Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat ja etsiä ennustetekijöiden biomarkkerit, jotka saattavat parantaa hoitopäätöksiä on perusteltua. MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä ei-koodaavan RNA-molekyylien mukana geenin ilmentymisen säätelemiseksi ja on ehdotettu mahdollista biomarkkereita CRC. Jotta luonnehtia miRNA transcriptome, suuri kohortti lukien 88 CRC kasvaimista pitkän aikavälin seurannassa oli syvä sekvensoitiin. 523 kypsä miRNA ilmaistiin meidän kohortin ja niillä oli pitkälti yhdenmukainen ekspressiokuvioiden poikki kasvainnäytteestä. Harvat esiintynyt eroja kliinisten parametrien ja miRNA ilme, niiden joukossa, alhainen ilmentyminen miR-592 ja korkea ilmentyminen miR-10b-5p ja miR-615-3p liittyi kasvaimia sijaitsee oikeassa paksusuolessa nähden vasemmalle paksusuolen ja peräsuoli. Korkea ilmentyminen miR-615-3p liittyi myös huonosti eriytetty kasvaimia. Ei ennustetekijöitä biomarkkereiden ehdokkaita yleistä ja etäpesäkkeiden elinaika tunnistettiin soveltamalla LASSO menetelmää Coxin suhteellisten riskien mallia tai yksiulotteista Cox. Tutkittaessa näitä viittä runsaimmin ilmaistu miRNA kohortin (miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p ja miR-192-5p) paljasti, että niiden kollektiivinen ilmentyminen oli 54% havaitun miRNA-sekvenssit. Pathway analyysi kohdegeenien säätelee viisi eniten ilmaistuna miRNA paljasti huomattavan määrän geenien CRC-reitin, kuten APC, TGF ja PI3K, mikä viittaa siihen, että nämä miRNA on merkitystä CRC.

Johdanto-osan : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden M, Hovig E, et al. (2013) Deep sekvensoimalla MicroRNA transcriptome kolorektaalisyövässä. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10,1371 /journal.pone.0066165

Editor: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 17 helmikuu 2013; Hyväksytty: 02 toukokuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Schee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Kaakkois-Norja terveydenhuoltopiirin ja päässä Norja Cancer Society. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat evoluution konservoituneita pieniä (~20-22 nt pitkä), ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä sitoutumalla 3’UTR mRNA, estäen siten translaation [1]. Ne voivat sitoutua osittain täydentävät mRNA mahdollisesti säätelevät vaimentaen useita mRNA: t. Tämä tekee loppupään tutkimukset hieman haastava useita potentiaalisia kunkin miRNA. Tänään on noin 1500 miRNA selityksineen vuonna miRNA tietokannassa (miRBase) [2], ja on arvioitu, että jopa 60% proteiinia koodaavan geenien voidaan säännellä miRNA [3]. MiRNA ovat välttämätön normaalille nisäkkäiden kehityksen ja ovat mukana hienosäätöä monia biologisia prosesseja, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, apoptoosin ja aineenvaihduntaa, ja niiden osallistuminen syövän on herättänyt kasvavaa kiinnostusta miRNA biology [4] – [6]. Ne on ehdotettu mahdollisimman biomarkkereita, koska niiden sääntelytehtävistä, kemiallista vakautta ja mahdollisuutta mitata miRNA seerumissa, plasmassa, uloste ja kudosnäytteet [7] – [10].

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisin syöpä muotoja länsimaissa ja suurin syy syöpään liittyvät kuolemat. Se on heterogeeninen sairaus, kertyminen geneettiset ja epigeneettiset tapahtumat, ja vaikutteita elämäntavan [11], [12]. Hoito päätökset edelleen pääasiassa perustuvat anatomisista laajuudesta taudin diagnoosi, ja etsiä parempaa biomarkkerit on perusteltua. MiRNA on tutkittu niiden mahdollisen aseman diagnostisia, prognostisia ja terapeuttinen biomarkkereita CRC käyttää hybridisaatioon perustuva array teknologioiden ja kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) [13] – [16]. Käyttäen ilmaisua mikrosiruja, ilmentymisen suuren määrän ennalta valittuun miRNA voidaan havaita, ja miRNA tunnistus perustuu signaalin intensiteettiä. Suhteellinen ilmentyminen voidaan laskea qRT-PCR, mutta kun laajenee useita rinnakkaisia ​​analyysejä, määrä miRNA mahdollista analysoida ja RNA määrä voi edustaa rajoituksia. Deep sekvensointi on tullut houkutteleva lähestymistapa maailmanlaajuiseen miRNA analyysin edut mukaan lukien yhdistäminen näytteitä suurikapasiteettisten tarkoituksiin, laajan havaittavissa ilme valikoima, kyky analysoida ilmaus kaikkien selityksin miRNA ja mahdollisuutta havaita uusia miRNA.

tässä työssä syvä sekvensointia käytettiin määrittämään miRNA ilmentymistä 88 CRC kasvain näytteet ja assosiaatioita ekspressiotasot ja kliinis tiedot ja tulokset analysoitiin.

