Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nykyinen merkkiaineita eturauhassyövän, kuten PSA puuttuu spesifisyys. Siksi uusien biomarkkereiden tarvitaan. Valitettavasti monimutkaisuus kehon nesteiden usein vaikeuttaa biomarkkereiden löytö. Houkutteleva vaihtoehto lähestymistapa eristäminen pienten rakkuloiden eli eksosomeiksi, -100 nm, jotka sisältävät proteiineja, jotka ovat ominaisia ​​kudokseen, josta ne ovat peräisin, ja siksi sitä voidaan pitää aarre arkkua tautispesifisten biomarkkereiden löytö.

Materiaalit ja menetelmät

Eksosomit eristettiin 2 kuolemattomaksi ensisijainen eturauhasen epiteelisoluissa (PNT2C2 ja RWPE-1) ja 2 PCa solulinjoissa (PC346C ja Vcap) ultrasentrifugoinnilla. Sen jälkeen tryptinen ruoansulatusta, proteomiikka analyysit hyödynsi nanoLC yhdistettynä LTQ-Orbitrap toimivat rinnakkain MS (MS /MS) -tilassa. Tarkka massa ja Time (AMT) tag lähestymistapaa käytettiin peptidien tunnistamiseen ja määrän. Ehdokas biomarkkerit todensi Western blottauksella ja immunohistokemia.

Tulokset

proteomiikan luonnehdinta tuloksena tunnistettiin 248, 233, 169, ja 216 proteiinit vähintään 2 peptidien eksosomeiksi alkaen PNT2C2, RWPE -1, PC346C, ja Vcap, vastaavasti. Tilastolliset analyysit paljastivat 52-proteiinien eri runsas välillä PCa ja ohjaus soluja, joista 9 oli runsaampaa PCA. Validation Western blottauksella vahvisti korkeampi runsaasti FASN, XPO1 ja PDCD6IP (ALIX) PCA eksosomeiksi.

Johtopäätökset

tunnistaminen exosomal proteiineja käyttäen korkean suorituskyvyn LC-FTMS johti löytö PDCD6IP , FASN, XPO1 ja ENO1 kuin uuden ehdokkaan biomarkkereita eturauhassyöpään.

Citation: Duijvesz D, Burnum-Johnson KE, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) proteomiikan profilointi Eksosomit Johtaa tunnistaminen uusien biomarkkereiden eturauhassyövän. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10,1371 /journal.pone.0082589

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 25 lokakuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Duijvesz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

prostataspesifisen antigeenin (PSA) on kliinisesti käyttökelpoinen proteiini biomarkkereiden diagnostiikan ja seurannan jälkeen hoito eturauhasen syöpä (PCA). Kuitenkin, PSA-seulontaa osoitettiin olevan suuri riski ylidiagnostiikka ja ylihoito koska se ei ole spesifisyyttä [1], [2]. Jotta pystyttäisiin paremmin välillä hyvänlaatuinen eturauhasen sairaudet ja (eri muodoissa) Eturauhassyövän, ehkäistä turhia eturauhasen koepaloja, ja tukea urologina suositella optimaalinen hoito, uusi molekyyli biomarkkerit tarvitaan kiireesti.

Viime vuosikymmeninä , valtava määrä tutkimusta on tehty löytää uusia ja parempia biomarkkereita PCA, usein käyttämällä state-of-the-art massaspektrometrialla teknologioita, mutta löytö uusien vähäisessä määrin proteiini on yleensä haitannut monimutkaisuus seerumin tai virtsan [3]. Eristäminen eksosomeiksi ruumiinnesteistä on houkutteleva lähestymistapa ohittaa nämä rajoitukset ja mahdollistaa havaitsemisen ehdokas (matala runsas) biomarkkereita.

Viimeaikaiset havainnot etsittäessä uusia biomarkkerit ovat osoittaneet, että pienet eksosomeiksi (50-150 nm) , ovat läsnä seerumissa ja virtsassa [4]. Eristämällä eksosomeiksi ruumiinnesteistä olisi mahdollista välttää dynaamisen alueen haaste ja helpottaa karakterisointi kudoksen /syöpä-proteiineja, jotka saattavat edustavat tarkemmin solun olosuhteissa. Siksi eksosomeiksi voisi olla hyödyllinen määritettäessä yksittäisten kasvainten ominaisuuksiin [5], [6].

