Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

hepariinia sitovat epidermaalisen kasvutekijän kaltaisen kasvutekijä (HB-EGF) on jäsen kasvutekijän perhe. Membraaniin sitoutuneen proHB-EGF tiedetään olevan esiaste liukoisen muodon HB-EGF: n (SHB-EGF), joka edistää solujen lisääntymistä ja selviytymistä. Vaikka toimintoja SHB-EGF on tutkittu laajasti, se ei ole vielä täysin ymmärretty, jos proHB-EGF on myös mukana solusignaloinnis- tapahtumia. Tässä tutkimuksessa käytimme anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta Y-142 ja Y-073, joka on ero erityispiirteitä kohti proHB-EGF, selventämiseksi proHB-EGF toiminnot syöpäsoluissa.

Experimental suunnittelu

biologiset aktiivisuudet proHB-EGF arvioitiin solujen proliferaation, kaspaasin aktivaatio, ja juxtacrine aktiivisuus määrityksissä käyttäen 3D-pallomaista kulttuurin NUGC-3-soluissa.

tulokset

Y-142 ja Y-073 näytteillä samanlainen sitova ja neutraloivat toimintaa SHB-EGF. Kuitenkin vain Y-142 sitoutuu proHB-EGF. Havaitsimme toimintaa endogeenisesti ilmaistu proHB-EGF 3D-sferoidin kulttuuriin. Esto proHB-EGF Y-142 vähensi pallomainen muodostumista, tukahdutetaan solujen lisääntymistä, ja lisääntynyt kaspaasin aktivaatio 3D pallomainen kulttuurin NUGC-3-soluissa.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että proHB- EGR toimii solujen lisääntymistä ja solujen eloonjäämistekijänä syöpäsoluissa. Tulokset viittaavat siihen, että proHB-EGF voi olla tärkeä rooli syövän etenemiseen.

Citation: Sato S, Kamada H, Watanabe T, Tsuji I Fan J (2013) tunnistetiedot Cancer Cell Proliferation ja PELASTAUTUMINEN of proHB-EGF by käyttäminen Anti-HB-EGF-vasta-aineen. PLoS ONE 8 (1): e54509. doi: 10,1371 /journal.pone.0054509

Editor: Emilio Hirsch, University of Torino, Italia

vastaanotettu: 29., 2012 Hyväksytty: 12 joulukuu 2012; Julkaistu: 21. 2013

Copyright: © 2013 Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat /olivat työntekijöitä Takeda Pharmaceutical Company Limited tai Takeda San Francisco, Inc. ja maksettiin sellaisenaan. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

HB-EGF on jäsenenä epidermaalinen kasvutekijä (EGF) perheen kasvutekijöiden [1]. Se syntetisoituu transmembraaniproteiini, proHB-EGF, joka koostuu signaalipeptidi; pro-peptidi; ja hepariinia sitova, EGF: n kaltainen, jukstamembraani-, transmembraani- ja sytoplasminen domeeni [2]. Aikana solustressiä, proHB-EGF läpikäy ektodomeeni irtoaminen, joka vapauttaa liukoisen muodon, SHB-EGF, ja solunsisäinen C-terminaalista fragmenttia (CTF) [3], [4]. SHB-EGF kykenee voimakas mitogeenisesta ja /tai kemotaktinen aktiivisuus aktivoitumisen kautta sen reseptorien EGFR ja erbB4 [1], [5], [6]. CTF translokoituu tumaan ja indusoi geenin ilmentymisen cyclinA ja cyclinD2 tukahduttamalla toiminta PLZF ja Bcl6, vastaavasti [7], [8].

