Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

RNaaseista parhaillaan tutkitaan ei-mutageeninen vaihtoehtoja haitallisen DNA: ta vaurioittavien syöpälääkkeiden yleisesti kliinisessä käytössä. Monet nisäkkäiden RNaaseista eivät ole voimakkaita myrkkyjä vahvan inhibitiolle ribonukleaasi estäjä (RI) esitetään sytoplasmassa nisäkässoluissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Etsiessään uusia tehokkaita syövän vastaisia ​​RNaaseja me tutki vaikutuksia barnasegeenin, ribonukleaasi alkaen

Bacillus amyloliquefaciens

, ihmisen syöpäsoluja. Huomasimme, että barnasegeenin kestää RI. MTT solunelinkykyisyysmääritys, barnasegeenin oli sytotoksinen ihmisen sinoomasolulinjoja puoli-eston pitoisuuksien (IC

50) vaihtelevat 0,2-13 uM ja leukemia solulinjoissa IC

50-arvot vaihtelevat 2,4-82 uM . Lisäksi olemme tunnettu sytotoksisia vaikutuksia barnasegeenin-pohjainen immunoRNase scFv 4D5-dibarnase, joka koostuu kahdesta barnasegeenin molekyylien sarjaan fuusioitu yhden ketjun vaihtelevan fragmentti (scFv) Humanisoidun vasta-aineen 4D5, joka tunnistaa solunulkoisen domeenin syöpämarkkerina HER2. ScFv 4D5-dibarnase spesifisesti sitoutuu HER2-positiivisten solujen ja sen sisäistetään kautta reseptorivälitteisen endosytoosin. Solunsisäinen lokalisaatio sisäistetty scFv 4D5-dibarnase määritettiin elektronimikroskopian. Sytotoksinen vaikutus scFv 4D5-dibarnase on HER2-positiiviset ihmisen munasarjasyövän SKOV-3-soluja (IC

50 = 1,8 nM) oli kolme kertaluokkaa suurempi kuin barnasegeenin yksin. Sekä barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase indusoiman apoptoosin SKOV-3-soluja mukana internukleosomaalisen kromatiinin pirstoutuminen, kalvon rakkuloituminen, ulkonäkö fosfatidyyliseriinin ulko- seloste solukalvon, ja kaspaasi-3.

johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset osoittavat, että barnasegeenin on voimakas myrkyllisen aineen kohdentamiseksi syöpäsoluja.

Citation: Edelweiss E, Balandin TG, Ivanova JL, Lutsenko GV, Leonova OG, Popenko VI , et ai. (2008) barnaasin uutena Terapeuttisen laukaisu apoptoosi ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 3 (6): e2434. doi: 10,1371 /journal.pone.0002434

Editor: Gideon Schreiber, Weizmann Institute of Science, Israel

vastaanotettu: 22 elokuu 2007; Hyväksytty: 13 toukokuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Edelweiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Venäjän perustutkimusrahaston (nro. 07-02-00649, 07-04-00584, 06-04-49686-a), SNSF (nro IB73AO-110842/1), ja ohjelma ” Molecular and Cell Biology ”RAS.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

barnaasin, ribonukleaasi alkaen

Bacillus amyloliquefaciens

, syntetisoidaan aktiivisena proentsyymituotteina, käsitellään poistamalla aminoterminaalisen signaalipeptidin, ja erittyy solunulkoiseen tilaan. Tässä bakteerilajit, barstar, tietyn solunsisäisen estäjä barnasegeenin, on tuotettu. Barstargeenin tiukasti sitoutuu barnasegeenin ja estää siten sen solunsisäistä entsyymiaktiivisuutta ja suojaa isännän soluja vahingollista vaikutusta tämän RNaasia. Barnasegeenin on pieni (110 aa) yhden ketjun proteiinia. Sillä ei ole disulfidisidoksia, eikä vaadi translaation jälkeiset modifikaatiot, kaksiarvoisia kationeja, tai muita ei-peptidi-komponentteja sen toiminta [1], [2]. Koska nämä suotuisat ominaisuudet, barnasegeenin on aktiivinen missä tahansa solussa, jossa sitä ilmennetään. Kyky barnasegeenin pilkkoa RNA on hyödynnetty monenlaisia ​​bio-sovellusten käyttöönoton jälkeen tämän entsyymin soluihin aiheuttaa solukuolemaa. Erityiset ablaatio erityisesti solujen on mahdollista ohjaamalla barnaasigeenin ilmentymisen kautta käyttämällä solun promoottorit [3] – [5]. Vaihtoehtoisesti proteiineja, jotka kohdistuvat barnasegeenin tiettyihin soluihin antaa spesifisyys barnasegeenin toimia [6] – [8].