Materiaalit ja menetelmät

Patient kohortti ja näytteiden valmistus

vuosina 1998-2000, 316 potilasta rekrytoitiin viisi sairaalaa Oslon alueella [17], ja takautuvasti mukana tutkimuksessa aikaan ensisijaisen leikkauksen oletettu tai todennettujen kolorektaalisyövän . Tutkimuksen hyväksyi alueellisen eettisen komitean (Health Region II, Norja) ja tietoinen suostumus saatiin potilailta. Resektoitiin näytteet käsiteltiin rutiininomaisesti histopatologista arviointia aikaan leikkauksen ja luokiteltu Kasvaimen etäpesäke (TNM) lavastus järjestelmä. Näytteenotto ylimääräistä kasvainkudoksen suoritettiin kirurgi leikkaussalissa jälkeen näyte poistettiin potilaan, ja näytteet otettiin heti snap-jäädytettiin nestetypessä. Sitten näytteet kuljetettiin tutkimuslaboratoriona säilytettävä pitkäaikainen varastointi -80 ° C: ssa. Koepaloja leikeltiin käyttäen kryostaattia mikrotoomin hematoksyliini- eosiinilla värjättyä objektilasit arvioitiin kasvaimen sisältöä, jonka patologi (mediaani kasvain pitoisuus näytteissä oli 50%, vaihteluväli 30-80%). Kasvainkudoksen sitten viipaloitu 10 um: n leikkeiksi käyttäen kryostaattia mikrotomia ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. 120 tapausta eivät olleet mukana tutkimuksessa seuraavista syistä: ei kohdunkaulan syöpä (25), histologia muu kuin adenokarsinooma (5), kaukainen etäpesäke aikaan leikkauksen (34), preoperatiivinen kemosädehoito (2), riittämätön kirurgisia marginaalit (7 ) ja tuntematon taudin vaiheesta (1). Lisäksi jäädytetyt kudosnäytteet eivät olleet saatavissa 46 tapauksessa. Vuodesta 196 näytettä TNM I-III, 90 kasvain näytteet valittiin satunnaisesti syvä sekvensointia. Jälkeen sekvensointi, kaksi näytettä kohortti katsottiin huonontuneen ja poistettiin lisätutkimuksia, jolloin näyte kohortin 88 potilasta (taulukko 1). Seurantatiedot saatiin sairaaloiden ja yleislääkäreiden (potilaille, jotka eivät käy säännöllistä valvontaa). Etäpesäke varmistettiin röntgentutkimukseen ja Eloonjääntitulokset saatiin kansallisen rekisterin Norjan ja päivitetään mennessä 1. lokakuuta 2008.

RNA: n eristäminen ja Deep Sequencing

RNA eristettiin kasvainkudoksen käyttämällä TriReagent (Ambion Inc, TX) mukaan valmistajan protokollaa ja kokonais-RNA pitoisuus mitattiin Nanodrop (ND-1000). Laatua arvioitiin Agilent 2100 Bioanalyzer ja näytteet RIN arvoon 7 ja edellä käytettiin lisäanalyysiä. Pieni RNA sekvensointi kirjastot luotiin jälkeen Illumina®TruSeq ™ pieni RNA Näytteen valmistus protokollaa. Lyhyesti, 3` ja 5` RNA-sovitin, erityisesti modifioitu kohdistaa päät pienten RNA-molekyylien, ligatoitiin 1 ug korkealaatuisia kokonais-RNA. Käänteinen transkriptio suoritettiin cDNA-kirjastojen ja PCR: ää käytettiin monistamaan ja lisää ainutlaatuisen indeksi sekvenssejä kunkin kirjaston.

Pieni RNA kirjastoista yhdistettiin ja 32 emästä sekvensoitiin kunkin cDNA-molekyylin käyttäen Illumina® Genome Analyzer IIx . Indeksit sekvensoitiin, jotta voidaan tunnistaa, mistä kunkin lukea. Ensimmäinen ajo, joka sisältää 48 näytettä, haittasi osittain funktionaalinen kaistaa virtausta soluun ja sen vuoksi toistettiin. Tiedot ajon 1 ja suorita 2 yhdistettiin alavirran ilmentymisen analyysiä sekä analysoidaan erikseen määritellä tekniset toistettavuus kokeista.

