Krooninen sairaus

tiivistelmä

Misexpression kasvutekijöiden, etenkin niitä, jotka liittyvät kantasolujen kaltainen fenotyyppi, on usein havaittu useissa syöpätyypeissä. On havaittu vaikuttavan parametrien taudin etenemisen, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ylläpito erilaistumattoman fenotyypin ja modulaatio immuunijärjestelmää. GDF3 on TGFb perheenjäsen liittyy pluripotenssia ja erilaistumisen alkion kehityksen aikana, joka on aiemmin raportoitu uudelleen ilmaistaan ​​useissa syöpätyyppeihin. Kuitenkin sen rooli kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen ei ole selvitetty vielä. Tässä tutkimuksessa tulkita roolin GDF3 käytettäessä

in vitro

mallin syövän kantasoluja, NCCIT soluja. Klassisen lähestymistapa tutkia proteiinin toiminnan yhdessä korkean suoritustehon tekniikka transcriptome analyysin ja erilaistumisen määrityksiä arvioimme GDF3 mahdollisena terapeuttisena kohteena. Havaitsimme, että GDF3 voimakkaasti indusoi paneeli liittyvien geenien erilaistumista, mukaan lukien useita voimakkaita tuumorisuppressorien, vaikuttamatta proliferatiivinen kapasiteetti. Lisäksi raportoimme ensimmäistä kertaa suojaava vaikutus GDF3 vastaan ​​retinoiinihappo aiheuttamaa apoptoosia solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia. Tutkimuksemme viittaa siihen, että esto GDF3 yhdistettynä retinoidihappoherkkä hoidossa kiinteiden syöpien on vakuuttava suunta lisätutkimuksia, mikä voi johtaa uudelleen suunnitteluun syövän erilaistumisen hoitomuotoja.

Citation: Tykwinska K, Lauster R, Knaus P, Rosowski M (2013) Growth ja erilaistumistekijään 3 indusoi liittyvien geenien Eriyttäminen mallin syövän Kantasolut ja suojaa niitä retinoiinihappo indusoiman apoptoosin. PLoS ONE 8 (8): e70612. doi: 10,1371 /journal.pone.0070612

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 helmikuu 2013; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 12 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Tykwinska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluaa todeta, että tämä työ on rahoittanut Technische Universität Berlin ja DFG kautta Berlin-Brandenburg School regeneratiivisen Therapies GSC 203. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu käsikirjoitus.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSC) muodostavat pienen populaation kasvaimeen aloittamista soluja, joilla on laaja itseuudistumisen kyky, kyky tuottaa ei-tuumorigeeniset end solujen ja multidifferentiation potentiaalia. CSCS uskotaan olevan pääsyy kemoterapian resistenssin ja taudin uusiutumisen. Mukaan CSC hypoteesin, valvoa tätä erittäin proliferatiivisen soluosastoon määritellään perimmäinen parannuskeinoa syöpään [1] – [3].

On ollut käynnissä tutkimuksia määrittämään CSC markkereita

in vivo

, mutta ei ole luotettavaa, yleinen yhdistelmä on löydetty toistaiseksi. Sen sijaan Ben-Porath [4] ja muut [5], [6] osoittaa, että yhteinen piirre histologisesti huonosti eriytetty kasvaimet – jotka osoittavat yleensä pahin ennusteiden – on ES-kaltaiset allekirjoitusta, kuten ilmaus Nanog, Oct4, Sox2 ja niiden tavoitteita [7], [8]. Poikkeava ilmentyminen kantasolujen tekijät kasvaimiin yllä aggressiivinen fenotyyppi ja parantaa todennäköisyys etenemisen ja etäpesäkkeiden [9].

Niistä valtava määrä syöpäsolujen linjojen käytettävissä tutkia syövän biologian

in vitro

, alkion sinoomasolulinjoja näyttää ES-kaltaiset allekirjoitusta, kuten ilmaus tärkeimmät pluripotenttisuuden-verkkoon liittyvä transkriptiotekijöitä, ja eivät ole vain pysty erottamaan

in vitro

, mutta ovat myös erittäin tuumorigeenisia

in vivo

. Siksi alkion karsinooma (EY) solulinjat, odotetaan olevan sopiva malli CSC [10], [11].

Kasvuun ja erilaistumista tekijä 3 (GDF3) hyväksytään laajasti pluripotenttisuus merkki, kuten se on suora transkription kohteena Nanog [12]. Kerrottiin säädellä sekä suurta ominaisuudet alkion kantasoluja, ylläpito erilaistumattoman fenotyypin ja erilaistumista mahdollisia [13].