myrkkyvaikutus barnaasigeenin ilmaisua käytettiin suunnittelemaan vektoreita positiivisen valinnan kloonattujen inserttien [9], [10], tuottaa miehen ja naisen hedelmättömyyttä kasveille [11], [12], antaa sukkulamatojen vastustuskykyä viljelykasvien [13], tuottaa voimakkaita aineita tappaa kolmannen vaiheen toukkaa puuvillan puuvillakoi [14], tutkia aiheuttamia sairauksia menetys tietyn solutyypin nisäkkäissä, ja poistamaan syöpäsoluja [5]. Nämä esimerkit osoittavat selvästi tehokas ja spesifinen poistaminen solujen eri lajien käyttämällä barnaasigeenin ilmentymisen; kuitenkin vähän työtä on keskittynyt ulkosyntyisten lisäämisen barnasegeenin pahanlaatuisiin ja normaalit nisäkässolut. Itse asiassa tutkittaessa barnasegeenin nefrotoksisuutta on ainoa julkaistu esimerkki [15]. Siksi Työn tavoitteena oli kuvata vaikutuksia ribonukleaasi barnasegeenin ihmisen syövän ja normaalit solut.

RNaaseista parhaillaan intensiivistä tutkimuksen niiden syövän vastaista potentiaalia [16], [17]. Lupaavin joukossa ovat ihmisen haiman-tyyppinen RNaaseista hyvin siedetty ihmisen immuunijärjestelmää. Mutta sytotoksisen potentiaalin monia niistä on vähentää niiden herkkyyttä inhibitiolle sytoplasman ribonukleaasi-inhibiittoria (RI) löytyy jokaisen nisäkässolussa tutkittu [18]. Useat lähestymistavat on tutkittu vähentää herkkyyttä haiman-tyyppinen RNaaseista RI [19] – [22]. Käyttö RNaaseista luontaisesti vastustuskykyisiä RI on toinen tapa voittaa tämän esteen. Olemme tutkineet herkkyyttä barnasegeenin RI ja totesi, että barnasegeenin on onneksi herkkä inhibitiolle RI.

Syöpäsolut ovat tietyn solupopulaation, tunnettu siitä, että läsnä on kasvain-promoottorit ja syövän markkereita. Yksi näistä merkeistä on HER2-antigeenin (kutsutaan myös HER-2, erbB2- p185HER-2), joka on yli-ilmentynyt useissa erilaisissa ihmisen kasvainten [23], etenkin munasarjojen ja rinnan karsinoomat [24], [25]. Olemme fuusioitu kahden barnasegeenin molekyylejä yhden ketjun vaihtelevan fragmentti (scFv) Humanisoidun vasta-aineen 4D5, joka tunnistaa ekstrasellulaarisen domeenin HER2, tuottaa scFv 4D5-dibarnase [8]. Teimme immunoRNase (IR), joka sisälsi kaksi ribonukleaasit kantoaaltoa kohti, koska spesifisen sytotoksisuuden rajoittaa solun pinnan tiheyttä HER2-antigeenin. Tämä kokoonpano mahdollisti käyttöönoton kahdesti ribonukleaasivaikutus soluihin yhdellä HER2-reseptoriin. Kuten on esitetty aiemmin [26], joka on kaksi kertaa suurempi määrä RNaasi molekyylien immunokonjugaatin voimistaa sen viisitoista-kertaiseksi. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia scFv 4D5-dibarnase pystyy vuorovaikutuksessa spesifisesti HER2-positiiviset ihmisen munasarjan soluja, sisäistää soluihin, ja vievät sytotoksisuuden.

Näin ollen tässä työssä me arvioitu etuja of barnasegeenin kehittämiseksi syöpälääkkeiden ja osoitti tehoa barnasegeenin perustuvien immunoRNase syövän solujen ablaation.

tulokset

karakterisointi barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase

Rekombinanttiproteiinit tuotettu

E. coli

ja puhdistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Proteiinit saadaan olivat odotetun kokoisia ja homogeeninen mukaan SDS-PAGE (tuloksia ei ole esitetty). Entsyymiaktiivisuus valmis barnasegeenin oli 1,8 x 10

6 yksikköä /mg, mikä oli yhdenmukainen aiemmin julkaistu arvoihin [27]. Ribonukleaasi aktiivisuus kunkin barnasegeenin entsyymin scFv 4D5-dibarnase fuusioproteiini oli 75% natiivin barnaasin (kuvio 1A). Ribonukleaasiin aktiivisuus scFv 4D5-dibarnase estyi barstargeenin (kuvio 1 B, katkoviiva). Siten barnasegeenin osalla scFv 4D5-dibarnase säilyttänyt toiminnallisuutta.