Sen lisäksi, että esiaste SHB-EGF: n ja CTF, proHB-EGF on ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten difteriatoksiini reseptori [9], joka on adheesiomolekyyli, [10] ja juxtacrine tekijä [11]. Difteriatoksiini sitoutumisen proHB-EGF voimistaa CD9 tai hepariinin kaltaisten molekyylien [12], [13], ja sitova aiheuttaa proteiinisynteesin inhibitio läpi internalisaation difteriatoksiinin-proHB-EGF monimutkainen. Kuten soluadheesiomolekyyli, proHB-EGF edistää Blastokysta tarttumisen kohtuun implantoinnin aikana hiirissä [10]. Juxtacrine aktiivisuus proHB-EGF todettiin ensimmäistä kertaa on yhteisviljelmä järjestelmässä, jossa proHB-EGF-yli-ilmentävät solut ympättiin EGFR yli-ilmentäviä soluja [11]. Eristää ja arvioida signalointi aloitetaan proHB-EGF erillään aloittaman SHB-EGF proHB-EGF-yliekspressoivia solut kiinnitettiin formaliinilla, estäen vapauttamaan SHB-EGF. Tässä yhteisviljelmä järjestelmässä proHB-EGF-yli-ilmentävät solut edistää DNA-synteesin ja esti apoptoosin EGFR yli-ilmentäviä soluja joissakin tutkimuksissa, joissa sitä käytettiin [11], [14], [15]. Sitä vastoin, kun ehjä proHB-EGF-yli-ilmentävät solut eivät kiinnitettiin formaliinilla, ne inhiboivat DNA-synteesiä ja edistää apoptoosia EGFR yli-ilmentäviä soluja modifioidussa yhteisviljelmä ehto [16]. Toiminnot proHB-EGF arvioitiin myös analysoimalla vaikutuksia proHB-EGF ilmentymisen vaikutus autonomisten solutapahtumia. ProHB-EGF yliekspressio tukahdutetaan tai edistää solujen lisääntymistä erilaisissa solulinjoissa [17], [18]. Siten roolit proHB-EGF ei ollut jatkuvasti tai selvästi selvitetty.

Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet toimintoja proHB-EGF syöpäsoluissa käyttämällä 2 anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erilaiset spesifisyydet kohti proHB-EGF. Tulosten perusteella näyttää, että proHB-EGF soittaa rooleja leviämisen ja selviytymisen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta Y- 073 ja Y-142 ja SHB-EGF aiemmin luotu [19]. Lyhyesti, Y-142 valmistettiin immunisoimalla BALB /c-hiiriä (Japan Clea) kanssa ihonalaiset maljakotilon hemosyaniini-konjugoidun SHB-EGF ja vatsan injektiot 293F-soluja (Invitrogen) transfektoitiin ohimenevästi proHB-EGF-ekspressioplasmidin. Y-073 saatiin immunisoimalla BALB /c-hiirten ihon alle injektiot maljakotilon hemosyaniini-konjugoidun SHB-EGF. Molemmat vasta-aineet puhdistettiin niiden hybridoomaviljelysupernatanttia kanssa rProteinA Sepharose (GE Healthcare). SHB-EGF valmistettiin viljelmän supernatantista 293F-soluja (Invitrogen), joka on transfektoitu SHB-EGF-ekspressioplasmidin [19]. Käytimme myös seuraavat reagenssit: hiiren kontrolli-IgG ja piparjuuriperoksidaasi-leimattua (HRP-leimattu) ja anti-hiiri-IgG-vasta-aine, Jackson ImmunoResearch Laboratories; Alexa488-leimatun anti-hiiri-IgG-vasta-aine, HRP-leimattu anti-vuohi-IgG-vasta-ainetta, ja HRP-leimatun anti-kanin IgG-vasta-Invitrogen; anti-amfireguliini (anti-ARG) monoklonaalinen vasta-aine, anti-HB-EGF polyklonaalista vasta-ainetta, anti-EGFR-polyklonaalista vasta-ainetta, ja biotinyloitua anti-EGFR-polyklonaalinen vasta-aine R anti-β-aktiini-vasta Cell Signaling Technology; erlotinibin alkaen Selleck Chemicals; biotinyloitu anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta Milliporesta; sulfotagged streptavidiinilla alkaen Meso Scale Discovery; ja forboli 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA) Wako.