Yhdistelmät Data Analysis ja normalisointi

Reaaliaikainen analyysi , pohja kutsuvan ja suodatus huonolaatuisia lukee oli tehnyt Illumina n ohjelmistopaketteja (SCS2.9 /RTA1.9 ja Off-line Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010 www.novocraft.com) käytettiin leikattiin jäljellä Adapterisekvenssi ja kartoittaa lukee vertailutasoon ihmisen genomin (hg19). Kaikki lukee kartoitus 10 tai enemmän genomialuetta jätettiin pois lisäanalyysiä. Kartoitetut lukee olivat selityksin käyttäen tunnettuja tietokantoja. MiRBase tietokanta julkaisu 18 (marraskuu 2011) käytettiin tunnistamaan miRNA käyttäen BEDTools Version-2.16.2 [18]. NCBI rakentaa ”Homo_sapiens.NCBI.36.58” käytettiin tunnistamaan muita pieniä RNA-lajeja ja mRNA.

Laske lukea count miRNA, lukee että kartoitettu yksilöllisesti sisällä kypsä miRNA sekvenssin enintään yksi yhteensopimattomuus katsottiin osumia. Lukee kartoitus usealle kypsä miRNA sekvenssi osoitettiin mukaan taajuuden ainutlaatuisen kartoitettu lukee esiintyi tässä miRNA. Tämä tarkoittaa, että kun kaksi miRNA jaettu tietyn määrän useita kartoitettu lukee tunnistimme suhde ainutlaatuinen lukee näiden kahden miRNA. Tämä suhde on sovellettu jakamaan määrän useiden kartoitettu lukee ja liittää ne. Jos useita osumia todettiin täydellisesti kartoitetaan yhteen genomin alueella ja kartoitetaan täsmää toiseen, vain täydellinen ottelut katsottiin.

normalisointi lukea laskee, neljä erilaista lähestymistapaa testattiin. Laskimme normalisointikertoimeen kaikille näytteille jakamalla kokonaismäärä lukee määrä lukee tasataan genomiin, jolloin useita osumia tai kartan yksilöllisesti tai määrä lukee kartoitettu selityksin kypsä miRNA kanssa 1 miljoona. Normalisoidut lauseke arvot kullekin miRNA luotiin jakamalla lukea lasken miRNA kanssa mukaan normalisointi tekijä. Normalisoinnin jälkeen, kaikki miRNA luku- määrä on alle 10 kaikissa potilaan näytteet asetetaan 0. Aineisto normalisoitu vastaan ​​selityksin kypsä miRNA valittiin jäljellä analyysejä. Normalized ja un-normalisoitu lukea laskee kaikkien näytteiden on tehty saatavilla Array Express verkkosivuilla, hakunumerolla E-MTAB-1649 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

qRT-PCR: ää aikaisemmin suoritettiin koko kohortin 196 näytettä, joista juuri jäädytetty kudos oli saatavilla ekspression määrittämiseksi kuuden miRNA: miR-21, miR-31, miR-92a , miR-101, miR-106a ja miR-145 [19]. Lyhyesti, cDNA-synteesi ja qRT-PCR suoritettiin käyttäen TaqMan microRNA määritykset (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan protokollan. Kaikki näytteet ajettiin kaksoiskappaleet. Ct-arvot miRNA normalisoitiin vastaan ​​RNU44 ja suhteellinen ekspressio laskettiin käyttämällä 2

-dCt menetelmä [20]. Tulokset näistä kuudesta miRNA päässä 88 näytteistä, jotka oli analysoitu molempia menetelmiä käytettiin tietojen vertailu syvältä sekvensointi kanssa qRT-PCR. Associations välillä johtuu syvästä sekvensointi ja qRT-PCR tutkittiin lineaariregressioanalyysillä.

Hierarkkinen klusterointi ja Tilastollinen analyysi

Hierarkkinen klusterointi suoritettiin visualisoida ekspressiomalleja kaikista miRNA. Normalisoitu ilme arvot log2 muunnetaan ja valvomaton kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen Euklidinen etäisyys ja painotettu keskiarvo vivusto (WPGMA) klusterin miRNA ja näytteitä samanaikaisesti.