(A) ribonukleaasiin toiminta barnasegeenin (katkoviiva ja timantit) ja scFv 4D5-dibarnase (pisteviiva ja ympyrät) määritettiin menetelmän mukaisesti ja Rushizky et ai. [58]. X-akseli edustaa konsentraatiota barnasegeenin yksin tai puoli-pitoisuus scFv 4D5-dibarnase. Absorbanssi 0,5 AU

260 vastaa aktiivisuutta 2 nM natiivin barnasegeenin kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. (B) herkkyys barnasegeenin ja HRI (yhtenäinen viiva ja ympyrät) ja scFv 4D5-dibarnase kohteeseen barstargeenin (katkoviiva ja kolmiot). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolminkertaisten määritysten; käyrät ovat tulokset sigmoid regressio suoritetaan SigmaPlot ohjelmisto.

jälkeen tunkeutuminen soluihin, eksogeenisesti lisättyä RNaasia voi epäonnistua olla aktiivinen johtuen alttiutta sytoplasman ribonukleaasi-inhibiittori [18]. Siksi ennen testausta sytotoksisuus scFv 4D5-dibarnase, tutkimme herkkyys barnasegeenin ihmisen ribonukleaasi estäjä (HRI). Pitoisuutena neljä kertaa suurempi kuin mitä tarvitaan estämään RNaasi A: 50% (määritetään valmistajan ohjeita), HRI ei estänyt barnaasin (kuvio 1 B, yhtenäinen viiva).

sidonta barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase soluihin

sitoutuminen barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase HER2-yli-ilmentävät ihmisen munasarjasyövän SKOV-3-soluja [28] ja hiiren CTLL-2 sytotoksisia T-soluja, joista puuttuu ihmisen HER2 määritettiin fluoresoivalla mikroskopia. Kalvon fluoresenssi SKOV-3-soluja, mutta ei CTLL-2-soluja, värjättiin 20 nM scFv 4D5-dibarnase havaittiin (kuvio 2, B ja D). Kontrolleissa, kun scFv 4D5-dibarnase tai kanin anti-barnasegeenin antiseerumia jätettiin pois, ei fluoresenssia ei havaittu SKOV-3-soluihin ja CTLL-2-soluja (tietoja ei esitetty). Lisäämällä scFv 4D5 scFv 4D5-dibarnase johti merkittäviin sammutusta solukalvon fluoresenssin (kuvio 2, vertaa B ja C), mikä osoittaa, että scFv 4D5-dibarnase sitoutunut HER2-reseptoriin. Fluoresenssia havaittiin joko SKOV-3-soluja tai CTLL-2-soluja, kun läsnä oli 20 nM barnaasin (tuloksia ei ole esitetty). Klo barnasegeenin pitoisuus 20 uM, kirkas sytoplasminen värjäys SKOV-3-soluissa havaittiin (kuvio 2E), mikä viittaa siihen tunkeutuminen barnasegeenin soluihin. Sopivien kontrollien ilman joko barnaasin tai kanin anti-barnasegeenin antiseerumia olivat negatiivisia (tuloksia ei ole esitetty).

solun sitova kyky rekombinanttiproteiinien osoitettiin fluoresenssimikroskopialla. Soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan joko 20 nM scFv 4D5-dibarnase (A, B ja D), tai seosta, jossa oli 20 nM scFv 4D5-dibarnase ja 20 nM scFv 4D5 (C), tai 20 uM barnaasin ( E). Sitoutumattomat proteiinit poistettiin, ja sitten elävät (A-D) tai kiinteä (E) solut värjättiin kaniinin anti-barnasegeenin antiseerumia ja GAR-TR, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. ScFv 4D5-dibarnase sitoutuu HER2-positiiviset SKOV-3-soluja (A ja B), tämä spesifinen sitoutuminen estyi scFv 4D5 (C). ScFv 4D5-dibarnase ei sitoudu HER2-negatiivisten CTLL-2-soluja (D). Soluliman värjäys SKOV-3-solujen kanssa 20 uM barnasegeenin havaittiin (E). Suurennus, 400 ×.

vuorovaikutusta scFv 4D5-dibarnase HER2-yli-ilmentävät ihmisen rintasyöpä BT-474-solujen [25] tutkittiin konfokaalimikroskopiaa. BT-474-soluja inkuboitiin 20 nM scFv 4D5-dibarnase joko 4 ° C: ssa tukahduttaa hintoihin tai 37 ° C: ssa antaa internalisaatiota ja värjättiin kaniinin anti-barnasegeenin antiseerumia seurasi fykoerytriini-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä. Fluoresenssi havaittiin etupäässä pinnalla soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa (kuvio 3A) ja sen sisällä soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa (kuvio 3B), mikä osoittaa, että scFv 4D5-dibarnase sitoutuu ja tunkeutuu BT-474-soluja. Kontrolleissa, kun scFv 4D5-dibarnase tai kanin anti-barnasegeenin antiseerumia jätettiin pois, ei fluoresenssia ei havaittu BT-474-soluja (tietoja ei esitetty).