Yhdessä muiden kantasolujen merkkiaineita, GDF3 osoitettiin ilmaistaan ​​useissa syöpä tyyppejä, kuten rintasyöpä [14], [15], melanooma [16], seminooma [15] ja kivesten itusolukasvaimet [17]. Vaikka Nanog, Oct4 ja Sox2 tunnistettiin stemness edistäviä transkriptiotekijöitä, rooli GDF3 edelleen huonosti. Julkaisemat tulokset muiden tähän mennessä, jotka koskevat otaksuttu rooli tämän molekyylin syöpäbiologiassa ovat ristiriitaisia. Osoitettiin, että GDF3 estää proliferaatiota Rintasyövän MCF7 [14], mutta täydentää leviämisen B16 myelooma ja voi edistää neuronaalista erilaistumista PC12-solujen [18].

GDF3 kuuluu voimakas kasvutekijä perhe Transforming Growth Factor β (TGFb). Jäsenet TGFb perheensä luun morfogeneettinen proteiinit (BMP: t), kasvu- ja erilaistumistekijöitä (GDF: t) ja TGFb, näyttää selvästi, joskus vastakkaisia ​​vaikutuksia kohdesoluihin, riippuen solujen yhteydessä muut ligandit läsnä, annos ja identiteetti sytokiinien [ ,,,0],19].

GDF3 oli raportoitu olevan osallisena molemmissa kanonisen reitit käynnistyvät TGFb perheenjäsenten: (1) ekstrasellulaarinen esto BMP [13] ja (2) induktion Smad2 /3 fosforylaation johtuvat sitoutumisesta Activin reseptoreihin tyypin IB tai IC (ACVRIB, ACVRIC) ja aktiviini reseptoreihin tyyppi IIA tai IIB (ACVRIIA, ACVRIIB) yhteistyössä pakollinen co-reseptorin teratokarsinoomasolut kasvutekijän 1 (TDGF1) [20], [21].

syntymässä rooli Smad2 /3 signalointiryöpyn on jo osoitettu haiman, rinta-, maha-, munasarja-, iho- ja monet muut syöpätyyppeihin. Kuitenkin molemmat, aktivointi ja esto on Smad2 /3-reitin voi olla myönteisiä vaikutuksia taudin puhkeamista [22] – [24]. Näin ollen kanne kunkin ligandin käynnistää tämän reitin on huolellisesti tutkittu ja arvioitu.

rohkaisemina näitä tosiasioita, me omaksuneet haaste kattavasti vaikutusten tutkiminen GDF3 signaloinnin mallissa CSC rivi transcriptome profilointi ja erilaistumista määrityksiä ja arvioida niiden potentiaali terapeuttisena kohteena. Olemme havainneet, että GDF3 säätelee geenien ilmentymistä mukana erilaistumiseen, mutta ei vaikuta proliferatiivista kapasiteettia erilaistumaton CSC. Lisäksi osoitamme, että GDF3 suojaa CSC päässä indusoiman apoptoosin retinoiinihapon, vain kliinisesti hyväksytty cyto erilaistumista, syöpälääkkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja erilaistumista

NCCIT ja HEK293T-soluja (American Type Cell Collection) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, jossa oli 4,5 g /l glukoosia (PAA Laboratories, Itävalta), joka sisälsi 10% FBS: ää (PAA Laboratories, Itävalta) ja penisilliini-streptomysiiniä (PAA Laboratories , Itävalta).

tuottaa GDF3 pudotus solulinjoja, shRNA oligonukleotidit kohdentamiseksi GDF3 syntetisoitiin TibMolBiol (TibMolBiol, Saksa) ja kloonattiin lentivirusvektorikirjastojen pLL3.7 (addgene, USA). Kaikki konstruktit sekvensoitiin (GATC, Saksa) ennen käyttöä. Yhdessä 2 pakkaus plasmidien PAX2 ja VSVG virus on tuotettu kalsiumfosfaatin transfektion 293T-solut. Väliaine, joka sisälsi viruksen kerättiin, 20 x konsentroitiin Spin® FX® UF Concentrator (Corning, Saksa) ja sekoitetaan NCCIT solujen lisäämällä 10 ug /ml polybreeniä (Sigma, Saksa). Väliaine vaihdettiin säännöllisesti keski- seuraavana päivänä.

erilaistumisen indusoimiseksi, NCCIT soluja käsiteltiin 10 uM all-trans-retinoiinihappo (Sigma, Saksa) 14 päivää.