Kaksi luokka parittomia merkitys analyysi useita testaus (10000 permutaatioista ) (SAM) [21] saatiin selville miRNA liittyy kliinis parametreja käyttäen J-Express (2012 versio) [22]. Panos SAM normalisoitui ja log2 muuntuvat ja kliinis parametreja käytettiin vastemuuttujia. Kymmenentuhatta toista permutaatiot käyttänyt tietoja onko ilmaus miRNA oli merkitsevästi yhteydessä jokin seuraavista kliinis parametrit: TNM, pT, PN, kasvainpaikantumisen, erilaistuminen, perinodal tunkeutuminen, verisuonten invaasio ja hermoston tunkeutumista. Väärät löytö korko ilmaistuna q-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Yleinen ja etäpesäkkeiden elinaika laskettiin päivästä leikkauksen saakka kuolinpäivä tai diagnosointiin etäpesäke. Tunnistaa miRNA liittyy yleiseen ja etäpesäkkeiden elinaika univariate Coxin suhteellinen vaara regressio laitettiin kullekin miRNA, testaus yhdistysten metastasiaa vapaa tai eloonjäämiseen. Tilille useiden testaus oikaistuna p-arvot laskettiin ohjaamalla vääriä löytö määrä (FDR), käyttäen Benjamini-Hochberg menettely [23]. Sitten kaikki miRNA samanaikaisesti, LASSO menetelmä Coxin suhteellisten riskien mallia [24], joka on pantu täytäntöön aiemmin [25], käytettiin löytää joukko miRNA liittyy päätepisteet. ”Vuonna LASSO määritettäviksi miRNA valittiin. Ei miRNA oli merkitsevä yhden muuttujan Coxin analyysi korjauksen jälkeen useita testejä. Tässä viime kädessä seitsemän miRNA (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365B-3p, miR-454-3p, miR-194-3p, miR-15b-3p ja HSA-asennuspalveli- 4461) oli p-arvo on alle 0,01 metastasiaa kehityksen päätepiste, kun taas kolme miRNA (miR-101-5p, HSA-miR-873-5p ja HSA-miR-3144-3p) oli p-arvo on alle 0,01, jossa päätepiste kokonaiselossaoloaika . Kaikki nämä kymmenen miRNA ilmaistiin hyvin alhaiset meidän kohortin korkein mediaani ilmaus havaittu miR-454-3p 187 lukee alimpaan Mir-873-3p 0 lukee.

Pathway Analyysi kohdegeenien Five korkeimmin ilmoitettuna miRNA

tutkimiseksi biologinen vaikutus pisimmälle ilmaisivat miRNA, kohdegeenien tunnistettiin käyttämällä TarBase 6.0 [26]. Tietokanta sisältää kohdegeenien joilla on kokeellinen tuki lisäksi järjestyksessä perustuva ennuste. Geeni identiteetit ladattiin web-pohjainen DAVID toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun varten polun analyysiä käyttämällä Kegg tietokantaa [27], [28].

Tulokset

Pienet RNA Yhdistelmät ja Annotation

pituus havaitun sekvenssien vaihteli 13 ja 29 nukleotidin poistamisen jälkeen sovittimen sekvenssin (enää lukee poistettiin). Pääosa lukee, 97,9%, oli välillä 19 ja 23 emästä. Keskimäärin 2,6 miljoonaa lukee kartoitus ihmisen genomiin saatiin kohti kasvaimen näyte (kuvio 1A). Olemme tunnistaneet taajuudet lukee joutuminen eri luokkiin pieniä RNA: n tai muiden genomialuetta ja lasketaan mediaani taajuudet verrataan kaikkia 88 kasvainnäytteestä. Taajuus lukee kartoituksen kypsyä miRNA vaihteli 37 ja 77% kirjastoissa ja antoi mediaani 61% (kuvio 1 B). Sillä Introniset /intergeeniset alueilla mediaani lukea taajuus 33% todettiin, ja ennenaikaiseen miRNA ja snoRNAs, mediaani lukea taajuudet olivat 4% ja 2%, tässä järjestyksessä (kuvio 1 C). Lisäksi pieni osa lukee kartoitettu snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, ja mRNA: n, yhdessä käsittää taajuus ~0.05%. MiRNA alle 10 lukee kaikissa potilaan näytteitä ei katsottu ilmaista. Kaikkiaan 523 miRNA ilmennettiin tietojen käyttöä.

