Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin on havaittu vähintään 1/3 maksasolukarsinoomat (HCC), ja huomattava määrä näistä ovat mutaatiot β-kateniinin geeni. Näin ollen, tehokas inhibitio tämän reitin voisi tarjota uusi menetelmä hoitoon HCC. Purposed Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää, onko FH535, joka oli aikaisemmin osoitettu estää β-kateniinin reitin, voivat estää β-kateniinin aktivointi kohdegeenien ja inhiboivat maksasyövän Stem Cells (LCSC) ja HCC-solulinjat. Käyttäen β-kateniinin reagoiva reportterigeenien, meidän tiedot osoittavat, että FH535 voi estää kohdegeenin aktivointi endogeenisen ja eksogeenisen ilmaistuna β-kateniinin, kuten konstitutiivisesti aktiivisen muodon β-kateniinin, joka sisältää Serine37Alanine mutaation. Tuloksemme osoittavat myös, että lisääntyminen LCSC ja HCC linjat estyy FH535 annoksesta riippuvaisella tavalla, ja että tämä korreloi lasku solujen prosenttiosuus S-vaiheessa. Lopuksi, myös osoittavat, että ekspressio kaksi hyvin tunnettu tavoitteita β-kateniinin, sykliini D1 ja surviviinia vähenee FH535. Yhdessä tämä data osoittaa, että FH535 on mahdollista terapeuttista arvoa hoidettaessa maksasyövän. Mikä tärkeintä, nämä tulokset viittaavat siihen, että tämä hoito voi olla tehokas useilla eri tasoilla kohdentamalla sekä HCC ja LCSC.

Citation: Gedaly R, Galuppo R, Daily MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) kohdistaminen Wnt /β-kateniinin Signaling Pathway in Maksasyöpä Kantasolut ja maksasyövän Cell Lines FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10,1371 /journal.pone.0099272

Editor: Zhiyuan Gong, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu: 30 lokakuu 2013; Hyväksytty: 12 toukokuu 2014; Julkaistu: 18 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Gedaly et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä julkaisu tukivat lupanumeroon UL1RR033173 [TL1 RR033172, KL2 RR033171] National Center for Research Resources (NCRR), DK074816 (BTS) rahoittama toimiston johtaja, National Institutes of Health (NIH), ja tukee NIH tiekartta for Medical Research. Tämä tutkimus myös tukivat virtaussytometria ja Cell lajittelu resurssin yliopiston Kentuckyn Markey Cancer Center (P30CA177558). Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä NCRR ja NIH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC), yleisin maksasyövän, on viidenneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi korkein syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1] – [2]. Hälyttävä nousu HCC esiintyvyydestä Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa viime vuosina liittyy pääasiassa hepatiitti C-infektio, vaikka muut tekijät, kuten runsas alkoholin käyttö ja lihavuus myös osaltaan tähän kasvuun [3]. Etiologia HCC on monimutkainen ja siihen liittyy lukuisia geneettisiä ja epigeneettiset muutokset ja häiriöt eri signalointireittien kuten Wnt /β-kateniinin, Ras /Raf /MAPK, PI3K /AKT /mTOR, HGF /c-MET, IGF, VEGF ja PDGF reittejä. Näistä Wnt /β-kateniinin reitin pidetään yhtenä vaikeimmista estää [4]. Tällä hetkellä vain harvat kemiallisia aineita, joiden tavoitteena on Wnt /β-kateniinin reitin ovat saatavilla tai tutkittavana [5].