Tässä tutkimuksessa tavoitteenamme oli määritellä läsnäolon ja merkityksen exosomal proteiinien uusina ehdokas biomarkkereita PCA vertaamalla eksosomeiksi alkaen ei-syöpä eturauhasen solulinjojen eksosomeiksi PCA solulinjoista.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja eristäminen

Kaksi ihmisen kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen solulinjoja (PNT2C2 [7] ja RWPE-1) ja kaksi PCa solulinjoissa (PC346C [8] ja VCAP [9]) viljeltiin 10 T175 (175 cm

2) dosviljelypulloihin (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa) enintään 80- 100% konfluenssiin. PNT2C2 ja VCAP solulinjaa viljeltiin RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Belgia) ja täydennetty 5% ja 10% FCS, 500 U penisilliiniä ja 500 U streptomysiiniä (Lonza, Verviers, Belgia). RWPE-1 solulinja (ATCC-LGR, Wesel, Saksa) viljeltiin Keratinosyyttien Serum Free Medium (Invitrogen, CA, USA) ja täydennetty 5 ml Pen-Strep ja kaupallista pakkausta, joka sisältää naudan aivolisäkeuutteella (BPE, 0,05 mg /ml) ja epidermaalisen kasvutekijän (EGF, 5 ng /ml). PC346C solulinja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa, Hamin F-12-väliaineessa (Lonza), johon oli lisätty useita lisäaineita, kuten on kuvattu julkaisussa Marques [10].

saavuttamisen jälkeen 80-100%: n konfluenssiin, solut inkuboitiin 25 ml seerumitonta väliainetta. 48 tunnin kuluttua supernatantti otettiin talteen ja sentrifugoitiin vaiheet 400 x

g

(10 min), 3000 x

g

(20 min), ja 10000 x

g

(30 min) solujätteen poistamiseksi. Eksosomit sitten pelletoitiin 64000

g

(110 min), ja 100000

g

(sakkaroosigradienttisedimentaatiolla) 1 h [11]. Vähintään kaksi erillistä eksosomeiksi eristykset kustakin neljästä solulinjojen yhdistettiin. Kokonaismäärästä ja pitoisuus exosomal proteiinien yhdistetyistä näytteistä mitattiin BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL, USA).

Electron Microscopy (EM) B

5 ui eksosomeiksi oli täplittäin formvar päällystettyjä verkot (200 mesh) ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä. Sen jälkeen kiinnitysajan eksosomeiksi värjättiin negatiivisesti käyttämällä 4% uranylacetate. Ristikot tutkittiin Philips CM100 elektronimikroskoopilla 80 kV.

Näytteiden valmistus spektrometria

TFE (2,2,2-trifluorietanoli) (Sigma-Aldrich) lisättiin näytteisiin loppukonsentraatioon 50%. Näytteet sonikoitiin jää-vesihauteessa (Branson 1510, Danbury, CT) 2 minuutin ajan ja inkuboitiin sitten 60 ° C: ssa 2 h jatkuvasti ravistaen (300 rpm). Proteiinin disulfidisillan (S-S) vähentäminen, DTT (ditiotreitoli) (Sigma-Aldrich) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 2 mM, minkä jälkeen sonikoimalla 2 min. Näytteet sentrifugoitiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h ravistellen (300 rpm). Näytteet laimennettiin, 5-kertaisesti 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 7,8) ennen lisäämistä sekvenssointilaatua modifioitu trypsiini (Promega, Madison, WI) proteiinien ruuansulatusta (01:50 w /w trypsiini-to-proteiini). Näytteitä ravisteltiin (300 rpm) yön yli (16 h). Rapid jäätyminen näytteiden nestemäisessä typessä sammutettiin ruoansulatusta. Kaikki näytteet väkevöitiin Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, NY).

