Master Mix Kit (

Promega

) protokollan mukaisesti valmistajan toimittamien ja cDNA käytettiin sitten templaattina havaitseminen eri geeniekspressioiden. PCR-alukkeet suunniteltiin Primer 3.0 ja räjähdys haku tarkistamaan spesifisyyden. Alukkeet PCR-monistukseen AKR1C3 olivat 5’ATTTGGCACCTATGCACCTC 3 ’(ylävirtaan) ja 5’TGAGTTTTCCAAGGCTGGTC 3’ (alavirtaan) ja β-toimivat 5 ’AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT 3’ (ylävirtaan) ja 5’GGGCACGAAGGCTCATCATT 3 ’(alavirtaan). Suhteellinen mRNA-tasot eri geenien laskettiin seuraavasti: ACt (näyte) = CT (geeni) – CT (GAPDH); ΔΔCT = ACt (post-säteilytys ajankohtana) – ACt (0 h); Suhteellinen ilmentyminen = 2

-ΔΔCT. Kukin RT-PCR toistettiin ainakin kahdesti.

Western blot -määritys

Viljellyt Solut pestiin kerran PBS-puskurilla jälkeen hajotettiin hajotuspuskuriin (1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl: a, 1 mM NaF, 10 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mM natriumortovanadaattia, 1 mM EDTA), 5 min ja johdettiin 27-gaugen neula. Lysaatit sentrifugoitiin 12000

g

1 min ja proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttäen Bio-Rad DC-proteiinimäärityksellä. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 4~20% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% tai 3% naudan seerumin albumiinia TBST: ssä (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 1 h. Ensisijainen ja toissijainen vasta-aineita käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden ja tätä seurasi havaitseminen laajennetussa kemiluminesenssitekniikalla (

Amersham Biosciences

). Western kvantitaatiot suoritettiin seuraavasti: western blotit skannataan densitometrillä, jolloin saatiin tiheys kunkin kaistan. Sitten suhde tiheyden bändi kiinnostaa, että sen sisäisen valvonnan band (GAPDH) oli suhteessa suhde negatiivisesta kontrolli kokeita. Kukin Western blotting toistettiin ainakin kahdesti.

yli-ilmentyminen AKR1C3

Ihmisen AKR1C3 cDNA hankittiin (

Origene

, Cat. No: SC321532), kloonattiin pcDNA3.1 ja transfektoitiin sitten KY170 soluihin protokollan mukaisesti tarjotaan.

Virtaussytometria määrityksissä

Etanoli-kiinteä-soluja käsiteltiin RNaasi A: lla (0,1 mg /ml) 30 minuuttia, mitä seurasi inkubointi PI (35 ug /ml). DNA-pitoisuus PI-värjäytyneiden solujen analysoitiin FACScan (Becton Dickinson) ja solujen prosenttiosuus G1, S ja G2 /M-DNA-pitoisuus laskettiin käyttäen MODFIT ohjelmistoa. Virtaussytometria mittaukset dihydroethidium (DHE) -fluorescence käytettiin mittaamaan solujen ROS tasoilla. Yksikerrosviljelmiä inkuboitiin 10 uM DHE 45 minuuttia ja sitten korjattu. DHE-fluoresenssi analysoitiin virtaussytometrialla (viritys aallonpituudella 488 nm, emissio 585 nm). Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) laskettiin korjauksen jälkeen autofluorisaatiota ja kertaluokkamuutos laskettiin suhteessa muokkaamaan-KY170R soluissa. Jokainen virtaussytometrillä määritys toistettiin kahdesti.

Eläinkokeet

Male BALB /c-nude-hiiriin (SPF, ostettu Vital River Laboratories, Peking, Kiina), iältään 4-6 viikkoa, sijoitettiin kanssa käänteinen 12 tunnin päivän ja yön ajan valot päälle klo 20:30 lämpötila (22 ± 1 ° C) ja kosteus (55 ± 5%) valvottuun tilaan. Kaikki hiirille annettiin vettä ja chow

halun

kaikkina aikoina. Ksenografti nude-hiiret synnytettiin seuraavasti: KY170R-shRNA1 ja KY170R-sekoituskoodin soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa 70%: sta 80%: n peitolla. Jälkeen trypsinoimalla, solut pestiin kerran PBS: llä, ja laskettiin. Mies, 4 viikon ikäisiä 6-viikon ikäisiä nude-hiiret satunnaistettiin kahteen ryhmään ja injektoidaan ylemmän osan takaraajan, jonka tiheys on 2 * 10