aktivointi kanonisen Wnt /β-kateniinin reittiin kuuluu sitoutumisen Wnt-proteiinien solun pinnan Frizzled-reseptorien ja LRP5: stä /6 co-reseptoreihin. Puuttuessa Wnt-proteiinien, paljon solun β-kateniinin sitoutuu E-kadheriinin solukalvon. Sytosolinen β-kateniinin on konstitutiivisesti fosforyloitiin erityisiä seriinitähteiksi entsymaattisella kompleksi, joka sisältää adenomatoottisen polypoosin coli (APC), ak- siini, ja kinaasien glykogeenisyntaasikinaasi-3β (GSK-3β) ja kaseiinikinaasi I merkintä sen ubikitiini-välitteisen proteolyysiä. Näissä olosuhteissa TCF /LEF transkriptiotekijöitä sidotaan niiden samankaltaisiin DNA tunnustamista elementtejä yhdessä jäsenten Groucho perheen co-repressorit, vakuuttaa transkription hiljentämisen β-kateniinin kohdegeenien. Sitoutuminen Wnt-proteiinien kanssa Frizzled reseptorin aktivoi Dishevelled proteiinia, jolloin dissosiaatio sytosolin tuhoisia monimutkainen ja GSK-3β. Tämä johtaa vakauttamiseen ja kertymistä sytoplasman β-kateniinin, joka sitten siirtyy tumaan, sitoutuu TCF /LEF proteiineja ja johtaa myöhemmin dissosiaatiota groucho co-repressors, rekrytointi koaktivaattorikompleksien p300 ja aktivointi β-kateniinin kohdegeenien [ ,,,0],6] – [9]. Monet β-kateniinin tavoitteita, mukaan lukien sykliini-D1, c-myc ja surviviinia, edistää solusyklin etenemistä ja inhiboivat apoptoosin [10] – [12]. Yhdenmukainen tämän datan, aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin nähdään erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien HCC. Poikkeava aktivaatio Wnt /β-kateniinin reitin on havaittu ainakin 1/3 HCC, ja noin 20%: HCCs on mutaatioita β-kateniinin geenin. Enemmän kuin 50% HCC kasvainten näyttää ydin- kertymistä β-kateniinin osoittaa, että muut tekijät saattavat olla osallisina, kuten poikkeava metylaatio tuumorisuppressoreilla APC ja E-kadheriinin, inaktivointi kaseiinikinaasi ja GSK-3β, tai lisääntynyt eritys Wnt ligants [4] – [5].

on kasvavaa kiinnostusta rooli maksasyövän kantasoluja (LCSC) kasvainten synnyssä, syövän etenemiseen, invaasio ja etäpesäkkeitä. Syöpä kantasolujen teoria viittaa siihen, että kasvaimen muodostuu heterogeeninen populaatio soluja, jotka muodostavat erillisen solun hierarkia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat saatu vakuuttavia todisteita siitä, että nämä solut eivät ole kiinteissä kasvaimissa monentyyppisiä, mukaan lukien aivot, rinta, peräsuolen, maksan, haiman ja eturauhasen syöpiä. Vuonna 2006 kaksi eri ryhmää eristäneet CD133 + alapopulaatio HCC solulinjoista ja kuvattu suurempi proliferatiivinen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa, sopusoinnussa kantasolujen ominaisuuksia. CD44 havaittiin myös tärkeänä merkki käytetään yhdessä muiden kantasolujen merkkiaineita määritellä paremmin pinnan fenotyyppi LCSC. On osoitettu, että CD133 + ja CD90 + solut ilmensivät CD44 + ovat aggressiivisia kuin ne ilmentävät CD133 tai CD90 yksinään [13] – [14].

kemialliset aineet, joita käytetään kohdentamaan Wnt- /β-kateniinin reitin ovat kalvon, sytosoliin ja transkriptiotekijä tasolla [5]. Pieni molekyyli aine FH535 on kaksi estäjä peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin (PPAR) ja β-kateniinin /TCF /LEF. FH535 on osoitettu estävän lisääntymistä HCC ja hepatoblastooma solulinjojen ja sen spesifisyys estoon β-kateniinin /TCF /LEF aktiivisuus havainnollistetaan hepatoblastooma HepG2 [15].

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli onko FH535 voi estää aktivointi β-kateniinin geenien endogeenisen ja ektooppisesti ilmaistuna β-kateniinin HCC solulinjoissa Huh7, Hep3B ja PLC ja maksasyöpä kantasoluja (LCSC). Spesifisyys FH535 inhibitioon β-kateniinin kautta TCF /LEF aktivaatio määritettiin dual lusiferaasireportterista transfektoidaan LCSC ja HCC-soluissa. Leviäminen, solusyklin ja muita kohdennettuja geenit ja proteiinit analysoitiin.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Soluviljely

HCC-solulinja Huh7 [16] oli lahja Dr. Guangxiang Luo (University of Alabama – Birmingham). HCC solulinjat Hep3B ja PLC ostettiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Hep3B ja PLC molemmat ilmentävät HBV-pinta-antigeeni, ja Huh7 ilmaista hepatiitti delta-antigeenin. Hep3B on p53 negatiivinen, PLC on vähentänyt p53 ilmaus, ja Huh7 on lisääntynyt p53-proteiinin taso [17] – [18]. Nämä solulinjat viljeltiin Dulbeccon Modified Eagles Medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), glutamiini ja penisilliini /streptomysiiniä. Maksasyövän kantasolut (LCSC; Catalog # 36116-43, CelProgen, San Pedro, CA, USA) laajennettiin asti ja käytettiin ensimmäisten 4 kohdat CelProgen täydellinen kasvatusväliaineessa 10% FBS solunulkoisen matriisin (ECM ) päällystetyt pullot (CelProgen). Virtaussytometria profiilin ja tuumorigeenisyyden on LCSC on esitetty kuvioissa S1 ja S2. Muita solulinjoja viljeltiin standardi muovi tavarat ilman ECM pinnoitetta. Soluja viljeltiin NuAire® inkubaattorissa (Plymouth, MI, USA) 37 ° C: ssa 5% CO

2.