Massaspektrometria

proteomiikan mittaukset suoritettiin käyttäen nanoLC-MS Environmental Molecular Science Laboratory (EMSL), Richland, WA, USA. Analyyttinen alusta koostui on-line jatkuva paine (5000 psi) käänteisfaasi- (C

18) nestekromatografia (RPLC) järjestelmä [150 pm id x 360 um od × 65 cm kapillaarinen (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , AZ)] kytketty LTQ-Orbitrap massaspektrometriä (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) kautta sähkösumutusionisaatiota (ESI) lähde valmistetaan talon [12]. Lyhyesti, koko MS hankittiin yli

m Twitter /

z

valikoima 400-2000 resoluutioksi 100000, jonka jälkeen data-riippuvainen LTQ MS /MS kuuden parhaan runsain ioneja kussakin täysi MS skannaa käyttäen törmäyksen energia asetus 35% ja dynaaminen syrjäytymisen aika 60 s. Eksponentiaalinen HPLC gradienttia -100 min (0-70% B) käytettiin kutakin analyysiä, jossa mobiili vaiheet koostuu 0,1% muurahaishappoa vedessä (A) ja 0,1% muurahaishappoa ACN (B). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena, noin 5 ug kokonais peptidin kulutettu (ts ladattiin pylvääseen) kussakin analyysissä.

massaspekrometria Data Analysis

Tuloksena MS analysoitiin käyttäen PNNL kehitetty Tarkka massa ja Time (AMT) Tag putki [13]. SEQUEST ohjelmisto [14] käytettiin etsimään tandem massaspektrit vastaan ​​UniProt ihmisen tietokanta (download 5. huhtikuuta 2011). Luottavaisesti tunnistettu peptidejä (taulukko S1 tiedosto S1) koottiin osaksi eksosomi-erityisiä AMT tag tietokantaan. Vertailujen kannalta ja LC-MS ominaisuuksia on verrattava AMT tageja tunnistamista ja suhteellisen MS-huippuintensiteetit käytettiin johtaa muutokseen runsaasti. AMT tag lähestymistapa helpotti kvantitoimiseksi paljon enemmän peptidejä kuin spektrin laskenta yksin. Niin kauan kuin peptidi tunnistettiin vähintään yksi näyte /analyysi (tandem MS), se voitiin määrittää kaikissa aineistot jossa se on todettu, vaikka LC-MS ominaisuutta ei ollut runsas tarpeeksi pirstoutuu kyseisessä analyysissä . Viper ohjelmiston [15] käytettiin korreloida AMT tag merkintöjä (tunnistettu peptidit) LC-MS riippuvia ominaisuuksia suuren massan mittaustarkkuuden (MMA 2 ppm) ja normalisoitu eluutioajasta tarkkuus (NET~2.5%). Näin ollen jokainen LC-MS ominaisuus sovitettu takaisin yhteen peptidi (AMT tag) mikä antaa piikin intensiteetin arvo (tai suhteellinen runsaus) varten, että peptidi. Irtisanotuille peptidi tunnisteiden ollessa kyseessä yhden peptidin vastaavia useita proteiineja (tyypillisesti proteiini-isoformit) kuvaava ja proteiini valittiin; Siksi jokainen raportoitu peptidi täsmää takaisin yhteen proteiiniin. Ei peptidi tunnistukset tehtiin massa yksin.

263 tunnistettu proteiineja, ihmisen proteiini viitetietokantaan (HPRD) ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) käytettiin määrittämään subsellulaariseen sijainti ja biologinen toiminta [16].

