PLoS ONE: takautuvasti Isolated syöpään liittyvän CD10 + Sidekudosmuodostussolujen on vahvemmat Vuorovaikutus CD133 + koolonkarsinoomasoluissa kuin CD133- syöpäsoluja
tiivistelmä
Vaikka CD133 on raportoitu olevan lupaava paksusuolen syövän kantasoluja markkeri, biologisten toimintojen CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa edelleen kiistanalainen. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme biologinen erot CD133
+ ja CD133
– koolonsyöpäsoluja, jossa keskitytään erityisesti niiden vuorovaikutus syöpään liittyvän fibroblastit, erityisesti CD10
+ fibroblasteissa. Käytimme 19 ensisijainen paksusuolen syövän kudoksissa, 30 primaariviljelmiä saaduissa fibroblasteissa paksusuolensyöpä kudosten ja 6 koolonsyöpäsolulinjoissa. Me eristetty CD133
+ ja CD133
– osapopulaatioiden päässä paksusuolen syöpä kudoksia ja viljeltyjä soluja.
In vitro
analyyseissä ilmeni, että kahden populaation osoittivat samanlaisia biologista käyttäytymistä niiden leviäminen ja kemosensitiivisyys.
In vivo
analyyseissä ilmeni, että CD133
+ solut osoittivat merkitsevästi suurempi kasvaimen kasvua kuin CD133
– soluja (
P
= 0,007). Lisäksi keraviljelmistä primaaristen saaduissa fibroblasteissa paksusuolensyöpä kudoksista, CD133
+ solut osoittivat merkitsevästi enemmän invasiivisia käyttäytymistä kuin CD133
– soluja (
P
0,001), etenkin keraviljelmistä kanssa CD10
+ fibroblasteja (
P
0,0001). Edelleen
in vivo
analyyseissä ilmeni, että CD10
+ fibroblastit tehosti kasvaimen kasvua CD133
+ solujen huomattavasti enemmän kuin CD10
– fibroblasteja (
P
0,05) . Nämä tiedot osoittavat, että
in vitro
invasiivisia ominaisuuksia ja
in vivo
kasvaimen kasvua CD133
+ paksusuolensyöpä solut parannettu läsnä ollessa erityinen syöpään liittyvän fibroblastit, CD10
+ fibroblastit, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutukset näiden erityisten solupopulaatioiden on tärkeä rooli syövän etenemiseen. Näin ollen, nämä erityiset vuorovaikutukset voivat olla lupaavia kohteita uusien paksusuolen syövän hoitomuotoja.
Citation: Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru M, Nakata K, et ai. (2010) takautuvasti Isolated syöpään liittyvän CD10
+ Sidekudosmuodostussolujen on vahvemmat Vuorovaikutus CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa kuin CD133
– syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10,1371 /journal.pone.0012121
Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong
vastaanotettu: 08 maaliskuu 2010; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2010; Julkaistu: 12 elokuu 2010
Copyright: © 2010 Cui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tuettu osittain Grant-in-tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan, ja avustusta Takeda Science Foundation, Japanin Society gastroenterologian, The Uehara Memorial Foundation, ja Nakajima Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
peräsuolen syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat länsimaissa ja sen esiintyvyys kasvaa Aasian maissa seurauksena muutoksia kohti länsimaistuneen ruokavalio [1]. Äskettäin käsite syövän kantasoluja (CSCS) on keskittyneenä biologiassa peräsuolen syöpä. Paksusuolensyöpä havaitaan merkittävä verran morfologiset ja toiminnalliset heterogeenisuus sen soluissa. Näistä solupopulaatioiden, CSCS erityisesti on raportoitu omaavan tuumorigeenisemmiksi ja hoitoresistenteille toiminta [2]. Näin ollen, eristäminen ja karakterisointi paksusuolen CSCS voi auttaa kohti kehittämään uusia diagnostisia ja terapeuttisia menettelyjä [3].