2.2 Kemikaalit

FH535, XAV939 ja LiCl ostettiin Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metyyli-

3H-tymidiiniä (2 Ci /mM) oli MP Biomedicalsin (Costa Mesa, CA, USA). X-Treme Gene 9 ja Turbofect transfektioreagenssit olivat Roche (Indianapolis, IN, USA) ja Thermo Scientific (Waltham, MA, USA), tässä järjestyksessä. Propidiumväriä jodidi-pohjainen solusyklin analyysi kit oli peräisin GenScript (Piscataway, NJ, USA). Kaikki muut kemikaalit olivat yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2,3 Plasmidit

TOPFlash lusiferaasireportterigeeniin, joka sisältää 3 kopiota TCF /LEF sitoutumiskohta ja FOPFlash lusiferaasireportterigeenin, identtinen TOPFlash paitsi TCF /LEF sivustoja on mutatoitu, hankittiin Addgene (Cambridge, MA, USA) [19]. PRL renilla lusiferaasi vektori oli Promega (Madison, WI, USA). Ekspressiovektorit villityypin β-kateniinin ja βCatS37A toimitti S. Byers [20], ja E3-pGL3, joka sisältää hiiren alfa-fetoproteiini tehostajana E3 fuusioitu pGL3-promoottori, on kuvattu aiemmin [21].

2,4

3H-tymidiinin määritystä

Tämä määritys suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmin julkistetut menetelmä ja muiden tutkijoiden [22] – [24]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille 1,000-5000 solu /kuoppa 0,2 ml: ssa DMEM + 10% FBS: ää ja käsiteltiin kahtena kappaleena eri pitoisuuksilla FH535 72 tuntia. Solut pulssitettiin

3H-tymidiinin 1 uCi /kuoppa, 4 tunnin ajan. Vaihtoehtoisesti soluja viljeltiin 2500 solua /kuoppa 0,1 ml: ssa väliainetta 24 tuntia, minkä jälkeen lisäämällä samanaikaisesti FH535 (0-15 uM) ja

3H-tymidiiniä (1 uCi /kuoppa) lopulliseen tilavuuteen 0,2 ml /kuoppa., minkä jälkeen inkuboitiin vielä 18 tunnin ajan. Molemmissa tilanteissa, lopussa inkuboinnin jälkeen solut pestiin ja kiinnitettiin 0,3 ml: aan 10%: ista trikloorietikkahappoa (TCA) ja 12 min. Aspiraation jälkeen TCA, solut hajotettiin 0,2 M NaOH /0,2% SDS 40 minuutin ajan.

3H-tymidiinin inkorporaatio mitattiin tuikelaskennalla Packard Scintillation Analyzer (Covina, CA, USA). Emme suorita MTT-määritystä varten soluproliferaatiota verrata

3H-tymidiinin koska siellä on väri reaktio FH535 ja MTT määritysreagenssikoostumusta (tiatsolyylisininen liumbromidi). Pitoisuus FH535 aiheuttaa 50%: n esto solu- kasvanut (IC

50) määritettiin seuraavalla menetelmällä. Ei-lääke tietoja käytettiin 100% Y-akselilla, ja tästä 50%: n esto on Y-akselin määritettiin. Vuodesta 50% arvosta vaiheessa meidän rinnastaa rivi X-akselin (lääkeaineen pitoisuus akselilla) tunnistaa risti pisteen pitoisuus käyrän. Ristiltä vaiheessa meidän rinnastaa linjan Y-akselilla, ja löytää risti pisteen X-akselilla. Tämä risti pisteen X-akseli on IC

50 kohta. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kaksi kertaa.