Valikoima mahdollisia proteiinin biomarkkereita eturauhassyövän suoritettiin käyttäen kahta itsenäistä lähestymistapoja. Ensin proteiinit valittiin, jotka olivat läsnä molemmissa PCa solulinjassa peräisin eksosomeiksi ja puuttuvat sekä ei-PCa eksosomeiksi. Toisella lähestymistapa, Dante ohjelmistojen [17] käytettiin muuntamaan peptidi piikin intensiteetin arvot on log2 mittakaavassa ja arvioida niitä proteiinia tasolla käyttäen Rrollup (viite peptidi perustuu skaalaus) parametrit, joihin peptidit ulkopuolelle skaalaus jos niitä ei nähty vähintään kolme aineistoja eikä pienin peptidi läsnäoloa vaadittiin. Proteiinit esitetty tässä käsikirjoituksen tunnistettiin vähintään kaksi peptidejä. ANOVA pareittain vertailuja kunkin PCa ja ohjaus solulinjasta tehtiin myös Dante jossa vähimmäismäärä datapistettä kohden tekijätasojen asetettiin kolme, niin että jotta proteiinin osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia sen on merkittävä kaikissa kolme toistoa. Merkittävä ero määritettiin p-arvon ja Q-arvo pienempi kuin 0,05. DANTE generoi p-arvot ja arvioi niiden q-arvoja. Q-arvo testi mittaa osuus väärien positiivisten aiheutuneet (kutsutaan väärä löytö korko), kun kyseisen testin kutsutaan merkittäviä. Vain merkittävästi erilainen proteiinit valittiin ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi. Cluster ja TreeView ohjelmaa käytettiin log-muunnos, tarkoittaa keskus suhteellinen ilmaisu arvoja, ja sen jälkeen hierarkkinen klusterin kaikki proteiinit perustuen niiden ilmaisun [18]. Edelleen valita lupaavimmat proteiinit, a≥1.5 log2 kertainen muutos sulku on sovellettu sekä vaatimus, että kukin proteiini osoitti merkittävän muutoksen ainakin kaksi neljästä vertailut lueteltu taulukossa 1. Taulukossa 1 luetellaan tuloksena 52-proteiineja, 9 joka oli kohonnut (ja 43 laski) runsautta eksosomeiksi johdettu PCA soluista.

edelleen valita lupaavimmat proteiineja kahdesta lähestymistavasta, proteiinit skaalattu perustuen eturauhasen preferentiality. Viisi eri ihmisen geenien ilmentymisen kartastoista [19] – [23] perustuvat microarray ilmaisun tiedot yhdistettiin SRS [24], määrittää proteiinia vastaavan geenin ilmentymisen. Lopulta, eturauhasen preferentiality määritettiin 1,5-kertainen ekspression eturauhaskudoksessa kuin munuaisten ja virtsarakon kudoksessa käyttämällä geenien ilmentyminen microarray tietoja. [25]

Western blotting

Jokaisesta eksosomi näyte 5 ug proteiini sekoitettiin Laemmli-näytepuskuria (01:01), kuumennettiin 95 ° C: ssa kaksi minuuttia ja ladattiin 10% yksiulotteinen SDS-PAGE-geeleillä. Sen jälkeen, proteiinit siirrettiin Protran nitroselluloosakalvoille (Whatman n Hertogenbosch, Alankomaat) ja blokattiin (1 h) huoneen lämpötilassa 5% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroitua suolaliuosta, jossa oli 0,1% Tween-20. Sitten geelejä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineilla: PDCD6IP (1:500 laimennus, Sigma-Aldrich), FASN (1:500 laimennus, Sigma-Aldrich), XPO1 (1:200 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa), ENO1 (klooni H300, 1:1000 laimennus, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (klooni 7B, 1:500 laimennus, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (klooni 209306, 1:500 laimennus, R 0,05).

Valikoima mahdollisia biomarkkereita

Valitse proteiineja, jotka osoittavat merkittävää muutosta runsaasti väliin PCA eksosomeiksi ja non -PCa eksosomeiksi käytimme ANOVA pareittain vertailuissa (eli p-arvo ja Q-arvo 0,05, läsnäolo kaikilla analyyseissä, ≥2 peptidit) [17]. Taulukko S4-8 tiedosto S1 sisältää tulokset, jotka on saatu PC346C (PCA) vs. PNT2C2 (kontrolli), PC346C (PCa) vs. RWPE-1 (kontrolli), Vcap (PCA) vs. PNT2C2 (kontrolli), ja Vcap ( PCa) vs. RWPE-1 (kontrolli). Parantaakseen edelleen luottamusta, me tarvitaan, että kukin proteiini määritettiin olevan merkittävästi muuttuvan runsaasti vähintään 2 vertailuja; Tämä vähentää edelleen listalta 52 proteiineihin (taulukko 1 ja taulukko S9 tiedostoon S1).

proteomiikka-analyysi osoitti PDCD6IP, FASN, CD9, ja ENO1 on merkittäviä muutoksia runsaasti kahden olosuhteissa, kun taas XPO1 teki kulje tiukat suodatusehtoja minkä vuoksi niitä pidettiin ennallaan runsaasti Vcap vs. RWPE-1 verrattuna (taulukko S8 tiedosto S1). Jopa niin, päätimme vahvistaa XPO1 koska sen korkeamman runsautta VCAP eksosomeiksi verrattuna RWPE-1 ohjaus ja saatavuutta laadukas vasta-soveltuu Western blottaus ja immunohistokemia.