(A) Soluja inkuboitiin scFv 4D5-dibarnase at 4 ° C: ssa tai (B) 37 ° C: ssa. ScFv 4D5-dibarnase havaittiin kaniinin anti-barnasegeenin antiseerumia seurasi GAR-PE. Fluoresenssi havaittiin pääasiassa solujen pinnalla inkuboitiin 4 ° C: ssa ja sen sisällä soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Tämä ero lokalisoinnin fluoresoivaa leimaa ehdottaa sisäistämisen scFv 4D5-dibarnase 37 ° C: BT-474-soluissa.

sisäistäminen scFv 4D5-dibarnase tutkittiin elektronimikroskoopilla

solunsisäinen lokalisaatio scFv 4D5-dibarnase tutkittiin elektronimikroskoopilla. ScFv 4D5-dibarnase oli kompleksoitu kulta hiukkasia (Au). ScFv 4D5-dibarnase-Au kompleksin sitoutuneena SKOV-3-soluja (kuvio 4), mutta ei sitoudu tai tunkeutumaan CTLL-2-soluja (tuloksia ei ole esitetty) 4 ° C: ssa ja 37 ° C: ssa. Kun sitoutuminen kompleksin solun pintaan SKOV-3-soluja, kulta partikkelit talletettu ulkonemien ja sileä osat solukalvon (kuvio 4, A-D). Tunkeutuminen scFv 4D5-dibarnase-Au osaksi SKOV-3-solujen havaittiin 37 ° C: ssa, mutta ei 4 ° C: ssa, mikä tarkoittaa, että penetraatio on lämpötilasta riippuva prosessi. Sisäistämisen scFv 4D5-dibarnase-Au mukana muodostumiseen päällystettyjen kuoppien (kuvio 4D) kukoistavainen peräisin solukalvon ja muuttuu päällystetty rakkulat (kuvio 4E). Solujen sisällä, useimmat kultapartikkelit sijaitsee endosomeihin (kuvio 4, F ja G). Muutama kulta hiukkasia löytyi vapaasti solulimassa vieressä endosomeista (kuva 4, F ja G, nuolenkärjet). Nämä havainnot viittaavat siihen, että scFv 4D5-dibarnase voidaan vapauttaa endosomeista sytoplasmaan. Kultarakeet esiintynyt myös monivesikkelisten elimissä (Kuva 4H). Tumat ole merkitty (kuvio 4F).

SKOV-3-soluja inkuboitiin 20 nM scFv 4D5-dibarnase-Au 1 tunti 4 ° C: ssa tai 37 ° C: ssa. (A ja B) 4 ° C: ssa, kulta etiketti talletettiin solukalvon (m) ja ulokkeet (tähdellä), mutta ei solun sisällä. (C-H) 37 ° C: ssa, scFv 4D5-dibarnase-Au sitoutunut solun pintaan samalla tavalla kuin 4 ° C: ssa, mutta havaittiin myös solujen sisällä päällystetyn kuoppia (cp) (D), päällystetty rakkulat ( cv) (e), endosomeista (e) (F ja G), solulimassa (c) (F ja G, nuolenpäät), ja monivesikkelisten elimet (MVB) (H). ScFv 4D5-dibarnase-Au ei havaittu ydin (n) (F). Bar, 200 nm.

vaikutus barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase solun eloonjäämiseen

Tutkimme vaikutukset rekombinantti barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase selviytymisen eri ihmisen syövän solulinjat. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaariset solut (hPBMC: itä) eristettiin perifeerisestä verestä terveiden luovuttajien ja käytettiin välittömästi tutkia sytotoksisuutta barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase normaalien ihmisen soluissa. Hiiren CTLL-2 sytotoksisia T-soluja, joista puuttuu ihmisen HER2 käytettiin myös. Kaikki solulinjat ja hPBMC: itä inkuboitiin proteiinien eri pitoisuuksilla täysin elatusaineissa 72 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä (taulukko 1). Ihmisen rintasyöpä BT-474-solut osoittivat korkeimman herkkyys barnasegeenin (IC

50 = 0,21 uM), alhaisin osoitettiin, että myelosyyttileukemia HL-60-solujen (IC

50 = 82 uM). Muiden syöpäsolun linjat, barnasegeenin oli myrkyllinen IC

50 vaihtelevat 2,4-13 uM. Annos-vastekäyrät ei ylikuormitusta tasanne, mikä viittaa epäspesifinen vuorovaikutus barnasegeenin solujen kanssa. SKOV-3-solut osoittivat kohtalaista herkkyys (IC

50 = 5 uM), mikä osoittaa yleisempi vastaus barnasegeenin aiheuttama sytotoksisuuden kuin BT-474 soluja. Näin ollen SKOV-3-soluja käytettiin edelleen karakterisointiin scFv 4D5-dibarnase vaikutuksia HER2-yli-ilmentävät solut. Sillä hPBMC: itä, maksimaalinen solumyrkkyvaikutuksessa (27%) saavutettiin 110 uM barnasegeenin (kuvio 5A, lyhyt katkoviiva), kun taas SKOV-3-soluissa, 1,2 uM barnasegeenin oli riittävä tuottamaan sama vaikutus. Siten barnasegeenin myrkyllisyys oli kaksi suuruusluokkaa suurempi ihmisen syövän SKOV-3-soluissa kuin hPBMC: itä.