Cell Culture

NUGC-3 mahasyöpä soluja (Japani Collection of Research Bioresources), 5637 virtsarakon syövän solut (American Type Culture Collection), ja BxPC-3 haimasyövän soluja (American Type Culture Collection) pidettiin RPMI1640 täydennettynä 10% seerumia. EFO-27 munasarjasyöpäsoluja (DMSZ) pidettiin RPMI1640 20% seerumia. Soluja pidettiin 2D soluviljelylevyille, ja 3D-pallomainen kulttuurin kokeita, ne siirrettiin Celltight sferoidi kulttuuri levyn (Sumitomo Bakelite).

virtaussytometria

Solut irrotettuina viljelymaljalla solujen dissosiaatio-puskurilla (Invitrogen), ja inkuboitiin anti-HB-EGF monoklonaalinen vasta-aine tai anti-ARG monoklonaalinen vasta-aine 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA), soluja inkuboitiin Alexa488-leimatun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinin ilmentyminen mitattiin käyttämällä FACS CantoII väline (Becton Dickinson), ja data analysoitiin sitten kanssa FlowJo ohjelmisto (Puu Star). Tuottaa positiivinen kontrolli sitoutumisesta anti-ARG-vasta-aine, EFO-27-solut transfektoitiin ARG ekspressioplasmidin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

SHB-EGF-sitoutumisen määritys

sitovaa aktiivisuutta anti-HB-EGF monoklonaalinen vasta-aine SHB-EGF havaittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [19]. SHB-EGF: n tai BSA: ta immobilisoitiin 1 ug /ml 96-kuoppaiselle levylle yön yli 4 ° C: ssa. Jälkeen epäspesifinen sitoutuminen blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 1% BSA: ta, anti-HB-EGF monoklonaalinen vasta-aine, inkuboitiin eri pitoisuuksissa levyyn. HRP-leimattu anti-hiiri-IgG-vasta-aine oli sitten reagoimaan 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. TMB Peroxidase EIA Substrate (Bio-Rad) lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan. Vasta-aineen sitoutumisen SHB-EGF havaittiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen SPECTRA MAX-levylukijalla (Molecular Devices).

EGFR: n fosforylaation määritys

estoaktiivisuus anti-HB- EGF monoklonaalinen vasta-aine SHB-EGF-indusoitu EGFR fosforylaatio havaittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [19]. NUGC-3-soluja ympättiin 1 x 10

4 solua /kaivo RPMI 1640 väliaineessa 1% seerumia. Sen jälkeen, kun 1-d itämisaika, soluja käsiteltiin erilaisilla konsentraatioilla anti-HB-EGF-vasta-aineen ja 10 nM SHB-EGF 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solulysaatit valmistettiin soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Roche Applied Science) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Sigma Aldrich) ja käytettiin analyysin kanssa pEGFR havaitseminen ELISA-kittiä (R Y-142, musta histogrammi; Y-073, harmaa histogrammi. B. Expression of amfireguliini (ARG) syöpäsolulinjoissa. Soluja inkuboitiin anti-ARG-vasta-ainetta, jota seurasi inkubaatio Alexa488-leimatun anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta. Sitova aktiivisuus anti-ARG-vasta-ainetta vahvistettiin käyttäen EFO-27-soluja, jotka on transfektoitu ARG-ekspressioplasmidin. Ei IgG, musta viiva; anti-ARG-vasta, harmaa histogrammi.

EGFR ligandeista ovat HB-EGF, amfireguliini (ARG), tuumorikasvutekijä α, neureguliini β1, EGF, ja beetaselluliinilla, ja edellisessä tutkimuksessa osoitettiin, että Y- 142 recognizesARG lisäksi HB-EGF [21]. Molemmat ligandeja ilmaistaan ​​membraaniin sitoutuneet muodot solun pinnalla [22]. Näin ollen, sen varmistamiseksi, että Y-142: n soluihin sitoutumisen johtui sen tunnustamista proHB-EGF, eikä ARG, ARG ilmentyminen tutkittiin virtaussytometrialla, eikä ARG ilmentymistä havaittiin (Fig. 1 B). Sulkea pois sitä mahdollisuutta, että anti-ARG-vasta ei ole sitovaa toimintaa ARG käytimme transfektoitu ARG positiivisena kontrollina. Tämä tulos vahvisti lisäksi, että sitoutuminen Y-142 testatut syöpäsolun linjat johtui sen tunnustamista proHB-EGF. Testasimme myös EGFR-ligandin spesifisyys Y-073 ja Y-073 sitoutuu spesifisesti HB-EGF: ää (tietoja ei esitetä).