. Lukumäärä lukee (x10

6) kartoitettu ihmisen genomin (hg19) kaikille näytteille. Näitä ovat RNA lajeja (ennenaikainen miRNA, snoRNA, snRNA, miscRNA, rRNA, tRNA ja mRNA) kantavassa sekvenssit, joka ei vastannut tunnettu sekvenssi oli verrattava tietokantoja intergeeniset ja introni-alueita ihmisen genomin. B. taajuudet lukee kartoitettu selityksin kypsä miRNA kaikille näytteille käyttäen microRNA tietokantaa (miRBase release 18). C. ympyrädiagrammissa edustavat prosenttiosuudet eri RNA luokkia löytyy keräämiseen.

normalisointi ja tekninen jäljittelee

yleensä vertailla ilmaisua arvoihin näytteiden välillä on tarpeen normalisoida vastaan ​​lukea laskea laskemalla normalisointitekijän. Neljä eri normalisointi menetelmiä saatiin hyvin samankaltaisia ​​tuloksia verrattaessa keskimääräinen muutos lasketaan ero prosenttia kunkin miRNA lukea määrä per miRNA (tuloksia ei ole esitetty). Kuviot 2B ja 2C esittävät jakautumista log2 transformoitujen normaloimaton lukea laskee ja lukea lasketaan normalisoitu vastaan ​​kypsä miRNA viisi satunnaisia ​​potilaan näytettä. Alempi luku laskee eivät olleet niin vaikuta normalisoinnin verrattuna korkeammat arvot. Kaikkiaan normalisointi tuotti suhteellisen tasaisin lukea laskee useimpien miRNA kaikissa näytteissä.

. Vertailu teknisen toistojen välillä ajon 1 ja ajaa 2. piste edustaa koko ilmaus yhdestä miRNA kaikkien potilaiden näytteistä. Mirna ekspressiotietojen normalisoitui ja log2 muuttunut. B. normaloimaton miRNA lukea määrä (log2) viisi satunnaisesti valittua potilasta. C. Normalized miRNA lukea määrä (log2) samasta viisi potilasta kuin B.

48 näytettä syvä sekvensoitiin kahdesti, merkitään ajon 1 ja suorita 2, ja nämä tietomääriä käytettiin vertaamaan tulokset erillisessä ajossa. Tulokset osoittivat erittäin hyvä korrelaatio tekninen toistojen osoittama nolla kulmakerroin linjan (kuvio 2A).

Viisi korkeimmin ilmoitettuna miRNA

Viisi runsaimmin ilmaistu miRNA tässä kohortissa oli miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p ja miR-192-5p (kuvio 3). Luku- laskee näiden miRNA osuus 53,7% kokonaismäärästä miRNA sekvenssit havaittu potilaan näytteissä, kun taas top 20 miRNA osuus 82,6%: n lukee (taulukko S1). Loput 503 miRNA edusti 17,4%: n lukee. Viidestä miRNA, miR-192-5p oli korkein mediaani lauseke (156413 lukee) taas miR-22-3p oli pienin (35284 lukee).

Differential ilmaus viiden runsaimmin ilmaistu miRNA vuonna meidän CRC kohortti. Kokonaismäärät miRNA lukee ovat log2 muuttunut. Ympyrät edustavat vieraita havaintoja ja tähdet edustavat äärimmäisen poikkeavia havaintoja.

Monet miRNA geenit sijaitsevat lähellä muita miRNA geenien geeni- klustereita, ja kaksi viidestä pisimmälle ilmaisivat miRNA (miR-143 -3p ja miR-192-5p) ovat osa tällaista klustereita. MiR-143-3p ja miR-145-5p molemmat sijaitsee kromosomissa 5 10 kb toisistaan, kun taas miR-192-5p ja miR-194-5p sijaitsevat kromosomissa 11 10 kb toisistaan. Ekspressiotasot miR-143-3p ja miR-192-5p ja kaksi miRNA kuuluvat niiden geeniklusterit on kuvattu kuviossa 4. Ei co-ilmentyminen oli ilmeistä miRNA kuuluvat näihin geeniklustereista, joka on yhdenmukaiset edellisen tulokset [29].

. MiR-143-3p löytyy samasta geenistä klusterissa miR-145-5p kromosomissa 5 (asemat 148808481-148808586 ja 148810209-148810296, vastaavasti). MiR-192-5p löytyy samasta geenistä klusterissa miR-194-5p kromosomissa 11 (asemat 64658609-64658718 ja 64658827-64658911, vastaavasti). Vaikka miRNA kussakin geenissä klusteri on 10 kb toisistaan, koekspressoimalla ei havaittu.