6/100 ui KY170R-shRNA1 ja KY170R-scramble soluissa, vastaavasti. Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin ja kun kasvaimen halkaisija saavutti 6-8 mm, ”säteilytyksen ryhmä” eläimiä säteilytettiin kerran annoksella 15 Gy. Regression in ortotrooppisen kasvaimen kasvua seurattiin jopa 36 päivää, kasvaimen tilavuus, lasketaan kaavalla V = π /6 (a * b

2), jossa on pisin ja b on lyhyempi kohtisuorassa kasvain akselia. Kasvaimen tilavuus mitattiin, kunnes kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 1,0 cm

3. Sitten hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat ja seuraavissa kokeissa.

immunohistokemia kudosleikkeiden

immunohistokemia ihmisen ruokatorven syöpä kudosleikkeiden, hankittu patologian osastolta Peking University ensimmäisen Hospital, ja ksenografti kasvainten suoritettiin seuraavasti: 4-6 um kudosleikkeet on asennettu ja kuumennettiin 72 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä, kostutetaan lajitellut EtOH: a ja huuhdeltiin 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla kudosleikkeiden 3% H

2O

2 30 min. Antigeeni haku suoritettiin 0,01 M natrium- sitruunahappo (pH 6,0) 95 ° C: ssa 1 h. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla kudosleikkeiden 0,1 M Tris-HCI, joka sisältää 10% vuohen seerumia 2 tuntia. AKR1C3 määritettiin sitten inkuboimalla kohdat hiiren anti-AKR1C3 monoklonaalinen vasta-aine, jonka 1:200 laimennus edellä blokeerausliuoksella kosteassa kammiossa 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen, kun oli pesty 0,1 M Tris-HCl, leikkeet käsiteltiin 1:400 laimentamalla biotinyloitua hevosen anti-hiiri-vasta-ainetta ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sen jälkeen vielä huuhdellaan 0,1 M Tris-HCl: a, vasta-aineen sitoutuminen havaittiin inkuboimalla kudosleikkeet HRP-konjugoitua streptavidiinia huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. DAB-H

2O

2 substraattia lisättiin sitten levyt, jotka inkuboitiin huoneen lämpötilassa vielä 4 minuuttia. Tissue leikkeet värjättiin hematoksyliinillä, dehydroitiin alkoholia, kirkastettiin ksyleenissä ja peitettiin Per- mountilla Kiinnitys Media for visualisointi Valomikroskopia.

Tilastollinen

Student t-testiä käytettiin määrittää tilastollinen ero kahdella ryhmien ja data. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Ethics lausunto

Eläinten Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Ja kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta tai heidän perheensä tutkimusta näiden kudosnäytteitä. Kaikki solun Eläinkokeet ja immunohistokemia kudosleikkeiden tutkimus on hyväksynyt Pekingin yliopiston Institutional Review Board (Certificate No. IRB00001052-12037).

Tulokset

Eriytetyt ilmauksia AKR1C3 vuonna syöpäsolut

Valaistaan ​​etiologiaa radioresistance kaksi säteilyresistenteille ruokatorven kasvain klooneja, KY170R ja TE13R, ovat vahvistaneet jatkuvasti fraktioitua säteilytys niiden vanhempien solujen KY170 ja TE13 [20]. Genominlaajuisten profiloinnin geeniekspression KY170R

v.

KY170 ja TE13R

v.

TE13 käytetään valaista Human-6 V3 mikrosirujen osoitti, että yli 900 geenit todettiin erittäin eriytetty (Fig. 1A), yhdenmukainen edellisen raportin [21]. Joukossa, AKR1C3, joka on aldo-keto-reduktaasin nykyisiä alhaisella tasolla useimmissa ihmisen kudoksissa, herätti huomiota koska sen merkittävää ilmentymistä sekä säteilyresistenteille soluissa. Reaaliaikainen RT-PCR (Kuva. 1 B) ja Western-blottauksella (kuvio. 1 C) analyysit vahvistivat kohonnut ilmentyminen AKR1C3 vuonna KY170R ja TE13R soluja, tässä järjestyksessä, verrattuna niiden vanhempien solut: ~ 10-kertainen mRNA-tasolla ja paljon korkeampi proteiini tasolla. Tämä profiili paljasti sattuma kohonnut ilmentyminen AKR1C3 ja radioresistance ruokatorven KY170R ja TE13R syöpäsoluja. Colony-muodostumisen määritykset varmistanut, että KY170R ja TE13R olivat todellakin vastustuskykyisempiä IR kuin niiden vanhempien KY170 ja TE13-solut, joissa arvioitu annos alentamista selviytymistä 90%, KY170 vs. KY170R 5,5 Gy vs. 7,8 Gy (Fig. 1 C ).