Exploration of novel ehdokas biomarkkereita

FASN ja XPO1, voimakas signaali havaittiin kokosolulysaattien verrattuna eksosomeiksi ja näyttää olevan suhteellisesti suurempi runsaasti sisällä Vcap eksosomi näytteen (kuva 4). Proteiini PDCD6IP on rikastunut eksosomeiksi ja arvo on suurempi runsaus sekä PCa johdettuja eksosomi näytteitä kuten kuvassa 4 ja taulukossa 1. Perustuen MS analyyseihin, FASN on huomattavasti korkeampi PC346C eksosomeiksi verrattuna sekä tarkastuksia ja VCAP eksosomeiksi verrattuna ja RWPE-1 ohjaus. Tämä korkeampi runsaus FASN vuonna PC346C vahvistaa Western blot. CD9 on hyvin rikastettu eksosomeiksi osoittaa suhteellisen suuri yltäkylläisyyden PC346C eksosomeiksi. XPO1 oli korkeampi runsautta VCAP eksosomeiksi kontrolleihin verrattuna. MS data tunnettu ENO1 olla merkittävästi vähentynyt runsaasti PC346C verrattuna sekä tarkastuksia ja VCAP verrattuna PNT2C2 valvontaa. Western blottaus ENO1 paljasti ylimääräisen bändi (noin 30 kDa) sisällä kaksi PCa johdettuja eksosomi näytteitä. Kuten odotettua, joka perustuu eron PSA-eritystä ja eksosomi muodostumista, PSA on vallitsevasti läsnä kaksi syöpäsolujen näytettä ja poissa eksosomeiksi. Supernatantit että kerättiin jälkeen eksosomeiksi pelletoitiin aikana ultrasentrifugoimalla, ei sisällä mitään exosomal proteiineihin kuin ENO1 ja GAPDH ainutlaatuisesti in VCAP väliaineessa.

Kaikki neljä eksosomi näytteitä ja niitä vastaavat solulinjoja käytettiin vahvistettavaksi. Lisäksi supernatantti pelletoitiin eksosomeiksi käytettiin kontrollina. Valitut proteiinit FASN, XPO1, CD9 ja PDCD6IP, testattiin ENO1 ja GAPDH kontrolleina. PSA testattiin vahvistaa sitä erittyy vaihtoehtoisin eritystapahtumasarjan ja siksi ole läsnä sisällä eksosomeiksi. Lähin proteiinimarkkeri (kDa) on kullekin blot.

tarkastaminen ilmaisun kliinisissä näytteissä

PDCD6IP osoitti vahvaa luminaalisen ja pohjapinta epiteelin sytoplasmista värjäytymistä normaalissa viereisen eturauhasen (NAP) ilman muutos proteiiniekspressiossa PCA kudoksessa eri Gleason tulokset (kuva 5). Vuonna NAP, FASN on kohtalaisen hyvin runsas epiteelisoluissa. Kuitenkin, kun Gleason tulokset kasvaa, värjäys voimistuu. Mitä XPO1, on vahva ydinvoima runsautta NAP ja heikko sytoplasminen värjäys. Sisällä PCa soluja, sytoplasminen runsaus kasvaa Gleason tulokset. Tumavärjäystä säilyy samana kaikkien PCa kudoksissa.

edustaja kuvia värjäys 2 itsenäistä näytettä per ryhmä.

Keskustelu

vertailu eksosomeiksi peräisin syöpäsolun linjat ja kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen tarjoaa tehokkaan työkalun voittamiseksi dynamiikan haasteeseen ja tunnistaa uusia matalan runsas syöpää peräisin biomarkkerit. Tämä ainutlaatuinen lähestymistapa exosomal proteiinin tutkimusta, yhdistettynä state-of-the-art LC-MS-analyysit helpotti tunnistaminen uusien ehdokas biomarkkereiden PCA. Tutkimuksessa kuvataan exosomal proteiinin ilmentymisen useilta PCa solulinjoista, mutta myös tutkii eksosomi sisältöä useista kuolemattomaksi normaalin eturauhasen epiteelisolujen. Verrattuna aikaisempiin tutkimuksiin, tämä antaa meille mahdollisuuden luotettavammin tunnistaa PCa-ehdokkaan biomarkkereita ja yhteisiä exosomal proteiineja. Käyttämällä Western blotting ja IHC, me tarkistaa differentiaalikaavojen ja osoittaa, että ehdokas markkereita ilmaistaan ​​syöpäsolujen potilaan näytteissä.