Microarray-analyysi

transcriptome analyysi ihmisen genomin CGH Microarray 44K (Agilent Technologies, USA) käytettiin mukaisesti valmistaa protokollan. Lyhyesti, eristetyistä RNA leimattiin Low RNA Input loisteputki Linear Amplification Kit (Agilent Technologies, USA), hajanaista, sekoittaa valvonnan tavoitteet ja hybridisoitiin yön yli. Objektilasit pestiin sitten ja skannattiin 5 pm resoluutio käyttämällä DNA-siru skanneri (Agilent Technologies, USA). Ominaisuudet uutettiin kuva-analyysi työkalu 6.1.1. (Agilent Technologies, USA) oletusasetuksilla. Tietojen analysointi suoritettiin Rosetta Informatics Platform resolveriliitäntä rakennettu 4.0.

yliedustus analyysi tehtiin lataamalla geeni, joissa on p-value≤0.05 ja taita change≥1.5 jotta Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID ) v6.7 [25] ja suorittamalla Gene Onthology analyysin avulla merkintä Panther_BP_ALL.

Microarray data (tulonumero GSE44670) on toimitettu NCBI GEO tietokantaan. Aineisto koostuu 3 olosuhteissa (A-C, kuvataan tarkemmin GEO tietokantaan ja tulokset osa), jossa yksi biologinen toisinto kussakin. Käsittelemätön kontrolli A ja B edustaa eri näytettä.

Lämpöä kartta tuotettiin CIMminer, freeware kehittämä Genomics ja bioinformatiikan Group, laboratorio Molecular Pharmacology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute . Vain koettimien p≤0.05 ja taita muutos ≥1.5 joko mikrosirujen A tai B valittiin. Jos p 0,05, taita muutos oletusarvoisesti asetettu 1 (asettaa mustan värin lämpöä kartalla).

eristäminen nukleiinihappojen, cDNA-synteesi ja qPCR

eristäminen RNA suoritettiin käyttäen NucleoSpin® RNA II kit (Macherey- Nagel, Saksa), seuraten ohjeita.

Käänteinen transkriptio mRNA suoritettiin käyttäen TaqMan® käänteistranskriptio reagenssit cDNA kit (Applied Biosystems, USA), kohti valmistajan ohjeet.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä 1 ui cDNA: ta, 1 ui nalliseoksesta ja SensiFAST ™ SYBR Ei-ROX kit (Bioline, Saksa), 96-kuoppaisen PCR-levyjä (Biozym Scientific, Saksa), ja luettiin Stratagene MX 3005P ™ Multiplex kvantitatiivinen PCR System (Agilent Technologies, USA). Alukkeet tilattiin TIBMolBiol (Saksa).

Pohjamaali luettelo löytyy taulukossa 1.

lusiferaasianalyysissä

BMP-reagoiva konstruktio BRE-luc [26] ja Smad sitova elementti rakentaa SBE-luc olivat ystävällisiä lahjoja prof P. Ten Dijke (Leiden University Medical Center). CAGA-luc oli ystävällinen lahjoitus Prof. P. Knaus (Freie Universität Berlin). Solut ympättiin, transfektoitu TurboFect (Thermo Scientific, Saksa, menettely mukaan valmistajan protokollan) ja 24 tuntia myöhemmin ruokittu 3 h seerumittomassa väliaineessa ja sen jälkeen stimuloitiin vähintään 20 h mielenkiintoinen ligandi (rhGDF3, rhNodal ja rhBMP2 ostettiin R B, vastaavasti). Microarray C tutkimme vaikutuksia GDF3 Knockdown CSC mallissa solulinjassa.

arvioimiseksi microarray data, vain täplien p-arvo ≤0.05, taita muutos ≥1.5 ja virallinen geeni merkintä sisällytettiin (taulukko 3). Tämä kaventunut määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien 390 ja 421 vuoksi stimulaation matala ja korkea annos GDF3. Säänneltyjen selostukset korreloi positiivisesti vahvuus Smad2 /3 signaloinnin aiheuttama sovellettu ligandi (t) (vertaa kuvio 1 E). Näkyvin transkription muutokset 2075 differentiaalisesti geenien havaittiin seurauksena GDF3 pudotus. Vaikka johtuu GDF3 hoitoon enemmän geenejä voimistuvan kuin vaimentua (mikrosiruja A B, taulukko 3), päinvastainen kuvio näkyy seurauksena GDF3 taintumisen (microarray C, taulukko 3).

