Krooninen sairaus

tiivistelmä

ubikitiinispesifinen proteaasin 42 (USP42) kuuluu deubiquitinating entsyymien (Dubs). Korjauskierrosta DUBS on osallisena patogeneesissä erilaisia ​​kasvaimia. On kuitenkin olemassa muutamia tutkimuksia ilmaisun ja biologisen toiminnan USP42 mahasyövän (GC). Tässä ilmauksen tasot USP42 olivat merkitsevästi korkeammat GC kudoksissa kuin muilla syöpäkudoksissa. USP42 ekspressio korreloi merkitsevästi kasvaimen kokoa, TNM-luokitus, imusolmuke etäpesäke ja elinaika potilailla, joilla on GC. Lisäksi USP42 hiljentäminen kahdessa GC solulinjoissa, AGS ja MKN-45, erityisesti esti solujen lisääntymistä, mutta stimuloi G1 vaiheen pysähtymisen. Proteiinit edistävät solusyklin etenemisen (sykliini D1, sykliini E1 ja PCNA) on säädellä vähentävästi USP42-tukahdutetaan solujen. Lisäksi esto USP42 GC soluissa heikentynyt soluinvaasiota kautta vaikuttavia ilmaus matriksin metalloproteinaasien (MMP) ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) sääntelyviranomaisten. Lopuksi USP42 yli-ilmentyminen saattaa olla mahdollinen prognostinen merkkiaine GC, säädellä selviytymisen ja invasiivisia ominaisuuksia GC, ja sillä saattaa olla uusia terapeuttisia molekyylikohteena tämän kasvain.

Citation: Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Zhu Q, et ai. (2016) yli-ilmentyminen ja biologinen toiminta ubikitiinispesifinen Proteaasin 42 mahasyövän. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10,1371 /journal.pone.0152997

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 29 joulukuu 2015; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2016; Julkaistu: 31 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuki tieteellinen tutkimus Project Shanghai Municipal komission terveys- ja perhesuunnittelu (20124321).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on viidenneksi yleisin syöpä [1] ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuolema [2]. Tällä hetkellä tiedossa merkittäviä riskitekijöitä GC sisältävät Helicobacter pylori (H. pylori) -infektio, elinympäristö, ruokavalio, geneettiset ja immuunijärjestelmän tekijät, ja kroonisten vatsa sairaudet [3]. Ennuste potilailla GC on yleensä huono, koska kasvain on usein etäpesäkkeitä ja useimmat potilaat ovat vanhuksia (mediaani-ikä on yli 70 vuotta) ajankohtana, jona se on diagnosoitu. 5 vuoden eloonjäämistodennäköisyys GC on raportoitu olevan alle 25% [4]. On erittäin kliinistä merkitystä tunnistaa herkkä ja ennustavia markkereita GC, tutkia molekyylitason mekanismeja GC kehitystä, ja tutkia uusia hoito tavoitteita tämän taudin.

ubikitiinispesifinen proteaasin 42 (USP42) on deubiquitinating entsyymi (DUB), joka ilmentyy laajalti erilaisissa ihmisen kudoksissa [5]. Ubikitinaatiosta palautuva translaation jälkeisen modifikaation, on mukana useita solun prosesseissa, kuten solusykliä, DNA: n korjaukseen ja apoptoosin [6, 7]. Lisääntyvä todistusaineisto on osoittanut, että muuttunut DUB toiminto on osallisena patogeneesissä erilaisia ​​kasvaimia [8]. Yliekspressio USP9X, USP9Y, USP10 ja USP25 paljastui rintasyövän kaksiulotteisella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja proteomiikka-analyysi [9]. Muutama tutkimukset ovat osoittaneet, että USP22 yliekspressio edistää syövän etenemistä ja huonon ennusteen gliooma, haimasyöpä, kohdunkaulan syövän ja keuhkosyövän [10-13]. USP42 on aiemmin todettu järjestellä uudelleen akuutti myelooinen leukemia [14]. Kuitenkin tietomme, tutkimusta ei ole tehty sen ekspressiokuvio ja biologisia toimintoja USP42 GC.