Pathway Analyysi Viisi korkeimmin ilmoitettuna miRNA

1490 kohdegeenien tunnistettiin potentiaalisesti säätelevät miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p ja miR-192-5p. Reitit merkittävimpien geeni-rikastamiseen on esitetty taulukossa 2, ja mukana ”Pathways syövän” (55 geenit; p = 3,3 × 10

-7), ”Cell cycle” (28 geenit; p = 2,2 × 10

-6), ja ”Paksusuolisyöpä” (21 geenit; p = 1,0 × 10

-5). Keskittyminen CRC koulutusjakson, huomasimme, että geenit säätelevät viisi eniten ilmaistaan ​​miRNA mukana onkogeenien (

KRAS, PI3K

), tuumorisuppressorit (APC ja TGFpRII), ja DNA: n korjaus geenit (hMSH6) ja geenit, jotka kuuluvat että Wnt ja MAPK signalointireitteihin (kuva 5).

Pathway analyysitulosten kohdegeenien viiden korkeimmin ilmaistu miRNA että peräsuolen syöpä kautta. Kuvassa otettiin Kegg tietokannasta ja miRNA lisättiin sininen fontti osoittamaan tavoitteiden säätelevät näiden miRNA.

Korrelaatio qRT-PCR ja Deep Sequencing Data

Expression arvot kuuden miRNA miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a ja miR-145, aiemmin määritettiin käyttäen qRT-PCR: ää [19]. Mirna ilmentyminen mitattiin qRT-PCR verrattiin syvä sekvensointi tietoja käyttämällä lineaarista regressioanalyysiä normalisoidun Ct-arvoja (qRT-PCR) ja log2-transformoitiin syvä sekvensointi tietoja. R

2 arvot 6 miRNA testatuissa 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, ja 0,28 miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a, ja miR-145 vastaavasti. Summa yhteensä ekspressiotasoja laskettiin myös näille miRNA jokaisen menetelmän, ja suhteelliset tasot on esitetty kuviossa 6. suhteellinen ekspressio yksittäisten miRNA oli kohtuullisen yhdenmukaisia ​​menetelmiä neljän miRNA (miR-21, miR-31 , miR-92a ja miR-106a), kun taas oli selviä eroavaisuuksia mir-101 ja miR-145. MiR-101 oli tuskin havaittavissa qRT-PCR, mutta näytteillä havaittava ilmentyminen arvojen syvä sekvensointi, kun taas miR 145 havaittiin qRT-PCR ja tuskin havaittiin käyttämällä syvä sekvensointia.

normalisoidut lauseke arvot log2 transformoitiin ja analysoitiin ilman valvontaa kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi painotetun keskiarvon sidos (WPGMA). Globaali kartta sisältää kaikki ilmaisivat miRNA näkyvät pystysuoraan ja potilaan näytteitä vaakasuoraan.

Hierarkkinen klusterointi ja yhdistysten välillä miRNA Expression ja kliinis parametrit

miRNA ekspressiokuvioiden havaittu hierarkkinen klusterointi näkyvät kuviossa 7 miRNA pystyakselilla ja potilaan näytteet vaaka-akselilla. Suurin osa miRNA näytteillä hyvin samanlainen ekspressiotasot puolilla potilaan näytteitä. Alueilla juoni, jotkut miRNA näytti ekspressoitua eri, mutta nämä olivat lähes yksinomaan sijaitsee keskuudessa miRNA joka oli hyvin alhainen ilme. SAM analyysi ekspressiotietojen ja kliinis parametrit paljasti, että korkea ilmentyminen miR-10b-5p ja miR-615-3p ja alhainen ilmentyminen miR-592 liittyi kasvaimia sijaitsee oikeassa paksusuolessa (mukaan lukien nouseva ja poikittainen paksusuoli) verrattuna vasen paksusuolen ja peräsuolen (taulukko 3). Ilmaisu Näiden miRNA osoitti 2,4-kertainen, 41,4-kertainen ja 3,9-kertainen eroja, vastaavasti (q 0,05 kaikki miRNA) (kuvio 8). Korkea ilmentyminen miR-615-3p liittyi myös huonosti eriytetty kasvaimia verrattuna vaihtelevan ja hyvin eriytetty kasvaimet (fold muutos 44,4, q 0,05).

Expression kuusi miRNA (miR-21, asennuspalveli- 31, miR-92a, miR-101, miR-106a ja miR-145) on esitetty syvältä sekvensointi ja qRT-PCR 88 potilaan näytteitä, jotka analysoitiin molemmilla menetelmillä. A. Palkit edustavat summa kokonaismäärästä lukee (x10

6) jokaiselle miRNA syvältä sekvensointi. B. pylväät edustavat summa suhteellinen ekspressio (2

-dCt) alkaen qRT-PCR: llä.

korkea ekspressio miR-10b-5p ja miR-615-3p ja heikkoa ilmentymistä Mir-592 liittyi kasvain sijaitsi oikeuden paksusuolessa suhteessa vasemmalle paksusuolen ja peräsuolen (q 0,001 ja p 0,001).