(A) Genominlaajuiset profiloinnin geenin ilmentymisen säteilyresistenteille KY170R ja TE13R

vs.

säteilylle KY170 ja TE13, vastaavasti, 0, 8 h ja 24 h jälkeen säteilytyksen. (B) validointi kohonnut ilmentyminen AKR1C3 mRNA-tasolla on KY170R vs. KY170 ja TE13R vs. TE13-solut ennen ja 8 ja 24 tunnin kuluttua säteilytyksen määritettynä RT-PCR: llä. (C) validointi kohonnut ilmentyminen AKR1C3 in säteilyresistenteille KY170R määritettiin Western blot ja herkkyys KY170 ja KY170R solujen säteilytys, joka määritetään pesäkkeiden muodostumista määrityksessä.

vaikutus AKR1C3 on kasvaimen vastetta solujen säteilylle

Koska merkittävä ero ilmentymisen AKR1C3 välillä kestäviä ja ei-resistenttejä ruokatorven syöpä soluja, kysyimme, onko se voi olla ensisijainen syy tai pelkästään alavirran seuraus radioresistance. Tarkastella asiaa, ilmentymistasojen AKR1C3 vuonna KY170R ja TE13R olivat alas-säädellä shRNAs toimittama lentivector pSD31 ja vaikutukset AKR1C3 Knockdown on radioresistance karakterisoitiin. To poissulkemiseksi kysymyksiä, kolme shRNAs käytettiin rinnakkain valaista vaikutusta RNAi on KY170R solut ryntäily shRNA negatiivisena kontrollina. Western blotting-analyysi osoitti, että kaikki kolme shRNAs käytettiin tässä tutkimuksessa aiheutti voimakasta teho transdusoiduissa KY170R solujen 80% AKR1C3 ollessa alassäädetty verrattuna ryntäily-shRNA (Fig. 2A). Luonnehdinta AKR1C3 Knockdown soluproliferaatioon osoitti, että KY170R-shRNA1, KY170R-shRNA2 ja KY170R-shRNA3 (kolme vakaa solulinjojen tuottamat pSD31 välittämän transduktion) lisääntyivät lähes samaan tahtiin kuin KY170R-scramble solu, joka itse oli nopeudella melkein sama kuin nähdään KY170R ja KY170 soluja (Kuva. S1A File S1). Tämä viittaa siihen, että AKR1C3 ei tarvita geenin leviämisen näitä syöpäsoluja. Sitä vastoin säteilytys paljastaa biologinen vaikutus AKR1C3 edistämiseen solujen eloonjäämistä. Pesäkkeiden muodostumisen määritykset osoittivat, että transdusoidut KY170R-shRNA1, -shRNA2 tai -shRNA3 solujen tuli huomattavasti herkempiä säteilylle, joilla on vähemmän kloonien muodostettu kuin KY170R-sekoituskoodin solujen (kuviot. 2B-C ja kuvassa. S1B Tiedosto S1), joka oli arviolta annos 6,5 Gy vähentämiseksi selviytymisen 90%, paljon korkeampi kuin KY170R-shRNA1 soluja (-4,5 Gy).

(A) edustaja havaintoja stabiilien knockdovvn AKR1C3 in KY170R soluissa kolme riippumatonta shRNAs ja yli-ilmentyminen AKR1C3 in KY170 soluissa. (B) vaikutuksia AKR1C3 pudotus on KY170R soluissa ja AKR1C3 yli-ilmentymisen KY170 tuloksista säteilytys, annostellaan 0-8 Gy, määritetään pesäkkeiden muodostumista määrityksessä. Sekoituskoodin shRNA (scr.) Ja tyhjä pcDNA3.1 vektori toimi negatiivisena kontrollina, vastaavasti. (C) eloonjäämiskäyrät vertailuja vaikutuksen AKR1C3 herkkyyteen KY170R solujen (pudotus) ja (D) KY170 soluja (yli-ilmentyminen) säteilytys, määritettynä pesäkkeen muodostumista määrityksissä.