Esillä olevassa tutkimuksessa, USP42 mRNA-tasot GC kudoksissa havaittiin olevan huomattavasti korkeampi tasoa kontrollien . Lisäksi kliinisiä piirteitä analyysi osoitti, että ilmentymistaso USP42 liittyi eloonjäämisaste GC potilaista. Sitten levitetään RNA-interferenssi (RNAi) tekniikka kaataa ilmaus USP42 kahdessa GC solulinjoissa (AGS ja MKN-45-solut), ja tutki leviämisen, solusyklin ja invasiivisen kapasiteetti molemmissa solulinjoissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että USP42 on voimakas onkogeeni GC, antaa meille tulevaisuuden tavoite GC terapia.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Yhteensä 90 GC leikkauspotilaiden laitoksella General Surgery, kansan sairaalassa, Pudong New District (Shanghai, Kiina) helmi 2007 ja kesäkuun 2009 on ilmoittautunut tässä tutkimuksessa. Mediaani-ikä potilailla oli 56 vuotta (vaihteluväli: 34-68 vuotta). Kaikki potilaat saivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimus hyväksyy riippumaton eettinen komitea Shanghai Pudong District Kansan sairaalassa (Shanghai, Kiina). Kasvain kudosnäytteitä saatiin kaikki GC potilailla. Samaan aikaan, 42 sovitettu ei-tuumori- näytteiden sijaitsee 3 cm: n päässä kasvain kerättiin. Kaikki kirurgiset näytteet jäädytettiin nestetypessä heti kirurgisen resektion, ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.

Solulinjat

johdetut solulinjat ihmisen mahasyöpä, mukaan lukien AGS, SGC-7901, BGC-823, MKN-28 ja MKN-45 saatiin Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640 -alustassa (Gibco, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

hiljentäminen on USP42 pieniä häiritseviä RNA (siRNA) B

siRNA spesifinen ihmisen USP42 (5′-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ’), valittiin. Ei-spesifinen sekoituskoodin siRNA-sekvenssin (sinc) käytettiin negatiivisena kontrollina. SiRNA: t transfektoitiin transientisti AGS tai MKN-45-soluissa käyttämällä lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeen. Määritykset suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteiskopiointireaktio suoritettiin satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja SuperScript Käänteistranskriptaasilla (Invitrogen). Saatu cDNA: ta käytettiin templaattina real-time PCR suoritettiin standardin SYBR Green PCR -kittiä (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) -lämpösyklilaitteella. GAPDH käytettiin kontrollina tulon RNA tasolla. Kaikki reaktiot suoritettiin käyttäen seuraavia sykliparametrit, 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 45 s. Voit tarkistaa tietyn tuotteen vahvistusta, tuotteet alistettiin sitten dissosiaatiokäyrä analyysiä. Geeniekspression laskettiin käyttäen Δ Ct menetelmällä. Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa kolme toistoa. Sekvenssit spesifiset alukkeet olivat seuraavat: USP42 mRNA eteenpäin, 5’ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ’, ja USP42 mRNA-käänteinen, 5’ACGCAGATTGGAACAGAG-3’; GAPDH mRNA eteenpäin, 5’CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ’, ja GAPDH mRNA kääntää, 5’CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’.

Vasta-aineet ja Western blotting

Vasta-aineita CyclinD1, E-kadheriinin, β kateniinin, Snail1 ja GAPDH ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Vasta-aineita USP42, CyclinE1, PCNA, ja MMP-9 olivat Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-MMP-2 oli peräisin Epitomics (Burlingame, CA, USA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet olivat peräisin Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kiina).

Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sitten hajotettiin esijäähdytetty radioimmunosaostuksella (RIPA) määrityspuskurissa jäillä 10 min. Poistamisen jälkeen solujätteestä sentrifugoimalla (12000 g, 10 min), proteiinin pitoisuus supernatanteissa mitattiin BCA-proteiinin iinianalyysikitissä (Thermo Fisher Scientific). Jälkeen keittämällä 5 minuuttia näytepuskurissa, joka, yhtä suuri määrä proteiineja eri ryhmien erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Millipore, Bredford, USA). Kun oli salvattu 5% rasvaton maito, kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli samalla sekoittaen, jonka jälkeen inkuboitiin johdetun vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa samalla sekoittaen. Reaktiivisen proteiinin havaittiin sitten käyttäen ECL chemiluminescence-järjestelmän (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Soluproliferaatiomääritys CCK-8

CCK-8 määritys suoritettiin standardimenetelmillä 96-kuoppaisilla levyillä. Lyhyesti, 3 x 10

3-soluja ympättiin per kuoppa. Ilmoitetuilla ajankohtana, CCK-8 (10 ui 100 ul: ssa RPMI-1640-väliaine), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 h. Absorbanssi 450 nm: ssä havaittiin käyttäen mikrolevylukijaa.

In vivo kasvainta nude hiirimallissa

Eläinkokeet hyväksyttiin ja suoritettiin ohjeiden Animal Care ja käyttö komitean Shanghai Pudong District kansan sairaalassa (Shanghai, Kiina). Kaksitoista BALB /c-nude-hiiriin vuotiaita 4-5 viikkoa vanhoja (SLAC Animal, Shanghai, Kiina) ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa käyttäen laminaarista ilmavirtauksen telineeseen ja oli jatkuva vapaa pääsy steriloitu ruokaa ja autoklavoitiin vettä. Kokeet aloitettiin sen jälkeen 1 viikon akklimatisaatio. AGS-solut (2 x 10

6) injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen nude-hiirten luoda ksenografti kasvain malli. Kymmenen päivää ihonalaisen injektion jälkeen, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 6 /ryhmä) ja IV injektoitiin USP42 siRNA tai sinc sisältävät formulaatiot kahdesti viikossa. Lyhin ja pisin halkaisija kasvaimen mitattiin mittaharpilla 4 päivän välein, ja kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin käyttäen seuraavaa standardikaavassa: (lyhin halkaisija)

2 × (pisin halkaisija ) x 0,5. 36 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen sijoitus, hiiret tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvaimet otettiin talteen. Märkä painot kunkin kasvaimen tutkittiin. Kokeen aikana, kaikki Hiiriä tarkkailtiin joka päivä. Yksikään hiiri ei kuollut ennen kokeellista päätepisteen.

Solusyklianalyysiä

Solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa PBS: ssä ja kiinnitettiin yön yli 4 ° C: ssa jääkylmää 70% etanolia. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: ssä, ja inkuboitiin propidiumjodidilla (PI) värjäämällä puskuria (5 ug /ml PI: n ja 0,25 mg /ml RNase, Sigma, St. Louis, MO, USA) huoneen lämpötilassa 30 min. Sitten solut analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prosenttiosuudet solut G0 /G1, S ja G2 /M vaiheessa määritettiin PI-värjäyksellä.

Cell invasion määrityksiä

mittaamiseksi kennon invasiivisia potentiaalia solujen Transwell määritykset tehtiin käyttäen Matrigel päällystetty Boyden kammio (BD Biosciences). Solut seerumin puutteessa yön yli, otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen seerumia. Solut (1 x 10

5) Sitten lisättiin ylempään kammioon. Joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, solut yläpinnan kalvon poistettiin täysin käyttäen puuvilla vihjeitä. Muuttajan solut kiinnitetty alapintaan kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Määrä siirtynyt solujen alapinnalle kalvon laskettiin mikroskoopilla viidellä 100 x.