Ihmisen prominin-1 (PROM1, CD133) on 5-transmembraaninen glykoproteiini 865 aminohappojen yhteensä molekyylipaino 120 kDa. Se oli alun perin kuvattu spesifinen pinta-antigeenin ihmisen hematopoieettisten kantasolujen [4], [5] ja markkeri hiiren neuroepithelial soluja ja useita muita alkion epiteelisolujen [6]. Vaikka biologisia toimintoja CD133 ei vielä tunneta [7], CD133 yksin tai yhdessä muiden markkereiden tällä hetkellä käytetään eristämään kantasoluja lukuisista kudoksista [4], [5], sekä eturauhasen [8], maksan [9 ] ja haiman [10], [11]. Äskettäin, CD133: n raportoitiin olevan CSC markkeri paksusuolen syöpä [3], [12]. Ieta et ai. [13] raportoivat lisäksi, että CD133
+ soluja, jotka ovat peräisin koolonsyöpäsolulinjoissa esiintyy enemmän tuumorigeeninen potentiaali kuin CD133
– soluja. Kuitenkin Shmelkov et ai. [14] osoitti, että CD133 ilmentyy laajalti ihmisen ensisijainen paksusuolensyöpä epiteelisolujen, ja että molemmat CD133
+ ja CD133
– etäpesäkekasvainten osapopulaatioiden pystyvät pitkäaikaisia tumorigeneesin
in vivo
. Siksi vaikutukset CD133 kuin CSC merkki pysyy kiistanalainen.
On ehdotettu, että vuorovaikutukset syöpäsoluja ja ympäröivän strooman fibroblastit ovat kriittisiä rooleja invaasion ja -metastaasin [15], [16]. Vaikka pääosa kasvaimet tiedetään koostuvan heterogeenisen syöpäsolujen eri leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden toimintaa, ei ole raportteja keskittyvät heterogeenisyys syöpään liittyvien fibroblasteissa. Useimmissa aiemmissa tutkimuksissa [17], [18], [19], [20], vain kaksi tai kolme primaariviljelmiä syöpään liittyvien fibroblastien on käytetty tutkimuksissa. Siksi ymmärtää paremmin syöpäsolujen-stroomasolujen vuorovaikutus on tärkeää keskittyä heterogeenisyys syöpään liittyvän fibroblasteja, samanlainen heterogeenisuus syöpäsolujen, kuten CSCS.
Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet biologisia vaikutuksia CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa analysoimalla CD133 ilmentyminen ihmisen primaarisissa paksusuolensyöpä kudosten ja arvioidaan biologisen käyttäytymisen CD133
+ ja CD133
– soluja, jotka ovat peräisin koolonsyöpäsolulinjoissa
in vitro
ja
in vivo
. Löysimme merkittäviä eroja invasiivisuus näiden kahden väestöjen keraviljelmistä primaaristen saaduissa fibroblasteissa paksusuolensyöpä kudoksissa, erityisesti keraviljelmistä fibroblasteja positiivinen CD10, kalvo metalloendopeptidaasi. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että CD133
+ paksusuolen syövän solut ovat invasiivisia, kun läsnä on erityisiä syöpään liittyvän fibroblastit, erityisesti CD10
+ fibroblastit, ja että nämä solupopulaatiot voivat olla lupaavia kohteita metastaasin inhiboinnissa ja kasvaimen toistuminen.
tulokset
CD133 ilmentyminen kirurgisesti resektoitiin ensisijainen paksusuolensyöpä kudoksiin
Toistaiseksi ristiriitaisten tietojen on raportoitu koskien CD133
+ ja CD133
– solupopulaatioiden ensisijainen paksusuolensyöpä kudoksissa [3], [14]. Olemme tutkineet prosenttiosuuksia CD133
+ ja CD133
– solupopulaatioiden ensisijainen paksusuolensyöpä kudoksiin virtaussytometrialla. Käytimme 26 ensisijainen paksusuolensyöpä kudosten ja 24 normaalin paksusuolen epiteelikudoksissa 26 potilasta. Analysoimme CD133
+ populaatioiden näissä paksusuolen kudoksiin ilman CD45
+ ja CD31
+ soluja. Kaikki paksusuolensyöpä näytteistä sisälsi sekä CD133
+ ja CD133
– soluja (taulukko 1; CD133
+ solut: 2-54%). Olemme myös havainneet CD133
+ soluja 0-5% normaalissa paksusuolen kudoksiin. Arvioida kliiniset vaikutukset CD133 ilmaisun, tutkimme korrelaatioita CD133 ilmaisun ja kliinis havainnot, kuten kasvaimen, Dukes luokitus, imusolmuke etäpesäke, imusuonten invaasio ja laskimoiden invaasio (taulukko 2). Löysimme merkittäviä korrelaatioita CD133 ilmaisun ja Dukes luokitus (
P
= 0.010) sekä CD133 ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke (
P
= 0,023).