(A) vaikutukset barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase elinkelpoisuudesta ihmisen syövän ja normaalit solut. SKOV-3-soluja käsiteltiin 72 h barnasegeenin (pitkä katkoviiva) tai scFv 4D5-dibarnase (yhtenäinen viiva), ja hPBMC: itä käsiteltiin barnasegeenin (lyhyt katkoviiva) tai scFv 4D5-dibarnase (katkoviiva-pisteviiva). (B) toinen kilpaileva esto scFv 4D5-dibarnase sytotoksisuuden scFv 4D5. SKOV-3-soluja käsiteltiin 72 h scFv 4D5-dibarnase puuttuessa (mustat ympyrät) tai läsnä ollessa (valkoiset kolmiot) 300 nM scFv 4D5 tai scFv 4D5 yksinään (valkoiset neliöt). (C) esto barnasegeenin sytotoksisuuden ja scFv 4D5-dibarnase sytotoksisuuden barstargeenin. SKOV-3-soluja käsiteltiin 72 h barnaasin (valkeat ympyrät), barnaasin ja ekvimolaariset määrät barstar (valkoinen kolmio), scFv 4D5-dibarnase (mustat ympyrät), scFv 4D5-dibarnase kolme-kertainen molaarinen ylimäärä barstar (musta kolmiot) tai barstargeenin yksin (musta neliö). (D) vaikutukset HRI on sytotoksisuutta scFv 4D5-dibarnase. SKOV-3-soluja käsiteltiin 72 tunnin joko scFv 4D5-dibarnase puuttuessa HRI (mustat ympyrät), scFv 4D5-dibarnase läsnäollessa HRI (valkoinen ruutu), tai HRI yksinään (mustat timantit). Solujen elinkelpoisuus ilmaistaan ​​prosentteina metabolista aktiivisuutta käsiteltyjen solujen suhteen käsittelemättömiin soluihin (hiusristikko). Jokainen regressiokäyrän paneelissa A (95%: n luottamusväli katkoviivoin) edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Sigmoid regressio suoritettiin SigmaPlot ohjelmisto. Käyrät B-D edustaa tyypillisiä kokeisiin. Virhepalkit (B-D) saatiin kolmena kappaleena mittauksista.

Altistuminen HER2-yli-ilmentävät SKOV-3-soluja scFv 4D5-dibarnase 72 tuntia osoitti annoksesta riippuvaista sytotoksisuutta 0,1 20 nm (kuvio 5A, yhtenäinen viiva). Edelleen kasvaa pitoisuuden tehostetun sytotoksisuuden hieman, mikä osoittaa, että vaikutus scFv 4D5-dibarnase rajoitti solun pinnan tiheyttä HER2-reseptorin. IC

50 scFv 4D5-dibarnase oli 1,8 nM, joka on 2800 kertaa pienempi kuin IC

50 barnasegeenin (kuvio 5A, vertaa vankka ja pitkä katkoviivat). BT-474-solut osoittivat scFv 4D5-dibarnase herkkyys, joka on verrattavissa SKOV-3-soluja. Kuten IC

50 ja IC

30 scFv 4D5-dibarnase oli 1,3 kertaa suurempi BT-474 soluja kuin SKOV-3-soluissa mutta IC

70 oli 1,5 kertaa pienempi BT-474 soluja kuin SKOV -3-soluja (taulukko 1). Huomionarvoista, kun taas vaikutukset barnasegeenin yksin SKOV-3 ja BT-474-solut erosivat 25 kertaa, scFv 4D5-dibarnase osoitti samanlaisia ​​vaikutuksia näihin HER2-positiiviset solut. Samaan aikaan, HER2-negatiivinen hPBMC: itä ei vaikuttanut scFv 4D5-dibarnase pitoisuuteen saakka 2600 nM (kuvio 5A, dashed-pisteviivalla). Nämä havainnot osoittavat, että vaikutus scFv 4D5-dibarnase oli spesifistä ja reseptorin välittämä.

varmistamiseksi edelleen, että sytotoksisuus scFv 4D5-dibarnase välitti vuorovaikutusta scFv 4D5 osan kanssa HER2-reseptorin, olemme tutkineet vaikutusta scFv 4D5-dibarnase SKOV-3-soluja, kun läsnä scFv 4D5, jonka pitoisuus on 300 nM. Kun taas scFv 4D5 ei itse ole vaikutusta SKOV-3-soluja (kuvio 5B, valkoiset neliöt) pitoisuuksina 0,1 2000 nm, minivasta-aineen vähentynyt sytotoksisuus scFv 4D5-dibarnase annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5B, valkoinen kolmio) . Tämä riippuvuus viittaa siihen, että scFv 4D5 ja scFv 4D5-dibarnase kilpailevat samoista sitoutumiskohdan ja vahvistivat lisäksi spesifistä vuorovaikutusta scFv 4D5-dibarnase kanssa HER2-reseptoriin.