Vahvistus AKR1C3 vaikutusta vasteen kasvainsolujen säteilylle

sen varmistamiseksi, suojaava vaikutus AKR1C3 kuvattu RNAi, The säteilyresistenteille KY170R ja vanhempien KY170 soluja viljeltiin, kun läsnä oli 200 uM metyyli jasmonate (MJ) ja säteilytetään sitten. MJ on vakiintunut pieni molekyyli sen rakenne muistuttaa prostaglandiineja, substraatti aldo-keto reduktaaseista, ja toimii siten kilpaileva estäjä AKR1C3. Mej näyttää suuri teho solukkojärjestelmässä johtuu lisääntyneestä solujen sisäänoton kanssa IC

50 AKR1C3 at ~150 uM [22]. Havaittiin, että käsittely Mej myös merkittävästi parantaa vastetta KY170R solujen säteilytys ja tällaisia ​​MJ-välitteisen lisälaite ei havaittu KY170-soluissa (kuvio. S1C File S1). Näytti siltä, ​​että tukahduttaminen AKR1C3 toiminnan kautta kemiallinen estäjä voisi myös herkistää KY170R soluja IR. Lisäksi tutkimme, onko kohonnut ilmentyminen AKR1C3 yksin saattaa aiheuttaa KY170 solujen resistenttejä säteilytys. AKR1C3 ekspressiorakenne, pcDNA3.1-AKR1C3, vietiin vanhempien KY170 soluihin tuottaa AKR1C3-yli-ilmentävät transfektantit (Fig. 2A). Todettiin, että yli-ilmentyminen AKR1C3 in KY170 soluissa, noin 5-kertainen lisäys, saa enemmän pesäkkeitä hengissä kuin tapauksessa pcDNA3.1-transfektoitujen solujen päälle sama annos säteilytyksen (kuviot. 2B ja 2D). On selvää, että on kohonnut ilmentyminen AKR1C3 joka tekee sekä KY170R ja TE13R solujen olennaisesti vastustuskykyisiä säteilylle.

vaikutus AKR1C3 kasvuun säteilytetyn ksenograftikasvaimissa

Sitten tutkitaan, onko AKR1C3- välittämä solujen radioresistance oli myös operatiivinen ksenograftikasvaimissa. Kaksi ksenograftimalleja perustettiin implantoimalla KY170R-shRNA1 ja KY170R-scramble soluja, erikseen, nude-hiirissä. Huomasimme, että molemmat xenotransplant kasvaimia kasvoi nopeasti entisen kasvaa vain hieman hitaammin kuin jälkimmäinen (kuviot. 3A ja B), joka tukee solutason havainto, että AKR1C3 on paljon vähemmän vaikutusta kasvaimen kasvuun. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimääräisen tilavuus on noin 100 mm

3 (Fig. 3A), 20 ksenograftin hiirtä kustakin tyypistä valittiin, puolet alistettiin paikallisia säteilyä kerta-annos 15 Gy ja puoli jätettiin käsittelemättä . Löysimme kaikki ksenosiirrettyjä kasvaimista 10 säteilytetty KY170R-shRNA1 hiiret olivat herkkiä IR-hoidon 8 hiirillä tulossa lähes kasvaimeen ilmaiseksi 5 viikon kuluttua säteilytys (kuviot. 3A-B ja Fig. S2 File S1). Värjäämällä hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) paljasti puuttuessa kasvaimen mutta vain pieni kutistunut jäännös säteilytettyä vieraskudossiirteet (Fig. 3A). Sitä vastoin ei säteilytetty ksenograftikasvaimina KY170R-shRNA1 ja KY170R-scramble hiirillä kasvoi keskimäärin tilavuuteen 1000 mm

3 täysin lisääntyvien solujen (kuviot. 3A-B ja Fig. S2 File S1). Siinä tapauksessa, että hiirillä, joilla KY170R-sekoituskoodin vieraskudossiirteet, säteilytys johti huonoon lopputulokseen: kasvaimen kasvua alunperin tukahduttaa säteilytettäessä mutta sitä jatkettiin kahden viikon kuluessa (Fig. 3B); laaja kasvain ja vahva AKR1C3 ekspressiota havaittiin kasvainkudoksessa (Fig. 3A). Nämä tulokset on esitetty vaikutus AKR1C3 korkeus suojella ksenograftikasvaimissa säteilytyksestä, vahvistaa hypoteesia, jotka ovat peräisin solusta-pohjainen kokeissa.