Bioinformatics analyysi

Mahasyöpää aineistoja ladattiin NCBI Gene Expression Omnibus tietokanta (Access ID: GSE26253) ja The Cancer Genome Atlas (TCGA). Jotta voitaisiin edelleen tutkia biologisia reittejä mukana mahasyövän synnyssä kautta USP42 koulutusjakson, Gene asettaa rikastus analyysi (GSEA) suoritettiin käyttäen julkisesti saatavilla ohjelmiston Broad Institute MIT (https://www.broad.mit.edu/gsea/ohjelmisto /software_index.html) kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kunkin geeniperimä, GSEA määrittelee rikastus pisteet (ES), joka heijastaa korrelaatio geeniperimä ja näytteen.

Tilastollinen

Kaplan-Meierin eloonjääminen analyysi suoritettiin käyttäen MedCalc ( Mariakerke, Belgia). Tilasto-Package for Social Sciences (SPSS) versio 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin muiden tilastollista analyysiä. Kokeiden tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan arvoja testi- ja kontrollinäytteiden. Chi-square testiä käytettiin tunnistamaan erot kategorisen muuttujia. Tilastollisesti merkittäviä eroja määritellään siten, että

P

0,05.

Tulokset

ilmentäminen USP42 mahasyövän

Tutkiakseen ilmentymisen USP42 GC, suoritimme reaaliaikainen PCR-analyysi GC (n = 90) ja noncancerous kudosnäytteistä (n = 42). Suhteellinen ilmentyminen USP42 mRNA verrattuna GAPDH laskettiin käyttäen △ Ct menetelmällä. On selvää, USP42 mRNA: n ekspressio oli suurempi GC kudoksissa kuin noncancerous kudoksissa (kuvio 1A). Edelleen vahvistaa tämän havainnon, me uudelleen analysoitiin microarray tietoja TCGA riippumattoman GC aineisto. Kuvio 1B osoitti selvää yliekspressio USP42 ihmisen GC kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin.

. MRNA-tasot on USP42 suhteessa GAPDH ilmentymisen GC ja ei-tuumori- kudoksiin määritettiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä (

P

0,0001). B. ilmentyminen USP42 GC ja normaaleissa kudoksissa perustuvat TCGA aineisto (

P

0,0001). C. Survival analyysi osoitti, että potilailla, joilla on USP42-korkeampi ilmentyminen kasvaimissa on pienempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla USP42-alempi lauseke kasvaimet (

P

= 0,0141). D. Survival analyysi GSE26253 aineisto.

Käyttäen keskiarvo 2

-ΔCt (0,550) kuin cut-off välillä matalan tason ja korkean tason USP42 mRNA ilmaisun, 90 potilasta oli luokiteltu alhainen ( 0,550) ja korkea USP42 ilmaisun alaryhmiin (≥0.550). Kuten taulukosta 1, USP42 oli merkitsevästi yhteydessä kasvaimen kokoa (

P

= 0,0328), TNM (

P

= 0,0059) ja imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,0184). Kuitenkin, ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä UP42 ilmaisun ja muut potilasryhmät, kuten potilaiden sukupuolen ja iän diagnoosin ja kasvaimen sijainnista. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että koko elinaika oli huomattavasti lyhyempi, jos potilaalla on korkeampi USP42 ilme kuin potilailla, joilla on alhaisempi USP42 ilme (kuvio 1 C, P 0,05), mikä vahvistettiin edelleen selviytyminen analyysin ArrayExpress aineisto (Access id : GSE26253, kuvio 1 D).