edelleen tutkia ominaisuudet vasta-aineiden, testasimme niiden sitovaa aktiivisuutta SHB EGF ELISA. Mielenkiintoista, Y-142 ja Y-073 sitoutuu SHB-EGF vertailukelpoisia EY

50-arvot 56 pM ja 110 pM, vastaavasti, ja kumpikaan ei sidottu negatiiviseen kontrolliin BSA (Fig. 2A). Lisäksi testasimme neutraloimiskyvyn aktiivisuutta SHB-EGF aiheuttama EGFR fosforylaatiota. NUGC-3 mahasyöpä solulinjaa käytettiin havaitsemaan EGFR fosforylaatiota, koska sen korkea EGFR. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, molemmat vasta-aineet estivät fosforylaatiota EGFR konsentraatiosta riippuvaisella tavalla vastaavia IC

50-arvot (Y-142 = 3,8 nM; Y-073 = 4,1 nM). Nämä havainnot osoittivat, että vain Y-142 oli kyky sitoutua proHB-EGF, vaikka molemmat Y-142 ja Y-073 oli samanlaiset sitovat ja neutraloivat toiminta kohti SHB-EGF.

. Sitova aktiivisuus Y-142 ja Y-073 kohti SHB-EGF. Anti-HB-EGF-vasta-inkuboitiin eri pitoisuuksina käytettäessä SHB-EGF-pinnoitettu tai BSA-päällystetylle levylle. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin HRP-leimattu anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta. Y-142 sitoutumisesta BSA, valkoinen neliö; Y-073 sitoutumisesta BSA, valkoinen ympyrä; Y-142 sitoutumisen SHB-EGF, musta neliö; Y-073 sitoutumisen SHB-EGF, musta ympyrä. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± keskihajonta (SD) arvojen hankittujen kahtena kappaleena. B. Neutraloiva aktiivisuus Y-142 ja Y-073 vastaan ​​SHB-EGF aiheuttama EGFR fosforylaatiota. Anti-HB-EGF-vasta-ainetta inkuboitiin ilmoitettuina pitoisuuksina läsnä ollessa 10 nM SHB-EGF kanssa NUGC-3-soluja 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solulysaatteja inkuboitiin anti-EGFR-vasta-aine-pinnoitettu levy, jonka jälkeen inkuboitiin HRP-leimatun anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta. Ei SHB-EGF, valkoinen ympyrä; SHB-EGF ja kontrolli-lgG, valkoinen neliö; SHB-EGF ja Y-142, musta neliö; SHB-EGF ja Y-073, musta ympyrä. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD arvoista hankittujen kolmena kappaleena.