Voit selvittää entsyymiaktiivisuuden barnasegeenin oli välttämätön sytotoksisuus, barstar, spesifinen inhibiittori barnasegeenin, käytettiin. Barstargeenin yksinään ei estänyt elinkelpoisuutta SKOV-3-solut pitoisuuksina jopa 2000 nM. (Kuvio 5C, mustat neliöt). Lisäämällä barstargeenin jotta barnasegeenin at ekvimolaariset määrät lakkautetaan barnasegeenin sytotoksisuutta konsentraatioalueella 0,4-13 uM (kuvio 5C, valkoinen kolmio). Kun lisättiin kolme-kertainen ylimäärä, barstar vähensi toksinen vaikutus scFv 4D5-dibarnase pitoisuuksina 0,6 nM 80 nM (kuvio 5C, musta kolmio).

inhibitio scFv 4D5-dibarnase sytotoksisuuden barstar ja scFv 4D5 vahvistivat, että sekä 4D5 scFv ja barnasegeenin edistää sytotoksisuuden scFv 4D5-dibarnase on SKOV-3-soluissa.

Voit testata, onko HRI vaikuttaa vaikutuksia scFv 4D5-dibarnase syöpäsolujen, HRI ja scFv 4D5-dibarnase inkuboitiin suhteessa 100 yksikköä HRI 1 ug scFv 4D5-dibarnase 30 min ajan 4 ° C: ssa ja sitten lisättiin soluihin. HRI yksin ei vaikuttanut SKOV-3 solujen eloonjääminen (kuvio 5D, mustat timantit) tai scFv 4D5-dibarnase sytotoksisuus (kuvio 5D, vertaa musta ympyrä ja valkoinen ruutu).

RNA: n hajoamisen aiheuttama barnasegeenin in SKOV-3 solut

polyakryyliamidigeelissä analyysi solun kokonais-RNA eristettiin SKOV-3-soluja osoitti, että RNA läpikäy hajoamisen käsitellyissä soluissa 50 uM barnaasin (kuvio 6). Laaja RNA: n hajoamisen oli ilmeistä 24 h altistuksen jälkeen solujen barnasegeenin (kaista 3); 48 tunnin kuluttua, hajoaminen-RNA oli lähes täydellinen (kaista 4). Molemmat pienimolekyylipainoisen tRNA ja 5.8S rRNA, mutta ei 5S rRNA, tuntui alttiimpia 24 h barnasegeenin hoitoa. Ilmestymiseen ylimääräiset nauhat (kaista 3, tähdellä) osoittaa entsymaattisen katkaisun suurimolekyylipainoista rRNA mukaan barnasegeenin. Digitaalinen kuva-analyysi geelin kuviossa 6 (kaistat 2 ja 3) osoittavat, että suhteellinen runsaus tRNA ja 5.8S rRNA väheni 30% ja 16% kontrollisolujen, vastaavasti, kun taas tasojen 5S, 18S ja 28S rRNA alenivat 60%, 43%, ja 54% kontrollisolujen, vastaavasti.

SKOV-3-soluja altistettiin 50 uM barnasegeenin 24 tuntia (kaista 3) tai 48 h (kaista 4). Kokonais-RNA eristettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät ja analysoitiin 9% polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi 7,5 M ureaa. Kukin näyte kaista ladattiin RNA: n kanssa 2 x 10

5 käsiteltiin (+) tai käsittelemättä (-) solut. Kaista 2 vastaa valehoidettujen ohjaus. Kannat RNA molekyylipainon standardit (kaista 1) esitetään emästen lukumäärä vasemmalla paneelin. Tähdet osoittavat näkyvin bändejä, jotka näkyvät seurauksena entsymaattisesti suurimolekyylipainoista rRNA mukaan barnasegeenin (kaista 3).

vaikutusmekanismi barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase SKOV-3-soluissa

tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi tila solukuoleman aiheuttama barnaasin tai scFv-4D5-dibarnase hoitoon, SKOV-3-soluja valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Sekä barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase indusoi ominaisuuden apoptoottisen kupliminen ja solukalvon, joka oli havaittavissa tietyissä soluissa jo 6 h hoidon jälkeen ja jatkui olemaan ilmeisiä seuraavista 72 h (kuvio 7).

(EN) valehoidettujen solut kiinnitetty levyyn ja oli tasainen. (B ja C) Soluja inkuboitiin joko 50 uM barnasegeenin tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase tuli pyöristetty ja irrottaa. Kalvo kupliminen (B ja C, tähdellä) ja häiritsi soluja (B, nuolenkärki) havaittiin. Faasikontrastimikroskopiaan satunnainen kentän suurennuksella 400 ×.