vertailut pahanlaatuisten käyttäytymisen välillä lajitellut CD133
+ ja CD133
– koolonkarsinoomasoluissa
käyttäen virtaussytometria, tutkimme läsnäolo CD133
+ populaatioiden 6 koolonsyöpäsolulinjaa . Huomasimme, että kaikki solulinjat hallussaan CD133
+ soluja (6-91%; kuvio 1A). Erityisesti olemme havainneet kaksi erillistä populaatioita, yksi koostuu ainoastaan CD133
+ -solujen ja muiden koostuu ainoastaan CD133
– soluja, DLD-1-soluissa, kun taas muita solulinjoja ilmestyi joilla on yksi populaation, joka koostuu molemmat CD133
+ ja CD133
– soluja. Olemme järjestetty DLD-1-solujen pohjalta CD133 ilmaisun ja reanalyses osoittivat tehokasta valintaa (CD133
+: 98%; CD133
-: 100%; kuvio 1 B). Myöhemmin olemme tutkineet ajasta riippuvia muutoksia CD133 ilme lajittelemattomien DLD-1 vanhempien solujen ja lajitellaan CD133
+ ja CD133
– soluja. Kuten kuviossa 1B, lajiteltu CD133
+ solut osoittivat merkittävää ajasta riippuvia muutoksia CD133
+ ja CD133
– populaatiot aikana pitkäaikainen kulttuuri, kun prosenttiosuudet CD133
+ ja CD133
– populaatiot eivät muutu vanhempien soluissa ja lajitellaan CD133
– soluja. Seuraavaksi verrata biologista käyttäytymistä lajitellun CD133
+ ja CD133
– soluja, käytimme DLD-1 ja HCT116-solut ja niitä on tutkittu niiden solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen kyky ja chemoresistance 5-fluorourasiilin (5-Fu) ja doksorubisiini (DOX). Emme ei havaittu huomattavia eroja näissä solussa käyttäytymistä välillä CD133
+ ja CD133
– soluja (kuviot S1, S2, S3, S4).
(A) CD133
+ väestön erittäin paneeli ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Virtaussytometria analyysit suoritettiin tutkimaan CD133
+ populaatioiden 6 koolonsyöpäsolulinjaa. (B) analyysi CD133
+ väestön vanhempien DLD-1-soluissa ja reanalyses lajitellun CD133
+ soluja (98%) ja CD133
– soluja (100%) (ylempi paneeli). Ajasta riippuvat muutokset CD133
+ populaatioiden lajittelemattoman vanhempien ja lajitellaan CD133
+ ja CD133
– DLD-1-soluissa on myös esitetty (alempi kuva). Lajitellut CD133
+ soluilla merkittävää ajasta riippuvia muutoksia CD133
+ ja CD133
– populaatiot aikana pitkäaikainen kulttuuri, kun prosenttiosuudet CD133
+ ja CD133
– populaatiot eivät muutu emosoluilta ja lajitellaan CD133
– soluja. (C) Kasvaimen kasvu arvioitiin 1 kuukauden kuluttua injektion 5 x 10
6 CD133
+ tai CD133
– DLD-1 soluja 6 SCID hiiriin, vastaavasti. Edustavia valokuvia esitetään yläpaneeli (vasen: CD133
– soluperäisissä kasvain, oikealle: CD133
+ soluista peräisin kasvain). Asteikko bar = 1 cm. CD133
+ soluperäisissä kasvaimet ovat huomattavasti suuremmat kuin CD133
– soluista peräisin kasvaimet (
P
= 0,007; alempi paneeli). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD.
arvioimiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja
in vivo
kasvaimen kasvua CD133
+ ja CD133
– DLD-1-soluissa, me istutetut sarjanumerot CD133
+ ja CD133
– soluja sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä. Vaikka oli suuntaus kohti aiemmin havaita kasvainten muodostumista hiirillä ruiskutetaan CD133
+ soluja verrattuna hiiriin ruiskutettiin CD133
– soluja, erot eivät olleet merkittäviä (taulukko 3). 10 viikon kuluttua transplantaation injektio yli 5 x 10
6 CD133
+ tai CD133
– soluja syntyy näkyviä kasvaimia kaikissa hiirissä. Kuitenkin, kun kasvain koot verrataan, CD133
+-soluista peräisin kasvaimet olivat merkittävästi suurempia kuin CD133
– soluista peräisin kasvaimia (
P
= 0,007; kuvio 1C).
syöpään liittyvän fibroblastit parantaa invasiivisuus on CD133
+ soluja tehokkaammin kuin CD133
– soluja
Valaistaan tekijät aiheuttavat eroja
in vivo
kasvaimen kasvua välillä CD133
+ ja CD133
– soluja, tutkimme vaikutuksia keraviljelmistä syöpään liittyvien fibroblastit on invasiivisuus näiden solujen. Huomasimme, että ei ollut eroa invasiivisuus välillä CD133
+ ja CD133
– kun soluja viljeltiin yksinään (kuvio 2A). Sen sijaan, kun solut viljellään syöpään liittyvien fibroblastit, CD133
+ solut osoittivat merkitsevästi suurempi invasiivisuus kuin CD133
– soluja ja vanhempien solut (
P
0,001 molemmille Kuvio 2A). Tutkimme vaikutukset 12 primääriviljelmien fibroblastien on invasiivisuus on CD133
+ soluja, ja totesi, että vaikutukset Yhteisviljeltyjä solujen CD133
+ soluinvaasiota vaihteli 0,88-kertaiseksi 1,76-kertainen (taulukko 4 ).
(A) Tunkeutuvat solut mitattiin 48 tunnin jälkeen monokulttuurisen tai yhteisviljelmä syöpään liittyvien fibroblasteja (f11). CD133
+ soluja viljellään syöpään liittyvien fibroblastit ovat merkittävästi suurempia invasiivisuus kuin CD133
– soluja ja vanhempien solut (
P
0,001). Mittaviivat = 100 pm. (B) prosenttiosuudet CD10
+ solupopulaation ja toimintaa näiden solujen indusoimiseksi hyökkäyksen Yhteisviljeltyjä koolonkarsinoomasoluissa tutkittiin 12 primääriviljelmien fibroblasteissa. On olemassa merkittävä positiivinen korrelaatio parantamiseksi CD133
+ solu invasiivisuus ja prosenttiosuus CD10
+ solupopulaation (
P
0,0001). (C) Virtaussytometria analyysit tehtiin tutkimiseksi CD10
+ väestön ensisijainen paksusuolensyöpä kudoksiin. On olemassa merkittävä korrelaatio prosenttiosuudet CD133
+ ja CD10
+ populaatioiden paksusuolensyöpä kudoksissa (
P
= 0,015).
korrelaatioita prosenttiosuuksien solunpintamarkkeria-positiivisia väestön syöpään liittyvän fibroblasteja ja niiden parantaminen syövän invaasio
luonnehtivat primääriviljelmien syöpään liittyvän fibroblastit, selvitimme ilmauksia strooman soluun liittyvä pinnalla markkereita CD10, CD105, CD44 ja CD54 32 primaariviljelmiä fibroblastien virtaussytometrialla (taulukko 4). Sitten tutkittiin väliset korrelaatiot parantamista CD133
+ solu invasiivisuus ja prosenttiosuudet positiivisista näille pintamerkkiaineita. Löysimme merkittävä korrelaatio parantamiseksi CD133
+ solu invasiivisuus ja prosenttiosuus CD10
+ väestöstä (
P
0,0001; ρ = 0,928, Kuvio 2B, taulukko 5). Kuten on esitetty taulukossa 4, prosenttiosuus CD10
+ väestön primaariviljelmissä syöpään liittyvien fibroblastit perustetaan koolontuumoreissa vaihteli 0,39%: sta 73,33%. Olemme myös löytäneet merkittävän käänteinen korrelaatio prosenttiosuuksia CD10
+ ja CD105
+ populaatioiden (
P
0,0001; taulukko 5), sekä merkittävä käänteinen korrelaatio lisälaite of CD133
+ solu invasiivisuus ja prosenttiosuus CD105
+ väestöstä (
P
= 0,0268; taulukko 5).