GDF3 säädöksillä annoksesta riippuvalla tavalla

Vastatakseen biologisen roolin GDF3 geenit säädellään johtuen GDF3 stimulaation ja taintumisen (taulukko 3) luokiteltiin perusteella niiden biologista funktiota. Tätä varten geenien virallisten geeni nimet poimittiin kustakin microarray ja yliedustus analyysi suoritettiin tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) v6.7 [25]. Tämä menettely mahdollistaa arvioitaessa, onko jokin funktionaalisesti määritelty ryhmä geenejä edustaa odotettua enemmän sattumalta geenin sisällä listan [32]. Geenit säätelevät GDF3 luokiteltiin pääryhmään kuten kehittyvään prosesseja, mesodermi ja ektodermi kehitys, neurogenesis ja signaalitransduktion (taulukko S1 ja taulukko 4). 15,3% ja 18,2% geenien säädellään mikrosiruja A ja C, vastaavasti, liittyivät kehitysprosesseja. Asetus geenien kanssa toimivat ectoderm kehittämiseen ja neurogenesis todettiin päälle mikrosiruja A (6,5% ja 6,5%) ja C (6,5% ja 5,8%), mutta ei B. Lisäksi joukossa geenejä säätelee GDF3 Knockdown 5,3% liittyivät kanssa Mesodermi kehitykseen. Noin. 25% geenien kaikista mikrosiruja luokiteltiin signaalitransduktion. Overrepresetation analyysi paljasti myös, että pieni, mutta merkittävä määrä (p≤0.05) liittyvien geenien angiogeneesiin microarray C (0,9%) (taulukko S1) säännellään Smad2 /3 signalointi.

stimulointi NCCIT solujen eri pitoisuuksilla GDF3 ja GDF3 knockdown vaikuttaa eri Smad2 /3 signalointi voimaa (kuva 1 E). Edelleen vertailla näitä vaikutuksia, olemme analysoineet kvantitatiivinen päällekkäisyys transkription muutosten stimuloiduissa soluissa sekä osajoukot geenien yksinomaan säätelee kunkin koetilalle (kuva 3). Uutettu geeni luettelot alistetaan seuraavaksi yliedustukseksi analyysiin. 48 geenit olivat yleisesti säänneltyjä kaikissa kolme ehtoa. Kuitenkin vain 9 niistä oli huomattavasti rikastettu niiden biologinen funktio luokkaan solun pinnan reseptorin välitteiseen signaalin siirtoon. Niistä 2075 ja 421 geenit differentiaalisesti säätelee GDF3 Knockdown tai korkea pitoisuus GDF3, vastaavasti (A C), 129 transkriptit säännelty kummassakin olosuhteissa. Nämä pääasiassa rikastuneet luokkiin kehittämiseen liittyvien ja sukua sitoutuminen: kehitysprosesseja, Ektodermi kehitys ja neurogenesis. Kuitenkin, kun yleisesti geenien jätettiin geenipoolin ja vain geenejä säädellään yksinomaan lisääntynyt (mikrosirujen A) tai häiritsi (microarray C) Smad2 /3 signaloinnin analysoitiin, suuria eroja vaikutus useisiin biologisiin prosesseihin havaittiin. Vaikka suuri annos GDF3 vaikutti vain prosessoi liittyvän signalointi (solun pinnan reseptorin välitteiseen signaalin siirtoon, solujen viestintä, ligandivälitteinen signalointi, signaalitransduktion) ja neurogenesis The GDF3 pudotus vaikuttaa edelleen sarjaa geenien osoitettu paitsi signalointi, kehitysprosesseja ja ektodermi kehitys, mutta myös mesodermi kehitystä ja hematopoieesia.

Venn kaavio, joka kuvaa päällekkäisyyttä mikrosirut A, B ja C. Vain koettimista mikrosiruja p-arvo ≤0.05 ja taita muutos ≥1.5 käytettiin tässä analyysi. Osajoukkoja geenien ilmoitettu otsikot värikoodatut laatikot alistettiin geeni ontologian yliedustettuina analyysi ja valinta pääasiassa rikastunut biologisia prosesseja on listattu (Täydellinen luettelo löytyy taulukosta S1). Biologisia prosesseja lueteltu myös taulukossa 4 tulostetaan lihavoitu. A – stimulaatio 300 ng /ml rhGDF3, B – stimulaatio 100 ng /ml rhGDF3, C – GDF3 knockdown.