USP42 siRNA tukahdutetaan USP42 ilmaisu

vertailu eri mahalaukun syövän solulinjat osoittivat, että ilmentymisen taso USP42 proteiinin AGS ja MKN-45-solut on korkeampi kuin SGC-7901, BGC-823 ja MKN-28-soluissa (kuvio 2A). Siksi AGS ja MKN-45-solut valittiin myöhemmissä kokeissa. Tutkia toiminnot USP42 GC, me knock pudotti USP42 ilmentyminen GC solulinjoissa siRNA transfektiolla. Kuten on esitetty kuviossa 2B, siRNA spesifinen USP42 merkittävästi tukahdutti USP42 ilmentymistä AGS ja MKN-45-solut, joilla on vaimennussuhde 60,4% ja 74,4%, vastaavasti. Sitten analysoi, tukahduttaminen USP42 ilmaisun muuttaisi kasvuvauhti GC soluja. Kuten kuviossa 2C, oli merkittävä lasku kasvuvauhti USP42 tukahdutti soluja verrattuna sinc-transfektoiduissa soluissa.

. USP42-proteiinin tasot määritettiin erilaisissa GC solulinjojen Western blot ja normalisoitiin GAPDH. B. USP42 hiljentäminen tehokkuutta siRNA transfektion AGS ja MKN-45-soluissa arvioitiin Western blot. C. USP42 hiljentäminen siRNA transfektion johti kasvun inhibition havaittuna CCK-8 määritystä AGS ja MKN-45 soluihin. Solut, jotka on transfektoitu USP42 siRNA tai ei-vaimennusaineita siRNA (sinc) 48 h, sekä ei-käsiteltyjä soluja, ympättiin 96-kuoppalevyille, ja solujen elinkyky määritettiin osoitettuina ajankohtina. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna sinc.

USP42 siRNA tukahdutti kasvaimen kasvua nude-hiirissä

vaikutuksen määrittämiseksi USP42 siRNA on tuumorigeenisyyteen in vivo, yhtä monta AGS solujen ihonalaisesti nude-hiiriin ja USP42-siRNA oli IV pistetään jälkeen kasvaimen muodostumisen. Kasvaimen kasvu hiirillä, joihin injektoitiin USP42-siRNA oli huomattavasti hitaampaa kuin hiiriä, joihin injektoitiin kontrolli-siRNA (kuvio 3A). Tilavuus ja paino USP42-siRNA kasvaimia oli vähemmän kuin 25%, että valvonnan kasvaimia (kuvio 3B). Edelleen, verrattuna ohjaus kasvaimia, USP42 ja PCNA oli merkittävästi vähentynyt kasvaimissa USP42-siRNA injektio (kuvio 3C).

. Kasvaimen tilavuus mitattiin USP42 siRNA (siRNA) tai siRNA ohjaus (sinc) injektio. B. Hiiret tapettiin ja kasvaimet otettiin talteen 36 päivän kuluttua kasvaimen sijoitus. Kuvat (ylempi paneeli) ja paino (n = 6, ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, alempi paneeli) talteen otettujen kasvaimia esitetty. C. ilmentyminen USP42 ja PCNA kasvaimissa päässä nude-hiirissä määritettiin western blot. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna sinc.

aiheuttama G0 /G1 vaiheessa pidätyksen USP42 tukahdutti syöpäsolujen

Voit selvittää, miten korkeampi USP42 ilme vaikuttaa GC solujen lisääntymistä, suoritimme Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) on TCGA aineisto analysoimalla suhde USP42 ilmaisun ja geenien Kioto tietosanakirja geenien ja genomien (Kegg) solusyklin kautta. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että korkeammat USP42 ilmentyminen korreloi positiivisesti Kegg solukierron väylän GC potilailla perustuu TCGA aineisto (kuvio 4A). Sitten analysoimme solusyklin jakautumista GC solujen USP42 knockdown. Tukahduttamalla USP42 ilmaisun vähensi S-vaiheeseen solupopulaation ja johti G1 pidätykseen AGS ja MKN-45-soluissa (kuvio 4B). Tutkimaan edelleen solumekanismin taustalla USP42 aiheuttaman soluproliferaation proteiini tasot solusyklin proteiineja arvioitiin. USP42 Knockdown vähensi ilmaus sykliini D1, sykliini E1 ja PCNA (kuvio 4C). Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, että tason lasku on USP42 ilmentymisen inhiboi sykliini D1, sykliini E1 ja PCNA ilmentymisen GC soluja, jotka voivat aiheuttaa G0 /G1 vaiheeseen pysäyttävästi, merkittävästi vähentää S-vaiheessa olevien solujen, ja estävät solujen proliferaatiota.