(A) edustaja havainnot kasvusta ksenografti KY170R-sekoituskoodin ja KY170R-shRNA1 kasvaimia ja vasteet näiden kasvainten kerta-annosta (15 Gy) säteilytyksen suhteen kasvaimen tilavuuden, HE värjäystä ja immunokemiallisen värjäytymistä AKR1C3. (B) etenemisestä ajan kasvun KY170R-ryntäily ja KY170R-shRNA1 ksenograftikasvaimissa kanssa tai ilman paikallista IR hoitoon.

Mekanistiset selvittäminen AKR1C3 välittämän radioresistance

Tutkitaan mekanismi, jolla AKR1C3 kykenee sen vaikutus lopputulokseen IR vertasimme tasot solun ROS ja DNA-vaurioita, kriittinen välittäjiä ja välitön seuraus IR-solukuolema [23], in KY170R-shRNA1 versus KY170R-scramble solut. Havaittiin, että ennen säteilytystä noin 2-kertaa vähemmän ROS oli KY170R-sekoituskoodin kuin KY170R-shRNA1 solujen (kuviot. 4A-B). Säteilytettäessä taso ROS pysyivät alhaisina KY170R-scramble soluissa, mutta huomattavasti lisääntynyt KY170R-shRNA1 solujen eron ollessa lähes 3 taittuu (Fig. 4B). Yhtenevä samanaikainen AKR1C3 Knockdown ja ROS lisääntyminen säteilytettyä KY170R-shRNA solujen määrä pesäkkeitä fosfo-γ-histoni (kuviot. 4C-D), biomarkkereiden DNA-vaurion [24], jossa on paljon enemmän kromosomi taukoja ja brutto ydinaseiden poikkeavuuksia (kuviot. S3A-B File S1), oli huomattavasti korkeampi kuin säteilytettyä KY170R-scramble soluista 48 tunnin kuluttua säteilytyksen. Rinnakkainen koe, joka suoritettiin, kun läsnä on N-asetyylikysteiini (NAC), kemiallinen scavenger ROS [25] osoittivat, että IR-indusoidun DNA-vaurioita KY170R-shRNA1 soluja ja johdettu morfologisia ominaisuuksia on estetty (kuvio. 4E) . Olemme päätellä, että AKR1C3 on sama kyky kuin NAC lievittää oksidatiivisen stressin ja pienentävät siten säteilyn aiheuttamien DNA-vaurioita, jotka antavat radioresistance.

(A) edustaja mikroskooppinen näkymä kertyminen ROS KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 solut värjätty DHE. (B) kvantitatiivinen ROS tasoilla KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 solut ennen ja 24 tuntia sen jälkeen, kun IR annoksella 4 Gy. (C) edustaja mikroskooppikuvanto fosfo-γ-histoni pesäkkeitä KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 soluissa. (D) luonnehdintoja fosfo-γ-histoni in testattiin soluissa Western-blottauksella. (E) N-Asetyylikysteiini (NAC) -välitteisen huuhteluilman ROS klo IR annos 4 Gy. Kukin kvantitatiivinen mittaus suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kahdesti virhepalkin alle 25%.

retrospektiivinen tutkimukset radioresistance ja AKR1C3 ilmaisun ruokatorven karsinoomat

Me tehdään takautuva tutkimuksia voidaan arvioida merkitystä AKR1C3 liittyvien radioresistance ruokatorven karsinoomat. Ruokatorven kasvain näytteet, pieni pala kasvain näytteet otetaan Patologiassa, kerättiin 28 potilasta, jotka eivät voineet tai haluttomia hyväksymään leikkausta (taulukko S1 File S1). Nämä Tuumorinäytteet seulottiin kautta immunohistokemia määrittämiseksi ilmentymistasojen AKR1C3. Kaikki potilaat hyväksytty ruokatorven sänky alueella konforminen sädehoidon kanssa säteilyannos 58-64 Gy. Parantavat vaikutukset arvioitiin tarkastelemalla rinnassa CT yksi kuukausi sädehoidon jälkeen. Näistä potilaista 20 oli synnynnäisesti resistenttejä kanssa kasvainten kutistui alle 50%, kun IR; 8 olivat säteilylle ja tuli melkein kasvaimettomina upon IR hoitoon.

immunohistokemiallinen värjäys osoittivat, että 7 (35%) on säteilyresistenteille kasvain näytteet näytetään korkea (+++,

eli

75% kasvainsoluja AKR1C3 positiivisia), ja 8 (40%), joka näkyy väliportaan AKR1C3 ilmaisun (++,

eli

75% -50% tuumorisolujen sisältää AKR1C3 proteiini) (Fig. 5A-B ja Fig. S4 File S1). Loput 5 (25%) oli alhainen tai havaitsemattomia tasoja AKR1C3 ilmaisun (+/-,

so.