2,5 Transient transfektoinneilla ja Dual Lusiferaasimäärityksiä

transfektioiden Huh7, PLC ja LCSC maljattiin 3 x 10

5 solua /kuoppa 1 ml viljelyalustaa 12 kuoppalevyillä; 24 tunnin kuluttua, solut ko-transfektoitiin TOPFlash /PRL vektorit (DNA-suhde 10:01) tai FOPFlash /PRL vektorit (DNA-suhde 10:01) käyttäen X-treme Gene 9 (Roche, Indianapolis, IN, USA) transfektioreagenssia seuraavat valmistajan ohjeita. 6 tunnin kuluttua väliaine imetään pois ja solut lisättiin 1 ml viljelyalustaa, joka sisältää eri pitoisuuksia FH535, DMSO yksin (ajoneuvo), ja /tai 10 mM LiCl: a. Kaikissa tapauksissa, lopullisen DMSO-konsentraatio oli 0,08%. Määrä ajoneuvon DMSO pidettiin vakiona lääkehoitojen ja lopullinen DMSO: n konsentraatio kussakin käsittelyssä oli sama ja sen tarkoituksena oli alle 0,1%. 36 tunnin kuluttua, kaksi lusiferaasi määritykset tehtiin kanssa Promega Dual Luciferase Assay System (Madison, WI, USA) valmistajan protokollia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Lumat LB 9507 luminometrillä (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). Lyhyesti, solut pestiin kerran steriilillä PBS: llä, ja hajotettiin 1 x hajotuspuskuria (Promega) (0,25 ml /kuoppa) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kymmenen ui raakaa solulysaattia (valmistettu Promega Protocol) lisättiin 50 ui Luciferase Assay LARII substraatin 12 x 75 mm: n polystyreeniputkeen (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), joilla mitataan tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta, minkä jälkeen lisäksi 50 ui Stop and Glo alustan mittaamiseksi Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Mitattu Renilla lusiferaasiaktiivisuus käytettiin normalisoimaan mitattu tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus.

Kotransfektioita kanssa β-kateniinin ekspressiovektoreita, solut maljattiin 1 x 10

5 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyt. Solut transfektoitiin 340 ng lusiferaasireportteriplasmidin, 170 ng β-kateniinin-ekspressioplasmidin, ja 10 ng PRL /kuoppa käyttämällä Turbofect transfektioreagenssia (Pittsburg, PA, USA). Jälkeen 5-6 h, FH535 (tai DMSO-ajoneuvon kontrolli) lisättiin. Kun oli kulunut vielä 36 h, solu-uutteita (valmistettu Promega protocol) valmistettiin ja käytettiin välittömästi tai säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki transfektiot suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin vähintään kaksi kertaa. Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin solu-uutteiden käyttäen Dual Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan protokollia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin kahtena kappaleena.

2,6 Solusyklianalyysiä

Huh7-soluja viljeltiin DMEM + 10% FBS: ssa 24 tuntia. Solut pestään seerumittomalla DMEM 3 kertaa, sitten viljeltiin DMEM + 0,1% FBS: ssa 24 h synkronointia soluihin. Soluja viljeltiin sitten DMEM + 10% FBS: ää eri pitoisuuksia FH535 24 tuntia. Solut kerättiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla mukaan GenScript protokollaa. LCSC viljeltiin CelProgen täydellistä kasvualustaa ja käsiteltiin samalla tavalla kuin edellä on esitetty.

2,7 RT-PCR: llä ja Western-analyysi

RT-PCR: llä.

Soluja viljeltiin DMEM + 10% FBS: ää 100 mm kudosviljelymaljoilla, kunnes -70% konfluenssiin ja sitten käsiteltiin pelkästään DMSO: lla tai kasvavia pitoisuuksia FH535 DMSO 38 tuntia. RNA-analyysiä varten, solut kerättiin ja cDNA valmistettiin, kuten on kuvattu [21]. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin SYBR vihreä käyttäen Bio-Rad MyiQ lämpösyklilaite seuraavilla alukkeilla: surviviinia (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG ja GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), sykliini D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA ja TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), ja β2-mikroglobuliinin (B2M: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG ja TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).

Western Blot.

Huh7 soluja (5 x 10

5) viljeltiin DMEM + 10% FBS 100 mm kudosviljelymaljoilla 72 tuntia. Muutoksen jälkeen tuoreella alustalla, solut käsiteltiin 0, 2,5, 5 ja 10 uM FH535 38 h. DMSO ( 0,1%) käytettiin vehikkelikontrollina. Proteiini pitoisuudet solu-uutteet analysoitiin mikro BCA-proteiinin määritys mukainen pakkaus palveluntarjoajan protokollan (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Spesifiset vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Western Blot bändi tiheys määritettiin NIH ImageJ ohjelmisto (Bethesda, Maryland, USA), ja normalisoitu β-aktiini. Kaikki muut toimenpiteet suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [25].

2,8 Tilastollinen analyysi

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen ohjelmistoa SPSS version 20 (International Business Machines Corporationin, Endicott, NY, USA) . Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. Yksisuuntainen ANOVA, jota seuraa Tukey korjausta käytettiin vertaamaan keinoin. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin

p

0,05.