Seuraavaksi tutkimme CD10 ilmaisun kirurgisesti toistoleikattiin ensisijainen kudosten ja havaittiin, että 0,4-25% soluista, jotka ovat peräisin paksusuolensyöpä kudokset CD10
+ (taulukko 1). Sitten tarkasteltiin korrelaatioita prosenttiosuus CD10
+ väestön ja kliinis havainnoista. Löysimme suuntaukset kohti positiivinen korrelaatioita prosenttiosuus CD10
+ väestön ja Dukes luokitus välillä prosenttiosuus CD10
+ väestön ja imusolmuke etäpesäke, vaikka ne eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (taulukko 2). Tutkimme myös korrelaatiot joukossa solunpintamarkkereiden samalla potilaille ja löysi merkittävä korrelaatio prosenttiosuudet CD133
+ ja CD10
+ populaatioiden (
P
= 0,015; ρ = 0,4063 ; kuvio 2C).
CD10
+ fibroblastit parantaa
in vitro
invaasiota ja
in vivo
kasvaimen kasvua CD133
+ syöpäsoluja
tutkimiseksi toiminnallisia eroja CD10
+ ja CD10
– fibroblastit, me lajitellaan CD10
+ ja CD10
– fibroblasteissa (kuvio 3A) alkaen primääriviljelmien syöpään liittyvien fibroblasteissa. Tasot
CD10
mRNA näissä kahdessa populaatiossa olivat yhdenmukaisia tasot CD10 solun pinnan proteiinin ilmentymiseen (kuvio 3A). Käyttämällä näitä kahden populaation fibroblasteissa tutkimme niiden vaikutukset invasiivisuus on CD133
+ ja CD133
– syöpäsoluja. CD10
+ fibroblastit parannettu invasiivisuus on CD133
+ syöpäsolujen huomattavasti enemmän kuin CD10
– fibroblasteja (
P
0,0001; HCT116-solut, kuvio 3B, DLD-1-soluja, kuvio 3C). CD10
+ fibroblastit myös hieman parannettu invasiivisuus on CD133
– syöpäsolut yli CD10
– fibroblasteja, mutta huomattavasti vähemmän kuin niiden vaikutus invasiivisuus on CD133
+ syöpäsolujen (
P
0,001; Kuva 3C). Vaikutusten arvioimiseksi on CD10
+ ja CD10
– fibroblasteissa on
in vivo
kasvaimen kasvua, me cotransplanted CD133
+ tai CD133
– HCT116 syöpäsolut ja CD10
+ tai CD10
– fibroblasteja SCID hiiriin. CD10
+ fibroblastit tehosti kasvaimen kasvua CD133
+ syöpäsolujen huomattavasti enemmän kuin CD10
– fibroblasteja (
P
0,05, kuvio 3D).
( A) analyysi primääriviljelmien paksusuolen syöpään liittyvien fibroblasteja (vasen paneeli) ja reanalyses Lajitellun CD10
+ soluja (keskimmäinen yläpaneeli) ja CD10
– soluja (keskimmäinen alempi paneeli).