Cell Proliferation ja Survival toiminnot proHB-EGF

Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että proHB-EGF osallistuu solu-solu kosketuksiin [10]. 3D-pallomainen kulttuuri, syöpäsolut tehdään laajempi solu-solu kontakteja kuin 2D kulttuuri [23]. Me arveltu, että solu-solu kosketuksiin välittämää proHB-EGF vaikutus saattaa olla voimakkaampi ja helpompi havaita 3D pallomainen kulttuuriin. Tätä varten perustimme 3D sferoidin kulttuuri solututkimuksessa käyttämällä NUGC-3-soluissa. Kun NUGC-3-solut ympättiin pallomainen viljelylevyltä, ne muodostivat sferoidin pienellä solumassan keskellä ydin ja löyhästi jaettu solujen ympäröi ytimen (tummanharmaa ja vaaleanharmaa, vastaavasti, PBS kuvassa. 3A ). Mielenkiintoista on, että alle Y-142 käsittelyä, solut olivat hajanaisia ​​ja oli pienempi keskellä ydin ja suurempi halo. Morfologiset aiheutuva muutos nimenomaan Y-142 ehdotettu, että tämä muutos sferoidiviljelmiä morfologia johtui modulaatioon proHB-EGF toimintoja. Olemme edelleen tutkineet proHB-EGF toimintoja käyttämällä 3D pallomainen dosviljelmämäärityksessä. Vuonna solulisäkasvumääritykselle, Y-142 inhiboi merkittävästi leviämisen NUGC-3 pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 3B). Inhibitio soluproliferaatiota saavutti 72%: iin suurin vasta-ainepitoisuus. Sen sijaan, Y-073 ei ollut vaikutusta proliferaatioon. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muilla testatuilla solulinjoilla, eli 5637 ja BxPC-3 (Fig. 3B). Koska Y-073 esti toimintoja SHB-EGF eikä vaikuttanut millään proHB-EGF solulinjojen sferoidi kulttuuriin, ehdotettiin, että toiminto endogeenisen proHB-EGF oli hallitseva sferoidi kulttuuri, verrattuna funktio endogeenisen SHB-EGF. Nämä tulokset osoittivat, että proHB-EGF toiminut tärkeänä soluproliferaation tekijä syöpäsoluissa.

Sferoidiviljelmiä muodostumista ja soluproliferaatiota proHB-EGF toiminto arvioitiin alle Y-142 käsittelyä. Solut ympättiin sferoidin kulttuuriin levy, kun läsnä oli 1% seerumia. Sen jälkeen, kun 1-d itämisaika, soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla anti-HB-EGF-vasta-aineen ja viljeltiin 3 d. A. sferoidi muodostumista NUGC-3-soluja. Rimaa jokaisen kuvan osoittaa 500 um. B. estäminen proHB-EGF-riippuvaisen soluproliferaation Y-142. Solujen proliferaatio mitattiin CellTiter-Glo ja ne on esitetty prosentteina leviämisen PBS-käsiteltyjen solujen. Ohjaus IgG, valkoinen neliö; Y-142, musta neliö; Y-073, musta ympyrä. Datapisteiden edustavat keskiarvoa ± SD arvoista hankittu kolmena kappaleena. C. vähentäminen HB-EGF-proteiinia HB-EGF siRNA. Solulysaateista siRNA-transfektoiduissa NUGC-3-solut altistettiin SDS-PAGE: lla. HB-EGF havaittiin western blottauksella, jossa β-aktiini kuin sisäisen valvonnan. D. Vahvistus proHB-EGF-riippuvaista soluproliferaatiota HB-EGF siRNA. NUGC-3-solut transfektoitiin HB-EGF siRNA ennen pallomainen kulttuuriin. Yhden päivän kuluttua siRNA transfektion jälkeen solut ympätään sferoidin kulttuuriin levy. Solujen proliferaatio mitattiin CellTiter-Glo ja esitetään prosentteina solujen leviämisen PBS-käsiteltyjen solujen. Datapisteiden edustavat keskiarvoa ± SD arvoista hankitun kolmena kappaleena.

varmistamiseksi edelleen, että soluproliferaation inhibointi johtui häiriön proHB-EGF-toiminto, arvioimme vaikutus HB- EGF siRNA soluproliferaatioon on pallomainen määrityksessä NUGC-3-soluissa. Vähentynyt ilmentyminen proHB-EGF johtuu HB-EGF siRNA varmistettiin western blottauksella (kuvio. 3C). Mukaisesti knockdovvn proHB-EGF ilme, HB-EGF siRNA aiheutti alentunut soluproliferaation (kuvio. 3D). Olemme havainneet, että laajuus soluproliferaation inhibointi HB-EGF siRNA oli samanlainen kuin Y-142. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​ajatus, että Y-142 estää proHB-EGF-toiminto, joka saattaa pienentää solujen lisääntymisen.