Tulokset

3,1 FH535 estää transkription aktivaation välittämiä villityyppi- ja konstitutiivisesti aktiivisen β-kateniinin

FH535 on osoitettu estävän signalointia endogeenisen β-kateniinin useissa solulinjoissa, mukaan lukien hepatoblastooma HepG2 [15]. Tutkimaan edelleen tätä asetusta ja testata onko FH535 voi tukkia kohdunulkoinen β-kateniinin, Kotransfektioita kanssa β-kateniinin ekspressiovektorit ja TCF4 riippuva lusiferaasireportteri vektori TOPFlash suoritettiin ihmisen HCC solulinjoissa Huh7 ja Hep3B (Fig. 1 ). Molemmissa solulinjoissa, kotransfektoitiin villityypin β-kateniinin ekspressiovektorin lisääntynyt lusiferaasin aktiivisuus TOPFlash lähes 15-kertaisesti verrattuna soluihin, ko-transfektoitiin tyhjällä vektorilla (E.V.) kontrolli. Tämä β-kateniinin riippuvainen kasvu estyi FH535 annoksesta riippuvalla tavalla. β-kateniinin usein mutatoitunut erilaisten syöpien, kuten HCC. Yksi luonnollinen mutaatio muuttaa seriini positiossa 37; Tämän muuttuneessa muodossa on β-kateniinin on resistentti hajoamiselle APC monimutkainen ja on siten suurempi stabiilius. Sen testaamiseksi, onko tämä muoto aktivoitu muoto, β-kateniinin voitaisiin myös estää FH535, ekspressiovektoriin βCatS37A, jossa seriini asemassa 37 on muutettu alaniiniksi, on ko-transfektoitiin TOPFlash. Kuten odotettua, βCatS37A-välitteisen transaktivaation TOPFlash oli merkittävästi korkeampi kuin transaktivaatiota villityypin β-kateniinin. Kuitenkin molemmissa solulinjoissa, βCatS37A-välitteisen transaktivaation merkittävästi inhiboi FH535. Kontrolleina solut myös kotransfektoidaan, jossa FOPFlash, joka on identtinen TOPFlash paitsi että TCF4 alueet on mutatoitu, ja sen vuoksi ei ole enää reagoi p-kateniinin; FOPFlash ei aktivoitu villityypin β-kateniinin tai βCatS37A, kuten on esitetty kuviossa 1.

Huh7 (paneeli A) ja Hep3B (paneeli B) HCC-solut transfektoitiin lusiferaasireportteri geenit TOPFlash (vasemmanpuoleiset paneelit) , joka sisältää kolme TCF sitoutumiskohdat, tai E3-pGL3 (oikea paneeli), joka sisältää AFP-tehostajan elementti E3, joka on erittäin konservoitunut TCF päällä. Soluja lisäksi ko-transfektoitiin ekspressiovektorilla, joka sisälsi ei-insertti (tyhjä vektori ohjaus, E.V.), villityypin β-kateniinin (β-kateniinin), tai konstitutiivisesti aktiivisen muodon β-kateniinin (βcatS37A). Renilla lusiferaasia käytettiin ohjaamaan vaihteluiden transfektion tehokkuutta. Kuusi tuntia sen jälkeen, kun DNA: n lisäämisen, soluja käsiteltiin pelkästään DMSO: lla (ei käsittelyä) tai kasvavia määriä FH535. 48 tunnin kuluttua, lusiferaasi tasot määritettiin; tulikärpäsen lusiferaasi normalisoitiin Renilla. Molemmissa solulinjoissa, FH535 esti β-kateniinin-riippuvainen aktivaatio kohdegeenien. *

P

0,05. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

TOPFlash sisältää kolme konsensus TCF4 sitovat motiivit, jotka antavat vastata p-kateniinin. Sen testaamiseksi FH535 voi myös estää β-kateniinin välittämää transaktivaatiota on TCF4 motiivin yhteydessä luonnollisen säätelyalueen, Kotransfektioita tehtiin E3-pGL3. E3 on ~340 emäsparin fragmentti, joka sisältää Alfafetoproteiini (AFP) hostajaelementti E3, yksi kolmesta parantajia, jotka ohjaavat maksan ilmentymistä hiiren AFP-geenin. E3 sisältää sitoutumiskohdat useita tekijöitä, kuten Foxa /HNF6, C /EBP, orpo tumareseptorit, ja TCF4 [26] – [27]. Olemme hiljattain osoitti, että tämä tehostajana säätelee p-kateniinin soluissa ja siirtogeenisten hiirten [21]. E3-pGL3 oli transaktivoidun β-kateniinin ja suuremmassa määrin βCatS37A (Fig. 1). Kuitenkin tämä transaktivaa- sekä villityypin että S37A muotoja β-kateniinin estettiin FH535 annoksesta riippuvalla tavalla.