CD10
mRNA tasot lajitellut CD10
+ ja CD10
– fibroblasteja mitattiin qRT-PCR (oikea paneeli). (B, C) invasiivisuus on CD133
+ ja CD133
– syöpäsolut viljellään kanssa CD10
+ tai CD10
– fibroblasteissa arvioitiin. Edustavia kuvia on esitetty (B, HCT116-solut, C, DLD-1-soluissa). Mittaviivat = 100 pm. CD10
+ fibroblastit parantaa invasiivisuus on CD133
+ syöpäsolujen huomattavasti enemmän kuin CD10
– fibroblasteja (
P
0,0001). (D) vaikutukset CD10
+ ja CD10
– fibroblasteissa on
in vivo
kasvaimen kasvua arvioitiin 4 viikon kuluttua cotransplantation of CD133
+ tai CD133
– HCT116 syöpä solut ja CD10
+ tai CD10
– fibroblasteja SCID hiiriin (
n
= 6 kussakin ryhmässä). Edustavia kuvia on esitetty (ylempi paneeli). Asteikko bar = 1 cm. CD10
+ fibroblastit parantaa kasvaimen kasvua CD133
+ HCT116 syöpäsolujen huomattavasti enemmän kuin CD10
– fibroblasteja (
P
0,05 alempi paneeli). Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD.
vaikutus CD10 Knockdown vuonna CD10
+ fibroblasteissa on hyökkäys Yhteisviljeltyjä koolonkarsinoomasoluissa
tutkia CD10-proteiinia fibroblasteissa toiminnallisesti myötävaikuttaa tehostaminen hyökkäyksen Yhteisviljeltyjä syöpäsoluja, fibroblastit transfektoitu
CD10
-targeting pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) (siRNA-1 ja siRNA-2) tai kontrollina siRNA käytettiin hyökkäystä määrityksissä. Molemmat
CD10
-targeting siRNA esti 90%
CD10
mRNA ilmaisun. Knockdovvn CD10 ilmentymisen CD10
+ fibroblastit vähensi huomattavasti invasiivisuus on Yhteisviljeltyjä CD133
+ HCT116 syöpäsolujen (
P
0,001; kuvio 4), mutta oli rajallinen vaikutus invasiivisuus on CD133
– syöpäsolut.
knockdovvn CD10 ilmentymisen CD10
+ fibroblastit huomattavasti vähentää invasiivisuus on Yhteisviljeltyjä CD133
+ HCT116 syöpäsolujen (
P
0,001) , mutta on rajallinen vaikutus invasiivisuus on CD133
– syöpäsoluja. Edustavia valokuvia (ylempi paneeli) ja kuvaajat (alempi kuva) näytetään. Mittaviivat = 100 pm.
Differential ilmentymisen profilointi CD10
+ ja CD10
– fibroblasteissa
Valaistaan avainmolekyylejä mukana CD10
+ fibroblasti-välitteisen parantaminen
in vitro
invaasiota ja
in vivo
kasvaimen kasvua CD133
+ paksusuolen syöpäsoluissa, suoritimme mikrosiru analyyseistä CD10
+ ja CD10
– ensisijainen-viljeltyjen fibroblastien peräisin koolontuumoreissa. Vertailuja microarray tietojen välillä CD10
+ ja CD10
– ensisijainen-viljeltyjen fibroblastien tunnistettu 20 geeniä, jotka olivat voimistuvan 2-kertaisesti CD10
+ fibroblasteja (taulukko S1). Validoiminen microarray data, qRT-PCR suoritettiin. Valitsimme
ALDH1A1
,
GPNMB
,
MMP3
ja
IGFBP2
geeneistä taulukossa S1 koska nämä geenit on raportoitu osallistuvan syöpäsolujen invaasion ja paksusuolen kantasoluja on myös raportoitu ilmaista ALDH1 [21], [22], [23], [24], [25]. Vahvistetut tiedot olivat yhdenmukaisia microarray data (kuva S5).
vaikutusten arvioimiseksi
CD10
Knockdown sen ilmentymiä neljän hyökkäyksen liittyvien geenien (
MMP3
,
ALDH1A1
,
GPNMB
ja
IGFBP2
) in CD10
+ fibroblastit, CD10
+ fibroblastit transfektoitiin
CD10
-targeting tai ohjaus siRNA: t, ja ilmaisuja neljän hyökkäyksen liittyvien geenien arvioitiin. Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia ilmauksia nämä neljä geeneistä (kuvio S6).