tutkia molekyylimekanismin taustalla toimintoja proHB-EGF solujen eloonjääminen, mittasimme kaspaasi aktivointi, joka on keskeinen tapahtuma apoptoosin [24], in NUGC-3-soluissa. Kuten kuviossa. 4, Y-142 edisti kaspaasi-3/7 (Fig. 4), kun taas Y-073 ei ollut mitään vaikutusta. Tämä tulos osoitti, että proHB-EGF on solujen selviytymisen aktiivisuutta syöpäsoluissa ja että estämällä proHB-EGF laukaisee kaspaasivälitteinen apoptoosin.

solujen selviytymistä aktiivisuus proHB-EGF testattiin mittaamalla n vapautumisen. NUGC-3-solut ympättiin sferoidin kulttuuriin levy, kun läsnä oli 1% seerumia. Sen jälkeen, kun 1-d inkubaation aikana soluja käsiteltiin Y-142 ja viljeltiin 1 d. Kaspaasin aktivaatio mitattiin kaspaasi-Glo 3/7. Ohjaus IgG, valkoinen neliö; Y-142, musta neliö; Y-073, musta ympyrä. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD arvoista hankittujen kolmena kappaleena.

esto proHB-EGF Juxtacrine Toiminta Y-142

Toisin SHB-EGF, joka vaikuttaa autokriinisten ja paracrine mekanismeja, juxtacrine signalointi on mekanismi, ainutlaatuinen proHB-EGF [11]. Oletimme, että vaikutus Y-142 voi välittää spesifisesti inhibition kautta proHB-EGF juxtacrine signalointia. Koska juxtacrine aktiivisuus ilmoitettiin olevan EGFR-välitteisen [11], mittasimme fosforylaatio EGFR sekä sen alavirran proteiinien ERK1 /2 ja AKT, jotka ovat mukana solujen lisääntymisen ja kaspaasi-välitteistä apoptoosia, vastaavasti, NUGC -3-soluja. EGFR-inhibiittoria erlotinibin, käytettiin positiivisena kontrollina, inhiboi fosforylaatiota EGFR, ERK1 /2, ja AKT (Fig. 5). Samanlainen vaikutus erlotinibin, Y-142 vähensi fosforylaatiota EGFR, ERK1 /2, ja AKT, kun taas Y-073 sekä kontrolli-lgG ei. Esto niiden fosforylaation Y-142 oli merkitsevä 15 minuuttia käsittelyn jälkeen ja kesti jopa 3 d, mikä viittaa siihen, että juxtacrine signaali konstitutiivisesti kytkeä päälle pallomainen. Nämä tiedot osoittivat, että proHB-EGF juxtacrine toiminta johtaa solujen lisääntymisen sekä solun eloonjäämistä aktiivisuutta.

proHB-EGF juxtacrine aktiivisuus mitattiin käyttäen Y-142. NUGC-3 solujen sferoidiviljelmiä viljelylevyltä hoidettiin 200 nM kontrolli-lgG, 200 nM Y-142, 200 nM Y-073, tai 1 nM erlotinibin varten ilmoitettu kertaa. A. fosforylaatio EGFR. B. fosforylaatio ERK1 /2. C. fosforylaatio AKT. Fosforylaatio laskettiin prosenttiosuutena fosforylaation PBS-käsiteltyjen solujen. Datapisteiden edustavat keskiarvoa ± SD arvoista hankittu kolmena kappaleena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta t-testiä (yksisuuntainen, vs. PBS-käsitellyn näytteen vastaavana ajankohtana). *, P 0,05; **, P 0,005; ***, P 0,0005.