3,2 FH535 estää β-kateniinin-välitteisen transkription aktivaation LCSC

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että β-kateniinin signalointi koholla EpCAM positiiviset solujen LCSC ominaisuudet [28]. Olemme aiemmin kuvattu, että CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC aggressiivisesti muodostaa kasvaimia, kun pieniä määriä näitä soluja injektoidaan nude-hiirissä [29]. Voit testata kykyä FH535 estää β-kateniinin näissä LCSCs, ohimenevä transfektiot suoritettiin TOPFlash. Kuten valvontaa, TOPFlash myös transfektoitiin HCC solulinjoihin Huh7 ja PLC (Fig. 2). Kaikissa kolmessa populaatiot, käsittelemättömät solut osoittautunut alhaiseksi lusiferaasin tasoja. Kun käsitelty GSK-3β estäjä LiCI joka johtaa endogeenisen β-kateniinin aktivointi [30], TOPFlash aktiivisuus lisääntynyt dramaattisesti. FH535 esti tehokkaasti LiCI: n aktivaatio TOPFlash annoksesta riippuvalla tavalla. Kiinnostavaa kyllä, tämä esto oli vahvaa LCSC kuin kummassakaan HCC solulinjassa. Kontrollina transfektiot suoritettiin myös FOPFlash, joka ei ole enää reagoi p-kateniinin. Kuten odotettua, lusiferaasiaktiivisuuden FOPFlash-transfektoiduissa soluissa ei ollut kasvanut LiCI: eikä inhiboi FH535.

LCSC (vasen paneeli), Huh7 (keskimmäinen paneeli) ja HPLC: llä (oikea paneeli) solut kotransfektoitiin TOPFlash tai FOPFlash lusiferaasireportterista geenit yhdessä Renilla lusiferaasin. 6 tunnin jälkeen solut jätettiin käsittelemättä (ei käsittelyä) tai käsitelty LiCl: yksin tai LiCl: n kasvavien määrien kanssa FH535. LiCl-on tunnettu aktivaattori β-kateniinin. Vielä 36 tunnin ajan, solut kerättiin ja lusiferaasi-tasot määritettiin; tulikärpäsen lusiferaasi normalisoitiin Renilla. TOPFlash aktiivisuus indusoituvan voimakkaasti kaikissa kolmessa solupopulaatioiden; Tämä aktivaatio estyi FH535. Negatiivinen kontrolli FOPFlash oli minimaaliset vaste LiCl tai FH535. TOPFlash esto FH535 oli vahvaa LCSC kuin kummassakaan HCC solulinjassa. *

P

0,003, # P 0,001. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

3,3 FH535 inhiboi proliferaatiota LCSC ja HCC-solulinjat

Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että β-kateniinin tärkeä rooli proliferaation normaalissa kehitys ja solumuutoksen monissa kudoksissa, kuten maksassa. Maksa kehitys on heikentynyt ilman β-kateniinin, ja mutaatioita, jotka aktivoivat β-kateniinin reitin löytyy noin 1/3 HCC [4] – [5]. Lisäksi kasvua aikuisen maksan progenitorisolujen kantasoluja (soikea solut) voidaan estää estämällä β-kateniinin kautta. Koska meidän tiedot osoittivat, että FH535 voi estää β-kateniinin-välitteisen transkription aktivaation, testasimme myös leviämisen LCSC ja HCC-solulinjoissa, joita tämä yhdiste. LCSC viljeltiin, kun läsnä on 10% tai 1% seerumia ja välillä 5 uM ja 30 uM FH535 72 tunnin ajan, ja solujen lisääntyminen seurattiin

3H-tymidiinin (kuviot. 3A ja 3B, vastaavasti). Leviämisen pieneni kasvavia määriä FH535, jossa on enemmän dramaattinen väheneminen havaittiin soluissa, joita kasvatettiin läsnä ollessa pienempi seerumin; pitoisuus FH535 aiheuttaa 50%: n esto solu- kasvanut (IC

50) oli 13,8 uM soluja kasvatettiin 10% seerumia ja 5,1 uM soluja kasvatettiin 1% seerumia. Tämä inhibitio oli tehokkaampi kuin mitä havaittiin XAV939 (IC

50 = 55 uM), joka estää tankyrase, mikä vakauttaa ak- siini ja edistää β-kateniinin hajoamiseen (Fig. 3C) [31]. FH535 myös estetty lisääntymistä HCC solujen pitoisuuksina, jotka olivat samanlaisia ​​kuin nähtiin LCSC (IC