. GSEA analyysi GC potilailla, joilla on korkeampi USP42 ilme versus alempi USP42 ilme perustuu TCGA aineistot. Kegg solukierron koulutusjakson liittyi USDP42-korkeampi ilme. Rikastamista pisteet (ES, vihreä viiva) kuvastaa korrelaatio solusyklin koulutusjakson ja näytteen. Mustat palkit osoittavat aiemmin tunnettu liittyviä geenejä solusyklin kautta. B. USP42 Äänenvaimennusjärjestelmä indusoi G0 /G1 pidätys GC soluissa. FACS histogrammit ja solusyklin analyysi AGS ja MKN-5-soluissa. Kvantifiointi olevien solujen prosenttiosuus G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheessa on osoitettu. C. ilmentäminen keskeisten proteiinien solukierron määritettiin western blot. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna sinc.

Low invasiivisia potentiaalia USP42-tukahdutetaan syöpäsolujen

GSEA osoitti myös, että USP42 ilmentyminen korreloi positiivisesti etäpesäkkeitä (kuvio 5A). Voit tarkistaa nämä havainnot in vitro määrityksessä, tutkimme invasiivisia potentiaali USP42 tukahdutti soluihin käyttäen in vitro Matrigel invaasiomääritys (kuvio 5B). USP42 tukahdutti solut osoittivat merkitsevästi vähemmän invasiivisia potentiaali kuin sinc-transfektoiduissa soluissa (

P

0,01), mikä viittaa siihen, että korkea ilmentyminen USP42 tehostetun kasvaimen invasiivisuus.

. GSEA analyysi GC potilailla, joilla on korkeampi USP42 ilme versus alempi USP42 ilme perustuu TCGA aineistot. Solujen etäpesäke polku liittyi USDP42-korkeampi ilme. Rikastamista pisteet (ES, vihreä viiva) kuvastaa korrelaatio etäpesäke polku ja näytteen. Mustat palkit osoittavat aiemmin tunnettu liittyviä geenejä solun etäpesäke kautta. B. USP42 hiljentäminen vähentynyt soluinvaasiota havaittuna in vitro invaasiomääritys. C, D. Expression keskeisten proteiinien etäpesäkkeitä ja EMT määritettiin western blot. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna sinc.

hajoaminen soluväliaineen läpi matriksin metalloproteinaasien (MMP: t), on kriittinen prosessi soluinvaasion aikana [16]. Kuten on esitetty kuviossa 5C, hiljentäminen USP42 vaimentua ilmentymisen MMP-2 ja MMP-9.

Lisäksi, proteiini tasot epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) reitti säätölaitteet, jotka liittyvät läheisesti etäpesäke kasvainsoluja, analysoitiin Western blot (kuvio 5D). Transfektio USP42 siRNA vähensi merkittävästi ekspressiotasot β-kateniinin, Twist ja Snail1, samalla kasvattaa E-kadheriinin.