Ei vaikutus Y-142 CTF Generation

CTF, joka on tuotettu yhdessä SHB-EGF by ektodomeeni irtoaminen, drives soluproliferaatiota [ ,,,0],25]. Arvioida osuus CTF on soluproliferaation inhibointi Y-142, CTF määrä tutkittiin NUGC-3-soluja. PMA [26] käytettiin verrokkeina edistää ektodomeenia irtoaminen ja CTF tuotantoa. Kuten on esitetty kuviossa. 6, määrä CTF syntyy läsnä ollessa ja puuttuessa Y-142 ei ole olennaisesti erilainen, mikä viittaa siihen, että Y-142 ei ollut mitään vaikutusta sukupolven CTF.

vaikutus CTF havaittuun inhibitioon soluproliferaatiota (Fig. 3B) tutkittiin mittaamalla määrä CTF. Solulysaatteja ja PMA-, kontrolli-lgG, Y-142-, tai Y-073-käsitelty NUGC-3-solut altistettiin SDS-PAGE: lla. CTF havaittiin anti-CTF polyklonaalisen vasta-aineen Länsi-blottauksella.

Keskustelu

HB-EGF koostuu membraaniin sitoutunut muoto (proHB-EGF), liukoinen muoto (SHB EGF), ja C-terminaalista fragmenttia (CTF), ja kullekin muodossa on ainutlaatuinen biologinen aktiivisuus. Näistä 3 muodostaa, toiminta SHB-EGF on laajalti arvioitiin käyttäen yhdistelmä-DNA-proteiineja. Tähän mennessä, biologisen aktiivisuuden proHB-EGF on ehdotettu perusteella vaikutusta transfektoitujen proHB-EGF proliferaatioon ja selviytymistä EGFR-ilmentävien solujen [11], [14] – [16], tai sen perusteella, vaikutusta proHB-EGF ilmentymisen vaikutus autonomisen soluproliferaatioon [17], [18]. Kuitenkin tiedot proHB-EGF-toiminto on ollut niukka ja epäjohdonmukainen, mahdollisesti siksi, ettei menetelmän nimenomaan aktivoimiseksi tai inhiboimiseksi proHB-EGF. Joissakin muissa tutkimuksissa, Lohkeamaton mutantti proHB-EGF (uc-proHB-EGF), jolla on 2 aminohapposubstituutioita (Leu148 ja Pro149) katkaisukohdassa, käytettiin arvioimaan proHB-EGF-toiminto [26]. uc-proHB-EGF: n on osoitettu omaavan juxtacrine aktiivisuutta formaliinilla kiinnitetyt EGFR: ää ilmentävä soluja [27]. Jos uc-proHB-EGF täysin edustaa villityypin proHB-EGF toimintoja jopa elävissä soluissa, tämä mutantti voi olla hyödyllistä tunnistaa proHB-EGF toimintoja pallomainen kulttuuriin. Äskettäin, toinen versio uc-proHB-EGF, jonka katkaisukohta poistettu, käytettiin tutkittaessa proHB-EGF toimintoja. Tämä uc-proHB-EGF esti anoikis of Madin-Darby koiran munuaissolut [28]. Kuitenkin verrattuna nämä lähestymistavat tähän mennessä käytetty, on joitakin etuja lähestymistapamme 3D- sferoidin kulttuurin ja toimiva anti-HB-EGF-vasta-: toiminnot endogeenisesti ilmaistu proHB-EGF voidaan havaita, ja formaliini kiinnittäminen, joka voi aiheuttaa artefakteja, ei tarvita, koska ei ole endogeeninen SHB-EGF-toiminto.

Kertyneet raportit osoittivat, että pallomainen kulttuuri jäljittelee syöpä ympäristöä paremmin kuin 2D kulttuurin kannalta solu-solu kontakteja, lääkeresistenssin, huumeiden levinneisyys, ja ravinteiden hyötysuhde [23], [29]; Näin ollen, toiminnot endogeenisesti ilmaistuna proHB-EGF löytyy 3D sferoidi viittaavat siihen, että proHB-EGF voi olla tärkeä rooli syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa käytimme 3 syöpäsolulinjoja endogeenisesti ilmentäviä proHB-EGF. Y-142 inhiboivat NUGC-3-solujen 72%, 5637-solujen 55%, ja BxPC-3-solujen 24%: iin suurin pitoisuus (Fig. 3B). Kuten on esitetty kuviossa. 1A, 3 solulinjat ovat eri proHB-EGF lauseke (NUGC-3-solut 5637 solua BxPC-3-solut), mikä voi selittää suhteellisen vaikutuksen Y-142 jakautumiseen. 3 solulinjat ovat peräisin maha-, virtsarakko- ja haimasyövän kudoksia, joiden tiedetään yli-ilmentää HB-EGF [30] – [32]. HB-EGF on raportoitu voimistuvan muihin syöpätyyppeihin, kuten rinta- ja munasarjasyövissä, ja glioblastooma [33] – [35]; siksi, proHB-EGF voi käyttää tehtävänsä laajan syöpätyyppeihin.