kokonaismäärä proteiineja tunnistimme tässä tutkimuksessa (496 by ≥1 peptidi, 263 by ≥2 peptidejä), on verrattavissa aiemmin julkaistu eksosomi proteomic raportteja. [26] – [30]. Tehtävä on solunosasijaintia paljasti, että suuri osa exosomal proteiinien yleensä paikantaa sytoplasmassa tai tumassa soluja. Kun verrataan tätä tietokantaan, joka sisältää suurimman osan kaikista proteiineista (~20,000), havaitsimme, että eksosomeiksi on suhteellisen vertailukelpoinen runsaasti tumaproteiinit, korkeampi runsaasti soluliman proteiinien ja huomattavasti pienempi runsaasti solunulkoisia proteiineja. Tämä sopii nykyinen teoria eksosomi muodostumisen [4]. Eksosomit näyttää yliedustettuina transmembraanisen ja sytoplasmisen proteiineja, kuten CD9 ja PDCD6IP, kuten Western blotit. Tämä havainto yhtyy teoria, että biogeneesiä ja valinta exosomal sisältö ei ole satunnainen menettely, mutta ainakin osittain seurausta lajittelu prosessin [4].

Kaksi viimeaikaista proteomic tutkimukset paljastivat exosomal proteiinit liittyvät eturauhasen syöpä [30], [31]; Sandvigin

et al.

Suoritettiin LC-MS-analyysi yhdellä eturauhasen (syöpä) solulinja, oli Hosseinia-Beheshti

et al.

Tutki viisi PCa solulinjojen ja yhden ei-pahanlaatuisen eturauhasen epiteelisolujen solulinjassa. Molemmat raportoitiin 266 ja 220-proteiinit, joka on samanlainen kuin numero me paljasti. Mielenkiintoista, Sandvig

et al.

Raportoitu eri proteiiniin subsellulaariset jakelu- ja korrelaatio biologisiin prosesseihin verrattuna tietomme. Sandvig

et al.

Ehdotettu CDCP1 ja CD151 ehdokkaana markkereita, olivat Hosseini-Beheshti ehdotti ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 ja GDF15. Hosseini-Beheshti

et al.

Osoitti myös FASN olla eksosomeiksi johdettu ehdokas biomarkkereiden (yhteisymmärryksessä tuloksemme). Kun vertaamme heidän tunnistettu proteiineja (by 2 peptidit) havaitsimme päällekkäisyys vain 9 proteiineihin CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EPCAM, HSPB1, PDCD6IP ja PRDX1 (kuvio 6). Nämä proteiinit on julkaistu aiemmin useita artikkeleita ja katsotaan olevan läsnä lähes kaikissa eksosomeiksi. PDCD6IP on myös todettu sekä tutkijoille, mutta sitä ei ole havaittu olevan runsaasti PCa-johdettu eksosomeiksi. Kaikkiaan 199 proteiineja ainutlaatuisesti havaittu tutkimuksessamme, mukaan lukien ehdokas biomarkkereiden XPO1. Päällekkäisyys tutkimusten välistä on melko rajallinen. Erityisesti päällekkäisyyttä vain 42-proteiinien välillä Tutkimuksemme ja Hosseini-Beheshti

et al.

Ei odoteta, koska osapuoli samoja solulinjoja käytettiin (VCAP ja RWPE-1). Tämä kapea päällekkäisyys voi olla seurausta eri puhdistusta, MS-MS tekniikoiden ja tietojenkäsittely putkistojen hyödyntää. Lisäksi jos eksosomeiksi sisältävät suuren kokoelman erilaisia ​​proteiineja, päällekkäin tietokantojen välillä voidaan rajoittaa, jos vain murto-osa kaikista proteiinien tunnistetaan kussakin tutkimuksessa. Tuoreessa raportissa Principe

et al.