DNA pirstoutuminen kuolevat solut on yleinen päätepiste, joka on yhteinen sekä nekroottisen ja apoptoottista mekanismeja solukuoleman. Sen määrittämiseksi, onko barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase aiheuttavat DNA katkokset SKOV-3-soluja, propidiumjodidi (PI) värjätyt solut analysoitiin muutoksiin solusyklin jakautuminen käyttäen DNA-pitoisuuden mittausta kautta virtaussytometrialla. Hoito SKOV-3-soluissa joko barnasegeenin tai scFv 4D5-dibarnase johti vähitellen korkeus solujen osuus osa-G1 vaiheeseen (solut, jotka sisältävät vähemmän DNA kuin 2 N), verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (kuvio 8A). Barnasegeenin-käsitelty SKOV-3-solut osoittivat nousee 2,1%, 4,5%, ja 23,9% määrä solujen osa-G1 vaihe ja pienenee 4,0%, 0,2%, ja 19,5% määrä soluja G1 vaiheeseen solusyklin verrattuna kontrolleihin jälkeen 24, 48 ja 72 h hoidon, vastaavasti. Vastaavasti, scFv 4D5-dibarnase-käsitellyn SKOV-3-solut osoittivat nousee 8,5%, 8,1%, ja 19,7% määrä solujen osa-G1 vaiheen ja laskee 7,5%, 3,0%, ja 20,6% määrä soluja G1 vaiheeseen verrattuna niiden valvontaa. Lisäksi, solujen määrä S-vaiheessa väheni 4,9% ja 3,1% barnasegeenin-käsitellyissä soluissa sen jälkeen, kun 48 ja 72 tuntia, vastaavasti, ja 3,6% scFv 4D5-dibarnase käsiteltyjä soluja 48 tunnin jälkeen. Toisaalta, solusyklin analyysi ei paljastanut mitään merkittäviä eroja solut G2 /M-vaiheen solusyklin kontrollin ja käsiteltyjen välillä soluista (kuvio 8A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase aiheuttama DNA katkoksia pääasiassa G1 soluissa. Sitä vastoin seerumin puutteessa SKOV-3-soluja, osoitti kasvua solujen prosenttiosuus osa-G1 vaiheen (35,7%), mukana laskee muissa kolmessa vaiheessa [G1 (12,7%), S (9,1%), ja G2 /M (13,8%)] verrattuna kontrollisoluihin.

(A) virtaussytometrinen analyysi solusyklin jakautumisen suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Histogrammit edustavat eroja prosenttiosuudet solujen välillä barnase- tai scFv 4D5-dibarnase käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen kunkin solusyklin vaiheessa (sub-G1, G1, S ja G2 /M) mitattiin 24 tunnin kuluttua (mustat palkit), 48 h (siniset palkit), ja 72 h (vihreät palkit) hoidon. Virhe palkit osoittavat keskihajonnan. Positiiviset kontrollit DNA hajanaisuus olivat SKOV-3 soluja viljeltiin 7 päivän ajan seerumivapaassa väliaineessa (oranssi baareissa). (B) DNA-elektroforeesilla määrityksessä. Soluja käsiteltiin joko 50 uM barnasegeenin tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin genomi-DNA: ta sekä käsitelty (+) ja käsittelemättömän (-) solut eristettiin ja DNA yhtä suuri määrä soluja erotettiin ei-denaturoivalla 1,5% agaroosigeeleillä. DNA visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Kromatiinin fragmentit johtuvat internukleosomaalisen pilkkominen oli läsnä näytteitä solujen DNA käsiteltiin barnaasin (kaista 2) ja scFv 4D5-dibarnase (kaista 6). DNA seerumin puutteessa (ss) solut pilkottiin epäsäännöllisesti (kaista 7). Kaistat 3 ja 5 edustavat käsittelemättömiä kontrolleja. Kaistat 1 ja 4 ovat molekyylipainomarkkerit ((M) HyperLadder I, Bioline). (C) Soluja altistettiin 50 nM scFv 4D5-dibarnase 72 tuntia ja sitten värjättiin akridiini oranssi, analysoitiin fluoresenssimikroskopialla ja valokuvattiin. Edustava tapaus ydin- pyknosis ja pirstoutuminen (karyorrhexis) näytetään (upotus). Suurennos, 400 x (1200 ×, upotus).

Valaistaan ​​joka apoptoottinen tai nekroottisen tila DNA pirstoutumista laukaisi barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase, genominen DNA, joka eristettiin SKOV-3-soluissa hoidettiin joko 50 uM barnasegeenin tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase ajettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä (kuvio 8B). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia sen jälkeen, kun barnaasin tai scFv-4D5-dibarnase hoitoon, SKOV-3-soluja näkyy luonteenomainen internukleosomaalisen kromatiinin pilkkoutumisen (kuvio 8B, kaistat 2 ja 6), joka eroaa epäsäännöllinen DNA pilkkominen seerumia SKOV-3-soluja (kuvio 8B, kaista 7). Lisäksi hoito SKOV-3 solujen scFv 4D5-dibarnase aiheuttama selvä kuvio ydin- pyknosis ja pirstoutuminen (karyorrhexis) havaittuna fluoresenssimikroskopialla jälkeen solujen värjäys akridiinioranssilla (kuvio 8C).