sferoidi kulttuuri hoito Y-142 lisäsi solujen levinnyt ulos pallomainen ydin (Fig. 3A) . Esto proHB-EGF juxtacrine aktiivisuutta havaittiin jopa 3 d kuluttua Y-142 käsittelyä (Fig. 5), kun solujen diffuusio nähtiin. Spekuloida, että proHB-EGF-välitteistä solu-solu-kontakti on suoraan yhteydessä sen proHB-EGF juxtacrine aktiivisuutta. Tulokset aikaisemmassa tutkimuksessa käyttäen uc-proHB-EGF tukeneet tätä spekulointia, että tulokset osoittivat cytoprotective roolin proHB-EGF tehostamalla EGFR välittämä solu-solu yhteyttä ja osoittivat, että kaspaasi aktivaatio estyi proHB-EGF /EGFR /AKT-reitin [28]. Olemme myös havainneet kaspaasin aktivaatio ja esti EGFR ja AKT fosfory- Y-142 kohtelun pallomainen kulttuuri (kuviot. 4, 5A ja 5C). Meidän tulokset voivat olla peräisin inhibitio sytoprotektiivista rooli proHB-EGF. Spekuloida, että anti-kaspaasi-toiminto proHB-EGF edistää syövän solujen eloonjäämistä estämällä apoptoosin signaaleja, kuten aktivoitu soluissa suoritettiin kemoterapeuttisten aineiden, sädehoito, hypoksia, ja immuunijärjestelmän soluvälitteinen sytotoksisuus. Aiemmassa tutkimuksessa on raportoitu, että anti-apoptoottinen proteiini BAG-1 välittää proHB-EGF solujen selviytymistä vaikutus [36]. BAG-1-välitteisen solun eloonjäämisen vaikutus proHB-EGF havaittiin CHO-soluissa, joilta puuttuu EGFR, mikä viittaa siihen, että proHB-EGF /BAG-1-reitin käyttää EGFR-riippumaton solujen eloonjäämistä signalointia. proHB-EGF voi käyttää sekä EGFR-riippuvaisen ja EGFR-riippumattomia polkuja käyttämään sen solun eloonjäämisen vaikutuksia. Lisäksi olemme huomanneet esto ERK1 /2 fosforylaatiota Y-142 (kuvio. 5B), mikä viittaa siihen, että solujen lisääntymistä signaalin proHB-EGF välittyy läpi ERK1 /2 kautta. Mitattaessa juxtacrine aktiivisuuden proHB-EGF 3D-pallomainen kulttuuri, olemme huomanneet EGFR signaloinnin Y-142 (Fig. 5), mikä viittaa siihen, että proHB-EGF saa aikaan anti-apoptoottisen ja soluproliferaation toimintoja naapurisolujen kautta niiden EGFR polku. Tapauksissa, joissa syöpäsolut ilmentävät sekä proHB-EGF ja EGFR, sama solu voi toimia luovuttaja ja hyväksyjä solun selviytymisen ja proliferaation signaaleja. Yhdessä me ennustaa, että proHB-EGF tehokkaasti indusoi kasvaimen etenemistä suoraan edistämällä syöpäsolujen lisääntymistä ja estämällä apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 6, Y-142 ei estänyt ektodomeeni irtoaminen, mikä CTF tuotantoa. Sen vuoksi päättelimme, että biologinen aktiivisuus Y-142 täällä ei johdu inhibition CTF tuotantoa.