assosiaatioiden miRNA Expression ja tulokset

lASSO ja yhden muuttujan Coxin analyysi, 5 miRNA (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365B-3p, miR-454-3p, miR-194-3p ja asennuspalveli- 15b-3p) metastasiaa kehityksen päätepiste syntynyt, ja yksi miRNA (miR-101-5p) kanssa päätepiste kokonaiseloonjääminen tunnistettiin, mutta mikään näistä pysyivät merkitsevästi yhteydessä joko kokonaisnäkemys tai etäpesäkkeiden elinaika säätämisen jälkeen useita testejä. Kaikki miRNA tunnistaa näiden analyysien ilmaistiin hyvin alhaiset meidän kohortin korkein mediaani ilmaus havaittu miR-454-3p 187 lukee alimpaan Mir-194-3p ainoastaan ​​19 lukee.

keskustelu

Tässä työssä, syvä sekvensointi käytettiin määrällisesti miRNA ilmaisun suuressa kohortissa CRC kasvainnäytteestä. Tämä lähestymistapa saattaa edistää mahdollisia etuja globaalissa miRNA ilmaisun analyysiä, mutta tuo mukanaan myös uusia haasteita koskien data-analyysi, koska kerättyjen tietojen määrää jälkeen syvä sekvensointi sisältää miljoonia lukee jotka on kartoitettu genomiin ja normalisoitu [30]. Vuonna 88 CRC potilaita onnistuneesti analysoida, 523 kypsä miRNA havaittiin. Muut pienet RNA-sekvenssit havaittiin myös, mutta alhainen havaitseminen taajuuksia muiden RNA luokkia ja genomialuetta osoitti, että valinta miRNA oli onnistunut, ja sen mukaisesti aiempien tulosten [29], [31]. Lisäksi erinomainen sopimus havaittu tekninen rinnakkaista ehdotti riittävä toistettavuus.

Viisi miRNA runsaimmin ilmaistu tutki CRC kohortti olivat miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p ja miR-192-5p, ja kaikki nämä ovat aiemmin osoitettu olevan väärin säädellystä CRC [32] – [38]. Nämä miRNA olivat myös korkeimmin ilmaistu miRNA aikaisemmassa tutkimuksessa suoritetaan käyttäen syvää sekvensointi 8 CRC-näytteiden ja vastaavan normaaleissa kudoksissa [39]. Kiinnostavaa kyllä, viisi eniten erittäin ilmaisivat miRNA osuus peräti 54% koko määrä miRNA sekvenssit havaittu. Tämä on yhdenmukaiset aiemman syvä sekvensointi tutkimus suoritettiin ääreisveren näytteistä, joissa let-7 perheen osuus oli 77% koko miRNA lukea lukemat [29]. Suhteellinen merkitys huipulla alhainen miRNA ilmaisu on vaikea tulkita, koska puuttuminen tai runsas esiintyminen miRNA voi edustaa yhtä tärkeitä biologisia säätelevät signaalit. Kuitenkin yliedustus pieni määrä miRNA voi merkitä sitä, että nämä miRNA tärkeä rooli kuin alipaineensäätöventtiileillä loppupään tavoitteita ja biologisen reitit, joita nämä tavoitteet. Ennustettu tavoitteita 5 pisimmälle ilmaisivat miRNA liittyi merkittävästi syöpää asiaan reittejä, mukaan lukien CRC-reitin. Niistä ennustettu tavoitteet CRC reitin olivat onkogeenien, tuumorisuppressorit ja DNA: n korjaukseen geenit, jotka ovat mukana useissa tärkeissä signalointireiteissä, mukaan lukien Wnt, MAPK, solusyklin, TGF-β, ja p53. Ennustettu tavoitteet (hMSH2 ja hMSH6) olivat myös mukana vähen- tämisessä DNA: n korjaukseen vaikuttavien geenien mikrosatelliitteihin ja ovat siten mukana mikrosatelliittien epävakautta kautta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tunnistetut viisi eniten erittäin ilmaisivat miRNA ovat syöpää merkityksellisiä ja luultavasti merkitystä CRC, mutta tarvitaan lisätutkimuksia vahvistaa tavoitteet ja arvioida alavirran vaikutuksia.