Osoitti Ensimmäisiä yli 900 proteiineja eksosomeiksi peräisin ihmisen eturauhasen nestettä potilaalla on huono laatu PCa ja terveillä miehillä [32]. Kun verrataan niiden ainutlaatuinen proteiinin ilmentymisen (läsnäolo 2 peptidit), vain 31 proteiineja päällekkäisiä, mukaan lukien useita annexins (ANXA1-7), peroxiredoxins (PRDX1-6), PDCD6IP ja yleinen transmembraaniproteiineja (CD9 /CD242 /CD44). Kaikki nämä proteiinit ovat ajatellaan olevan läsnä lähes kaikissa eksosomeiksi. Missä määrin rajallinen päällekkäisyys johtuu todellisen eroista solulinja johdettu eksosomeiksi ja rakkulat kliinisistä näytteistä, vielä vahvistettava.

määrä proteiinien tunnistettu jokaisessa tutkimuksessa ovat koosteen syöpää johdettu exosomal proteiinit tunnistettiin MS-MS.

Havaitsimme PDCD6IP olevan rikastunut eksosomeiksi, erityisesti PCA eksosomeiksi. PDCD6IP, joka tunnetaan myös nimellä ALIX, on sytoplasminen proteiini, joka on tunnettu sen rooli apoptoosin ja on osoitettu olevan mukana reitin valittujen lajittelua ESCRT-kompleksit [33]. PDCD6IP on käytetty yleisesti merkki osoittaa läsnäolon eksosomeiksi [34]. Ei kuitenkaan yhdistys tehtiin korkeammalla runsaasti syöpää peräisin eksosomeiksi. Mahdollinen selitys korkealle PDCD6IP runsaus PCA-johdettu eksosomeiksi voisi olla, että PCa solut ovat muuttunut tuotanto eksosomeiksi, joissa he eivät voi säädellä lajitteluun exosomal sisällön oikein enää. On myös mahdollista, että syöpäsoluja yrittää poistaa PDCD6IP proteiinin eksosomi erittymisen (osittain) tukahduttaa apoptoosin. Täydennykseksi tätä teoriaa, muut PCa liittyvät tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen PDCD6IP korreloi solukuolemaa [35]. Käyttämällä IHC, emme löytäneet mitään eroa PDCD6IP runsaasti normaalin eturauhasen epiteelissä ja PCa kudosta.

Sekä FASN ja XPO1 on suurempi runsaasti PCA eksosomeiksi peräisin VCAP soluista. FASN katalysoi muodostumista pitkäketjuisten happojen asetyyli-CoA, malonyyli-CoA: n ja NADPH: n ja on jo ehdotettu markkerina PCa [36], [37]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että FASN ensisijaisesti ilmaistaan ​​hormoni-herkkien solujen, edistää solujen lisääntymistä ja että esto FASN tehokkaasti ja valikoivasti tappaa syöpäsoluja [36]. Nämä tutkimukset suoritettiin kaikki

in vitro

. Vcap solulinja tässä käytettynä on hormoni-herkkä, mikä voisi selittää korkeamman runsaasti FASN in VCAP johdettu eksosomeiksi. Syöpäsolut tuottavat enemmän FASN, todennäköisemmin koska se edistää solujen lisääntymistä, mikä voi johtaa korkeampiin sisällyttämistä eksosomeiksi. Yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa [38], myös havaittu lisääntynyt runsaasti PCA verrattuna NAP.

XPO1 on ehdotettu ennustetyövälineenä merkkiaine muiden syöpien [39]. XPO1 on ydinvoima proteiini tiedetään olevan mukana ydinaseiden-sytoplasman vienti signaali-laakeri (NES) proteiinit, jotka on rooli asiaa kasvain signalointireittien, kuten P53, AKT1, HDAC5, androgeenireseptorin (AR) ja EGFR [40] – [42]. Tuloksemme osoittavat, että XPO1 voisi olla potentiaalinen biomarkkereiden PCA. Kun tämä proteiini on validoitu koko jakson PCa näytteiden IHC, vietämme vahva ydin- ilme ja hyvin heikko sytoplasmisen ilme. Mielenkiintoista on, että sisällä syöpäsoluja, tämä proteiini näyttää translokoida sytoplasmaan. Yhä Gleason pisteet, sytoplasmisen XPO1 ilmaisu kiristyessä. Miksi tämä prosessi tapahtuu edelleen epäselvä. Normaalissa solussa, XPO1 on kuljetettava solulimassa takaisin tumaan toimiakseen kaperoniproteiinina. Jos tämä uudelleenasutuksen estyy syövässä, sytoplasman XPO1 kertyy enemmän XPO1 saattaa saada sisällytetty eksosomeiksi.