50 10,9 uM, 9,25 uM ja 6,6 uM Huh7, PLC ja Hep3B, vastaavasti; Fig.3D). Sen vahvistamiseksi, että FH535 todellakin esti solujen lisääntymistä ja ei johtanut lisääntyneeseen solukuolemaan, FH535 ja

3H-tymidiiniä lisättiin samanaikaisesti Huh7 soluja, jotka viljeltiin sitten 18 tuntia. Tässä skenaariossa, havaitsimme merkittävää proliferaation esto 2,5, 5, 10 ja 15 uM FH535 hoidon kontrolliin verrattuna (p 0,05, n = 6), jossa FH535 15 uM aiheuttaa 41%: n inhibition (kuvio S3 ). Tämä tiedot osoittavat, että FH535 on solun uudiskasvun estämiseksi, pikemminkin kuin lisäämällä solukuolemaa.

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 0,2 ml: ssa median, kuten on kuvattu alla 72 tuntia, minkä jälkeen lisättiin

3H -tymidiinin 1 uCi /kuoppa, 4 tunnin ajan. Sisällyttäminen

3H-tymidiini määritettiin tuikelaskennalla. Paneeleissa A, B ja D, lopullinen DMSO-konsentraatio kussakin kuopassa oli 0,05%; paneelissa C, lopullinen DMSO-pitoisuus kussakin kuopassa oli 0,1%. (

) LCSCs maljattiin 1000 solua /kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää yhdessä DMSO yksin tai kasvavia määriä FH535. (

B

). LCSCs maljattiin 5000 solua /kuoppa DMEM: ssä, jossa 1% FBS: ää pelkästään DMSO: lla tai kasvavien pitoisuuksien kanssa FH535. (

C

). LCSCs maljattiin DMEM, jossa oli 10% FBS: 1000 solua /kuoppa pelkästään DMSO: lla tai kasvavien pitoisuuksien XAV939. (

D

). Huh7, Hep3B ja PLC-solut maljattiin DMEM, jossa oli 10% FBS: 1000, 2500, ja 5000 solua /kuoppa, vastaavasti, DMSO yksin tai kasvavien pitoisuuksien FH535.

P

arvoja kaikille kolmelle solulinjoissa käsitelty FH535 verrataan kontrolleihin. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

3.4 FH535 indusoi solusyklin pysähtymisen HCC solulinjassa Huh7 ja LCSC

Kyky FH535 estää soluproliferaatiota sai meidät tutkia solusyklin jakautumisen hoidon jälkeen. Huh7-solut synkronoidaan kasvua 0,1% FBS: ssa 24 tuntia ja sitten viljeltiin 10% FBS: ää ja ilman FH535 tai FH535 7,5 uM ja 15 uM. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin ja DNA-pitoisuus analysoitiin propidiumjodidivärjäys. Läsnä ollessa FH535, oli tilastollisesti merkitsevä lisääntyminen solujen G0 /G1 ja vastaava vähentynyt solujen prosenttiosuus S-vaiheessa verrattuna soluihin, joita kasvatetaan ilman FH535 (Fig. 4A). Solujen lukumäärä G2 ei merkittävästi muuttunut FH535. Lisäksi ei ollut osa-G1 huippu havaitaan virtaussytometrialla, mikä osoittaa, että FH535 ei apoptoosin edistämiseksi pitoisuuksina ollessa käytössä (katso kuva S4). Teimme myös solusyklin analyysi LCSC jälkeen FH535 hoidon ja löysi FH535 15 uM merkittävästi aiheuttanut G1 vaiheessa pidätyksen LCSC (P = 0,012). FH535 myös vähensi merkitsevästi G2 /M vaihe LCSC 24 tunnin kuluttua 7,5 uM ja 15 uM FH535 hoitoa (P = 0,038 ja P 0,001 vastaavasti), ei merkittävää S-vaiheessa esto havaittiin LCSC (p = 0,446) (Kuva. 4B.). Tuloksemme ovat samanlaisia ​​aiemmin julkaistut tulokset ja heijastaa β-kateniinin säätely solusyklin on erilainen eri solutyypeissä [32] – [33]. Cell lukiertosäätelijöistä (sykliinejä, CDK ja sääntelyviranomaisten) voivat vaihdella eri solutyyppejä, jotka voivat johtaa erilaisia ​​vastauksia jälkeen FH535 hoidon. Tämä voi kannattaa tutkia tulevassa tutkimuksessa.