Yksi oletettu edut syvä sekvensointi verrattuna mikrosiruanalyysi ja qRT-PCR paranee spesifisyys ja herkkyys, mikä viittaa siihen, että tämä menetelmä palaisi oikeampi mittaukset kunkin miRNA kuin muut menetelmät. Verrattaessa meidän aiempien tulosten mittaaminen ilmaus kuusi miRNA käyttäen qRT-PCR syvä sekvenointitulosten, korrelaatio yksilön näytteen taso oli heikko kaikille miRNA tutkittu. Deep sekvensointi on usein vahvistanut qRT-PCR, mutta kattavaa vertailua kahden lähestymistavan ei ole tehty. Syvässä sekvensointi tutkimus 9 virtsarakon syöpä näytteitä, valitaan miRNA syvältä sekvensointi todensi qRT-PCR, ja raportoitu korreloivan hyvin analysoituna kertaiseksi ilmentymisen eroja baari juoni [40]. Toisessa tutkimuksessa suoritettiin 10 neuroblastooma näytteistä, korrelaatiokertoimet välillä 0,1 ja 1 havaittiin verrattaessa summa miRNA lausekkeen qRT-PCR ja syvä sekvensointi [41]. Suurin ristiriitaisuuksia meidän vertailu qRT-PCR ja sekvensointi havaittiin miR-101 ja miR-145. Määritystä käytetään qRT-PCR sekä sekvensointi olivat molemmat kykenevät havaitsemaan, mutta ei erottaa välillä tunnetaan isoformien näiden miRNA. Vuonna sekvensointi tietoja, ei nukleotidin vaihtelut havaittu, jotka voisivat selittää eroja. Teoriassa puuttuessa havaitseminen miR-101 qRT-PCR voi olla herkkyyttä kysymys, kun taas miR-145, puute erityisyyttä qRT-PCR-määritys saattaa selittää eroja. Niinpä onkin epäselvää qRT-PCR voidaan käyttää validointitarkoituksiin, koska qRT-PCR ja syvä sekvensointi generoidaan eri menetelmin ja näkyvät eri mittakaavoissa vaihtelevalla ilme vaihtelee, mikä vaikeuttaa vertailua kahden aineistoja potilaaseen -to-potilaskohtaisesti.

Yksi tavoitteista tämän oli tutkia assosiaatioita miRNA ilmaisun ja kliinis parametrit ja tulokset. Kun otetaan huomioon alhainen havaittu vaihtelu näytteiden välillä, ei ole yllättävää, että muutamia tällaisia ​​yhdistysten havaittiin. Käyttämällä univariate Coxin suhteellinen vaara regressio, ei miRNA havaittiin liittyvän etäpesäkkeitä kehitykseen tai eloonjäämiseen korjauksen jälkeen useita testejä. Ei miRNA valittiin vuonna LASSO analyysiin. Alhainen ilmentyminen miR-592 ja korkea ilmentyminen miR-10b-5p ja miR-615-3p liittyi kasvaimia sijaitsee oikeassa paksusuolessa verrattuna kasvaimia vasemman paksusuolen ja peräsuolen. Korkea ilmentyminen miR-615-3p liittyi myös huonosti eriytetty kasvaimia. MiR-10b on aiemmin raportoitu vaimentua CRC ja voimakas ilmentyminen liittyi kehittynyt pT-vaihe [42], mutta ei tällaisten yhteenliittymien havaittu meidän kohortissa. MiR-592 on aikaisemmin todettu vaimentua kasvaimissa puutteellinen yhteensopimattomuuden korjauksen verrattuna yhteensopimattomuuden korjauksen taitavia kasvaimissa [43], [44]. Puutteellinen mismatch korjaus aiheuttaa microsatellite epävakautta ja satunnaista CRC, mikrosatelliittimarkkereita epävakaa kasvaimet ovat usein sijaitsevat oikealla puolella paksusuolen [45], [46]. Niinpä alhainen ilmentyminen miR-592 kasvaimissa oikean paksusuolen tässä tutkimuksessa olisi sopusoinnussa aikaisempien havaintojen, mutta koska hyvin vähän tiedetään tällä hetkellä koskevat tavoitteet tämän miRNA, asian selventämiseksi vaatisi lisätutkimuksia. MiR-615 osoitti silmiinpistävin ero ilmaisun välillä oikealle ja vasemmalle paksusuolen tässä kohortissa, ja se oli myös erittäin ilmaistu huonosti eriytetty kasvaimia. On olemassa muutamia raportteja, jotka koskevat ilmentymistä ja toimintaa tämän miRNA, mutta yhdessä tutkimuksessa, miR-615 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi, kun ehdotettu tuumorisuppressori NGX6 Kokeellisesti käyttöön ihmisen CRC solulinjassa HT29. Meidän kohortti, 7 10 huonosti eriytetty kasvaimia sijaitsee oikeassa paksusuolessa.