Kuten aiemmin julkaistuista ylimääräinen proteiini bändi (noin 30 kDa) ilmestyy Western blotting käytettäessä vasta-ainetta vastaan ​​ENO1 että PC346C solulinjassa [43]. Tässä osoitamme, että tämä bändi on läsnä myös VCAP eksosomeiksi ja poissa eksosomeiksi kahdesta ei-PCa solulinjoissa. Alkuperä lisäksi kaistan voisi olla ei-spesifinen vasta-aine ristireaktio toisen proteiinin, vaihtoehtoinen saumattu ENO1, joka on käännetty fragmentti tai hajoamistuote alkuperäisestä proteiinista. Tunnettu proteiini-isoformi kutsutaan MBP-1 (c-myc-promoottori-sitova proteiini-1) on tuotettu muodossa ENO1 geenin [44]. MBP-1 on sekvenssiltään identtinen ENO1 mutta puuttuu ensimmäiset 93 tai 96 aminohappoa. Jonka laskettu molekyylimassa 36 kDa, MBP-1 on epätodennäköistä arvioitu 30 kDa ylimääräistä bändi. Havainto, että tämä ylimääräinen bändi esiintyy vain molemmat syöpä- näytteissä voisi osoittaa, että se voisi olla suhteessa PCa.

Uusi merkkiaineita tunnistimme tuli solulinjasta johdettuja eksosomeiksi. Vaikka exosomal läsnäolo ja syöpä kudosilmentämisen valittuihin ehdokas biomarkkereiden vahvistettiin käyttäen Western blotting ja IHC, riippumaton validointi ehdokas merkkiaineiden tarvitaan edelleen laaja kokoelma näytteitä kuten potilaan virtsan eksosomeiksi tai kudosnäytteitä. Tämä selvittää niiden rooli biomarkkerina PCA.

Näin voit kokeilla läsnäolo exosomal proteiinien suuret ikäluokat potilaan näytteitä, voidaan turvautua standardin IHC ehdokas merkkiaineiden kudossiruina ja eturauhasen koepaloja. Vaihtoehtoisesti, ehjä eksosomeiksi voidaan eristää virtsasta tai plasmasta käyttäen saostamalla, suodattamalla tai immunosieppaus protokollia, jonka jälkeen sisällön eksosomeiksi voidaan mitata ELISA-, joka on spesifinen kiinnostuksen kohteena olevia proteiineja. ELISA kehitetään parhaillaan havaitsemiseksi ehjä eturauhasen johdettujen eksosomeiksi käyttäen capture tai havaitsemista vastaan ​​suunnattujen vasta tunnetaan prostataspesifisen transmembraaniproteiineja. Tällainen määritys tekee mahdolliseksi tunnistaa ilmentymisen läpäisevien proteiinien, mutta myös arvioida määrää eksosomeiksi.

Johtopäätös

Prostate (syöpä) solut erittävät eksosomeiksi, joita voidaan käyttää tunnistamaan uusia ehdokas biomarkkereita PCa . Tunnistaminen exosomal proteiinien korkean suorituskyvyn LC-FTMS johti löytö PDCD6IP, FASN, XPO1 ja ENO1 kuin uuden ehdokkaan biomarkkereita PCA. Seuraavassa vaiheessa, kaikki ehdokkaan biomarkkerit arvioidaan potilaan näytteistä (kudos, seerumi tai virtsa) täysin selvittää niiden potentiaalista kliinistä arvoa.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

Tukevaa tietoa, joka sisältää 9 olevat tiedot tiedostoja. Taulukko S1 tiedostoon S1: Luotettavasti tunnistetut peptidit (n = 1494) koottiin osaksi eksosomi-erityisiä AMT tag tietokantaan. Taulukko S2 tiedostossa S1: 1494 ei-tarpeeton peptidien vastaa 496 proteiinien vähintään 1 peptidi.