. Huh7-soluja viljeltiin DMEM + 10% FBS: ssa 24 tuntia. Solut pestään seerumittomalla DMEM 3 kertaa, sitten viljeltiin DMEM + 0,1% FBS: ssa 24 h solujen synkronointi. Soluja viljeltiin sitten DMEM + 10% FBS: ää yhdessä eri konsentraatioiden FH535 24 tuntia. Solut kerättiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla mukaisesti GenScript protokollan (Piscataway, NJ, USA). Hoidon FH535 prosenttiosuus kasvoi solujen G1 ja vähensi solujen prosenttiosuus S-vaiheessa. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. B. LCSC soluja viljeltiin CelProgen täydellinen LCSC viljelyalustaa 24 tuntia. Sitten solut pestään seerumittomalla CelProgen väliaineessa 3 kertaa ja viljeltiin CelProgen Medium + 0,1% FBS: ssa 24 h synkronointia soluja. Sitten solut palautettiin CelProgen Complete Medium + 10% FBS: ää eri pitoisuuksia FH535 24 tuntia. Solusyklin määritettiin kohti Huh7 edellä on kuvattu.

3,5 Expression of β-kateniinin kohdegeenien sykliini D1 ja surviviini estyy FH535

β-kateniinin valvontaa soluproliferaatiota ja selviytymistä ekspressiota säätelevät lukuisia tavoitteita geenejä. Kaksi vakiintunut tavoitteet ovat geenit, jotka koodaavat surviviinia (Birc5) ja sykliini D1 (CCND1). Surviviini on anti-apoptoottinen proteiini, joka säätelee myös etenemisensä mitoosin [34]; Sykliini D1 ohjaa leviämisen aktivoimalla G1 kinaasien CDK4 ja CDK6 [35]. Surviviinispesifisiä ja sykliini D1 transkriptio säännellään TCF tekijöitä heidän promoottorialueille [36]. Testata, onko FH535 estää ilmentymistä näiden kahden β-kateniinin kohdegeenien, reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin LCSC ja HCC-solut, joita oli käsitelty kasvavia määriä FH535. Sykliini D1 ja surviviinin mRNA-tasot alenivat FH535 kaikissa kolmessa solupopulaatioiden annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5). Sen vahvistamiseksi, että tämä vähennys mRNA-tasojen johti myös alentaa proteiinin tasot, western-analyysi suoritettiin käyttäen kokosolu otteita Huh7 soluista. Sekä sykliini D1 ja surviviini-proteiinin tasot alenivat annoksesta riippuvalla tavalla, jossa suurin vähennys nähdään, että läsnä on 10 uM FH535 (Fig. 6). Densitometri-analyysi osoitti, että FH535 5 ja 10 uM esti sykliini D1 28% ja 64% tässä järjestyksessä; FH535 5 ja 10 uM inhiboi elossa 24% ja 48% vastaavasti (Fig. 6).

LCSCs, Huh7 ja Hep3B-soluja käsiteltiin pelkästään DMSO: lla tai kasvavia pitoisuuksia FH535 38-PCR ilmentämiseen sykliini D1 (paneeli A) tai Surviviinispesifisiä (paneeli B). Molemmissa tapauksissa mRNA-tasot piirrettiin suhteessa p

2-mikroglobuliinin. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

Huh7-soluja käsiteltiin pelkästään DMSO: lla tai kasvavia määriä FH535 38-PAGE ja siirrettiin Western-analyysi vasta-aineilla sykliini-D1, surviviinia, ja β aktiini. Yläosa osoittaa Western blot kuva; pohja kaavio osoittaa densitometristä analyysiä läntisen datan. Tämä Densitometrinen analyysi osoitti, että FH535 5 ja 10 uM esti sykliini D1-proteiinin tasot 28% ja 64% tässä järjestyksessä; FH535 5 ja 10 uM esti Surviviiniproteiini tasoilla 24% ja 48% vastaavasti. Koe suoritettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

Keskustelu

Viime vuosina lukuisat signalointipolkujen ovat sekaantuneet maksan syövän synnyn. Β-kateniinin reitti on välttämätöntä kantasoluja itseuudistumisen ja ylläpito kantasolujen ominaisuuksia. Häiriöt tätä tasapainoa tulosten sekä geneettisiä ja epigeneettiset muutokset, monissa syövissä, kuten paksusuolen syövän ja HCC [4]. Tässä tutkimuksessa käytimme FH535 estäjänä ja β-kateniinin kautta. Tämä yhdiste on käytetty aiemmin estävän β-kateniinin ilmentymistä solujen paksusuolen ja keuhkojen sekä soluja hepatoblastooma ja HCC [15]. Tässä raportissa tekijät päättelivät, että FH535 oli myrkyllinen useita solulinjoja, mukaan lukien Huh7.