Keskustelu

Useat jäsenet DUB perheen tiedetään edistää karsinogeneesiä, lukien USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] ja USP22 [10-12, 21], kun taas muut Dubs ovat alassäädetty ihmisen syövissä, kuten USP10 [22] ja BAP1 [23]. Kuitenkin vähän tiedetään ekspressiokuviota ja biologisia toimintoja USP42, dub p53 [24] ja histoni H2B- [25], ihmisen syövissä. Tutkimuksessamme osoitimme ensimmäistä kertaa, että GC kudokset ilmentävät korkeita USP42 mRNA verrattuna vastaaviin ei-syöpäkudoksissa. Lisäksi USP42 ilmentyminen liittyi kasvaimen kokoa, TNM, imusolmuke etäpesäke ja eloonjäämisaste GC potilaista (kuvio 1). Meidän havainnot arvokasta tietoa kliinisen tuloksen ennustaminen potilaiden GC.

olettaa USP42 voi toimia onkogeenisessä tekijänä aikana GC kehitystä. Sitten levitetään RNAi-tekniikkaa, joka on laajalti käytössä syöpätutkimuksessa tai syöpähoidon, että kaatamalla USP42 ilmentymistä kahdessa GC solulinjoissa (kuvio 2B). Laskeminen USP42 lauseke alentaa tehokkaasti syöpäsolujen lisääntymistä in vitro (kuvio 2C) ja

in vivo

(kuva 3). GSEA data paljasti, että yhdistys solusyklin polkuun USP42 ilme (kuvio 4A). Sitten soveltanut solusyklin analyysi FACS (kuvio 4B) ja ilmaisun analyysi sykliini D1, sykliini E ja PCNA Western blot (kuvio 4C). Meidän tietojen mukaan USP42 siRNA oli estävä vaikutus GC solujen kasvuun kautta asiakkuutta G0 /G1 pidätykseen.

GC on yksi yleisimmistä syövistä ja edelleen vakava kansanterveydellinen ongelma maailmassa. Yleisyys etäpesäkkeiden on edelleen yksi tärkeimmistä syistä huono eloonjäämisen GC potilaiden [4]. GSEA on TCGA aineisto osoitti yhdistyksen etäpesäkkeiden polkuun USP42 ilmaisua GC (kuvio 5A). Lisäksi in vitro invaasiomääritys muistutti että USP42 Knockdown pienensi invasiivisen kyvyn kuolemattomaksi GC solulinjojen (kuvio 5B). Näin ollen meidän tiedot osoittivat, että kohonnut ilmentyminen USP42 GC voi edistää kasvaimen etäpesäke ja liittyy kliininen tulos GC potilailla. Seuraavaksi yritimme tutkia taustalla olevien mekanismien arvioimalla ilmaus MMP ja EMT sääntelyviranomaisten USP42 tukahdutti syöpäsoluja. MMP-2 [26]: n ja MMP-9 [27] tiedetään välittävän hajoaminen soluväliaineen ja liittyvät kanssa imusolmuke etäpesäke GC. EMT on mukana monimutkainen patogeneesiin kasvaimia [28]. Täällä hiljentäminen USP42 indusoi ilmentymisen tärkein tekijä EMT (E-kadheriinin), mutta laski ilmaus MMP ja kolme tunnettua indusoijat EMT (β-kateniinin, Twist ja Snail1) (kuvio 5C ja 5D). Nämä löydöt ehdotti roolia USP42 kuin hyökkäys promoottori geenin kautta vaikuttavia ilmaus MMP ja EMT sääntelyviranomaisten, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan selventämään tarkkaa mekanismia.

Yhteenvetona, esillä oleva tutkimus osoitti, että USP42 ilme oli lisääntynyt merkittävästi GC kudoksissa. Lisääntynyt USP42 ilmentyminen voi olla tärkeää kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden GC, ja niitä voidaan käyttää prognostisena markkerina tätä tautia. Meidän in vitro Tulosten mukaan hiljentäminen on USP42 estivät solujen lisääntymisen kautta indusoivan G0 /G1 pidätyksen ja tukahdutti soluinvaasiota kautta MMP ja EMT sääntelyviranomaisten. Siten USP42 voi olla uusia terapeuttisia molekyylikohteena GC.

Kiitokset

Tutkimus tukivat Scientific Research Project Shanghai Municipal komission terveys- ja perhesuunnittelu (20124321).