0-50% kasvainsoluista olisi AKR1C3 positiivinen). Sitä vastoin yksikään 8 säteilylle kasvainten näytteitä havaittiin ilmentävän korkea (+++) ja AKR1C3. Vain 3 (37%) ja säteilylle kasvain näytteet oli väliportaan AKR1C3 mutta 5 (63%) oli alhainen tai havaittavissa tasolla (+/-) ja AKR1C3 ilmentymistä (Fig. 5A-B ja kuviossa. S4 File S1) . On selvää, että vahva korrelaatio (p 0,017) välillä on kohonnut ilmentyminen AKR1C3 ja radioresistance ruokatorven syöpä, mikä tarkoittaa, että AKR1C3 voi olla prognostinen markkeri syövän sädehoidossa.

(A) Subjektiivinen ekspressiotasot AKR1C3 eli korkea (+++), keskitason (++), alhainen tai ei mitään (+/-), ruokatorven karsinoomat. (B) ekspressiotasoja AKR1C3 ruokatorven karsinooma 28 potilasta, jotka olivat synnynnäisesti herkkiä tai resistenttejä IR.

Keskustelu

ROS ovat keskeisiä välittäjiä solujen oksidatiivista stressiä, joka määrittää solujen redox ympäristölle [26]. Liian korkeiden ROS ovat kriittisiä IR-indusoidun solukuoleman. Säteilytetyt solut, erityisesti vaihtelevalla altistuminen, jotka tuottavat liikaa ROS, on olemassa tilassa oksidatiivisen piiritys, jossa selviytyminen edellyttää solut valtuuttaa niiden puolustusmekanismeja paeta hapettumista. On osoitettu, että superoksididismutaasi on ensimmäinen rivi antioksidanttipuolustuksen järjestelmien – katalysoi jakautuminen superoksidi vedyksi peroksidit, jotka sitten poistetaan katalaasi [23]. Kohonnut ilmaisuja Superoksididismutaasin 1 (SOD1) on raportoitu ihmisen gliooma ja näin annettu radioresistance [15], [16]. Glutationiperoksidaasi ja metioniini reduktaasi myös antioksidantti entsyymejä, jotka metaboloivat ROS [23].

Tässä tutkimuksessa raportoimme sattuma eriyttämisen AKR1C3 ilmaisun, solu ROS taso ja DNA-vaurioita säteilyresistenteille KY170R vs. ei-resistenttejä KY170 soluja. Ehdotamme, että AKR1C3 on solun osa osallistuu parhaillaan huuhteluilman solujen ROS, jakavat samat ominaisuudet kuin antioksidantti entsyymejä, ainakin

in vivo

paeta oksidatiivisia vaurioita (Fig. 6). Poistaminen ROS joko antioksidanttientsyymejä, AKR1C3 tai muut tunnistamattomat solutekijöitä, saattaa olla yhteinen mekanismi selittää radioresistance. Toisin glutationiperoksidaasi (GPX), peroxiredoxin (TPX) ja superoksididismutaasi (SOD), joita löytyy olennaisesti kaikki elävät organismit, AKR1C3 ilmentyy suhteellisen alhaisena useimmissa normaaleissa kudoksissa paitsi eturauhasen ja maitorauhasen [27], [28 ]. Siten ekspressiotaso AKR1C3 kasvainsoluissa voi olla hyödyllistä biomarkkerina ennustamiseksi solujen radioresistance.

AKR1C3 on saanut laajaa huomiota, koska sen voimakkaan pelkistävän aktiivisuutta erilaisia ​​substraatteja. Se katalysoi NADPH-riippuvainen väheneminen endogeenisen aldehydien ja ketonien vastaaviksi alkoholeiksi [28], [29]. Se myös katalysoi prostaglandiini D

2 (PGD2) ja 11β-PGF2, PGH2 jotta PGF2a ja kinoni katekoliksi [30].