Samanlaista menetelmää käytettiin analysoida geenien toimintaa moduloidaan korkean ja matalan annokset GDF3 (kuvio 4A). 89 geenejä säännelty kummassakin olosuhteissa, mutta arviointi geenin ontologian määritteitä Tähän ryhmään ei antanut tilastollisesti merkitsevä (p≤0.05) tulokset. Totesimme selviä eroja biologisissa prosesseissa säätelevät eri pitoisuuksia GDF3. Korkea GDF3 keskittyminen vaikutti transkription useiden geenien liittyy ectoderm kehittämiseen, neurogenesis ja signaalitransduktion, kun taas 100 ng /ml GDF3 moduloitu vain prosessi signaalitransduktion. Lämpöä kartta kertamuutoksia esiin useita ryhmiä geenien mahdollisesti säädellä eri tavoin (kuva 4B) korkea ja matala pitoisuus GDF3.

. Venn-kaavio, joka havainnollistaa rajat analyysi yleisesti geenien vuoksi 300 ng /ml rhGDF3 (Microarray A) ja 100 ng /ml rhGDF3 (Microarray B) stimulaation NCCIT soluja. Vain geenit p-arvo ≤0.05 ja taita muutos ≥1.5 olivat mukana. B. Heat kartta kertaiseksi muutoksia geenien säätelee korkean ja matalan annoksen GDF3 (Microarray A B). Geenejä kertainen muutos ≥1.5 ja p-arvo ≤0.05 ainakin yksi mikrosiruja otettiin mukaan. Mustat palkit osoittavat kertaluokkamuutos 1,5 tai p-arvo 0,05. Taitteen Muutos värein vihreästä punaiseksi (ks asteikko bar).

kolme ehtoa sovelletaan leikellä vaikutusta GDF3 on NCCIT jotka käsittävät (A) suuren annoksen GDF3 maksimaalisesti aktivoida Smad2 /3-reitin, (B) pieniannoksisen GDF3 keskivaikean Smad2 /3 signalointi ja (C) keskeytymisen GDF3 opastinjärjestelmillä GDF3 knockdown syntyy eri GDF3 signalointi voimaa. Tuloksemme osoittavat, että modulaatio Smad2 /3 signalointi GDF3 stimulaation tai häiriöitä GDF3 signalointireitin koskee useita biologisten prosessien kuten kehittyvään prosesseja, Ektodermi kehitys, neurogenesis ja signaalitransduktion sen transkription tasolla. Lisäksi vakaa GDF3 knockdown johti geenien induktioon liittyy Mesodermi kehityksen ja hematopoieesin NCCIT soluissa. Lisäksi GDF3 moduloida transcriptome on NCCIT solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Jopa pienellä annoksella GDF3 (microarray B) muutti merkittävästi transcriptome kohdesolujen. Kuitenkin toisin kuin suuren annoksen GDF3, pienellä annoksella ei ollut vaikutusta sääntelyn geenien liittyvät kehittäminen.

GDF3 indusoi ilmentymistä eri geenejä, jotka liittyvät signaalitransduktion ja kehitys

vahvista microarray tuloksia, päätimme useiden geenien liittyvät signaalitransduktion ja kehitysprosesseja ja validoitu niiden ilmaisun yhteydessä GDF3 stimulaation qPCR. Kokoaminen microarray ja qPCR tulokset on esitetty taulukossa 5, jossa esitetään yhteenveto validointi microarray kokeilun.

Valitsemalla ehdokkaita GDF3 kohdegeenien keskityimme lähinnä jäseniä TGFb perheen ja transkriptiotekijöitä, jotka voi toimia pääkytkiminä solukohtalon päätöksiin.

ilmentyminen

LEFTY2

, tunnettu Smad2 /3 kohde alkion kantasoluja [33], oli voimakkaasti voimistuvan matala ja korkea annos GDF3 (kuvio 5A) ja toimi positiivisena kontrollina stimulaatiota.

A-G. Vaikutus stimulaatio eri GDF3 pitoisuuksilla transkriptioon useiden geenien säädellään mikrosiruissa A B. n = 5. H. vaikutus GDF3 knockdown transkriptioon useiden geenien säädellään microarray E. n = 3. Ilmaus mitattiin qPCR, tulokset esitetään

GAPDH

suhde ja normalisoitiin stimuloimattomat solut (A-G) tai solujen transdusoitu salattu-vektorin (H). P-arvot ovat pienempiä tai yhtä suuri kuin 0,05 pidettiin merkittävinä. (*) Tarkoittaa, p≤0.05 ja (**) p≤0.01.