Myös käytetyt anneksiini-V-FITC /PI-värjäyksellä mitata ulkonäkö fosfatidyyliseriinin, merkki apoptoosin, ulomman esitteen solukalvon SKOV-3-soluja (kuvio 9, A-C). Solut, joita käsiteltiin 72 tuntia joko 50 uM barnaasin tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase havaittiin olevan anneksiini-V-FITC: llä positiivisia ja PI-negatiivisia suurempi osuus (21,7% ja 32,7%, vastaavasti) kuin käsittelemättömien solujen (1,5% ). Nämä tulokset osoittavat, että luonne solukuolema sekä barnasegeenin ja scFv 4D5-dibarnase on apoptoottisia. Nostamalla nekroottinen soluissa (anneksiini-V-FITC positiivisia ja PI positiivinen) oli 2,0% for barnasegeenin käsiteltyjä soluja ja 2,6% scFv 4D5-dibarnase käsiteltyjä soluja verrattuna kontrolleihin, kymmenen kertaa pienempi kuin että apoptoottisia soluja.

(A-C) SKOV-3-soluja valehoidettujen (A) tai hoidettiin joko 50 uM barnasegeenin (B) tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase (C) 72 tuntia. Solut analysoitiin alussa apoptoosi anneksiini-V-FITC /PI-värjäyksen. Alempi vasen neljännesten kunkin paneelin osoittaa eläviä soluja, jotka sulkevat pois PI ja ovat negatiivisia anneksiini V-FITC sitova. Ylempi oikeassa neljännesten sisältävät elottomia, nekroottista solut, jotka ovat positiivisia sekä anneksiini-V-FITC sitova ja PI ottoa. Alempi oikeus neljännesten edustaa apoptoottisia soluja, anneksiini-V-FITC positiivisia ja PI-negatiivisia. Yksi edustava koe kolmesta esitetään. (D ja E), kaspaasi-3-like entsymaattisen toiminnan soluja käsiteltiin joko 50 uM barnaasin (D, täyttämätön huippu) tai 50 nM scFv 4D5-dibarnase (E, täyttämätön huippu) 72 h arvioitiin katkaisun fluorogeenisen alustan PhiPhiLux-G

1D

2 ja verrattiin käsittelemättömien solujen (täytetyt piikit). M1 ja M2 markkereita vastaavat kaspaasi-3-aktivaation käsittelemättömien ja käsiteltyjen solujen, vastaavasti.

tutkimiseksi edelleen tilan indusoimaa solukuolemaa barnaasin ja scFv 4D5-dibarnase, mittasimme aktivointi ja apoptoosia erityisiä kaspaasi-3-proteolyyttisellä katkaisulla määrityksessä PhiPhiLux-G

1D

2-substraattia (kuvio 9, D ja E). Kaspaasi 3-kaltainen aktiivisuus kasvoi 13,1% ja barnase- ja 11,6% scFv 4D5-dibarnase saaneilla SKOV-3-soluissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.

Yhteenvetona kyky barnasegeenin ja scFv 4D5 -dibarnase aiheuttaa kalvon rakkuloituminen, ulkonäkö fosfatidyyliseriinin ulko- seloste solukalvon, internukleosomaalisen kromatiinin pirstoutuminen, ja kaspaasi-3 tukevat käsitystä, että nämä proteiinit laukaisevat apoptoottista solukuolemaa.

keskustelu

barnaasin on onnistuneesti käytetty useissa tutkimuksissa poistamiseksi solujen eri lajien [3] – [5 ja 9-14]; kuitenkin, sytotoksisia vaikutuksia barnasegeenin syöpäsoluihin ei ole tutkittu riittävästi. Tässä rekombinantti barnasegeenin osoitettiin olevan myrkyllisiä ihmisen syöpäsolulinjoissa IC

50-arvot vaihtelevat 0,2-13 uM ja leukemiasolulinjoja IC

50-arvot vaihtelevat 2,4-82 uM (taulukko 1). Verrattuna muihin RNaaseista [29], barnasegeenin on kohtalaisen myrkyllinen ihmisen syöpäsoluja. Vaikutukset barnasegeenin eri syöpäsolulinjoissa vaihteli 400-kertaiseksi. Herkin solulinja oli BT-474 (IC

50 = 0,21 uM), ja vähiten herkkä yksi oli HL-60 (IC

50 = 82 uM). Laajalle levinnyt IC

50-arvot eri solulinjoja on myös luontainen naudan uraauurtava ribonukleaasi (BS RNaasia) ja onconase, ribonukleaasi alkaen

Rana pipiensiksen

. Vaikutukset BS RNaasi on sinoomasolulinjoja vaihteli 570-kertainen; ja vaikutukset onconase on syöpä ja leukemia solulinjoja vaihteli 6000-kertainen [30]. Havaittu lajikkeen herkkyyttä solulinjojen barnasegeenin voi johtua eroista muutosten ja /tai koostumus solun pinnan molekyylejä, jotka määrittävät sitoutumisen barnasegeenin solun pintaan. Tavalla ja sitoutumisen voimakkuutta vaikutuksen tehokkuutta soluunottoa RNaasi [31], tai sisäistämisen reitin RNaasi.