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa, meidän
in vitro
kokeet paljastivat, että CD10
+ saaduissa fibroblasteissa paksusuolensyöpä kudoksista merkittävästi parannettu hyökkäyksen CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa verrattuna CD10
– fibroblasteissa. Olemme myös havainneet, että knockdovvn CD10 in CD10
+ fibroblastit osittain vähensi invasiivisuus on Yhteisviljeltyjä CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa. Lisäksi meidän
in vivo
analyysit osoittivat, että cotransplantation of CD10
+ fibroblastit lisäsi merkittävästi kasvaimen kasvua CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa verrattuna cotransplantation of CD10
– fibroblasteissa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että tietty alijoukko paksusuolen syövän soluja, CD133
+ soluja, on merkittävää vuorovaikutusta tietyn alijoukon syöpään liittyvän fibroblastit, CD10
+ fibroblasteissa. Tämä on ensimmäinen raportti kuvata syöpäsolu-stroomasolulinja vuorovaikutukset takautuvasti lajiteltu tiettyjä osia koolonkarsinoomasoluissa ja syöpään liittyvän fibroblasteissa.
CSCS on eristetty paksusuolensyöpä perusteella niiden ilmentyminen solun pintamerkkiaine CD133 [3], [12], [26]. Vaikka useat tutkijat ovat äskettäin julkaissut raportteja CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa [3], [12], [26] oli ristiriitaisten tietojen koskien kasvaimen aloittamista kyky CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa. Tässä tutkimuksessa, löysimme Tuumorigeenisuustutkimuksissa molemmissa CD133
+ ja CD133
– paksusuolen syöpäsoluissa, sopusoinnussa tulosten Shmelkow et al. [14]. Lisäksi löysimme mitään merkittäviä eroja näiden kahden solupopulaatioiden niiden
in vitro
soluproliferaatioon, pesäkkeiden muodostumisen ja chemoresistance. Kuitenkin esillä
in vivo
analyyseissä ilmeni, että CD133
+ soluja tuotetaan merkittävästi suurempia kasvaimia kuin CD133
– soluja. Ymmärtää vaikutuksia ristiriitaisia tuloksia välillä
in vitro
ja
in vivo
kokeissa olemme keskittyneet syöpäsolujen-stroomasolulinja vuorovaikutuksia, joiden tiedetään olevan keskeinen rooli syövän etenemisessä [ ,,,0],27]. Vuonna keraviljelmistä useita primääriviljelmien syöpään liittyvän fibroblastit, invasiivisuus on CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa lisääntyi merkitsevästi verrattiin CD133
– soluja, kun taas primääriviljelmien muiden syöpään liittyvien fibroblastit eivät näytä on tällainen potentiaali parantaa invasiivisuus syöpäsoluja. Siksi me tunnettu nämä primääriviljelmien syöpään liittyvän fibroblasteja, ja totesi, että CD10
+ fibroblasteissa oli merkittävä rooli parantamiseksi CD133
+ syöpäsolun invasiivisuus in
in vitro
ja
in vivo
kokeita.
Tässä tutkimuksessa käytimme CD133
+ ja CD133
– soluja eristettiin viljellyistä solulinjoista, koska emme voineet saada toistettavia tuloksia tuumoreita määrityksiä ja yhteisviljelmä kokeita kun käytimme CD133
+ ja CD133
– soluja eristettiin potilaiden kasvaimia alustavassa tutkimuksessa. On kuitenkin tärkeää tutkia biologista käyttäytymistä CD133
+ ja CD133
– osapopulaatioiden eristetty potilaiden kasvaimia. Siksi lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään suhdetta primaarikasvaimen johdettuja CD133
+ syöpäsoluja ja CD10
+ fibroblasteissa. Meidän on kuitenkin parantaa menetelmiä primaariviljelmiä syöpäsolujen ennen näitä tarkastuksia voidaan suorittaa. Lisäksi käytimme ihonalainen malleja tässä tutkimuksessa, koska vaikeuksista arvioitaessa kasvaimen kokoon potilaalle tehdä malleja. Ottaen kuitenkin huomioon, että on tärkeää kudoksen microenvironment, tutkimukset käyttäen potilaalle tehdä malleja tulee tehdä seuraavassa vaiheessa.
CD10 on 90-100 kDa solun pinnalla sinkki riippuvaista metalloproteaasi, joka on laajalti ilmaistaan solujen eri kudoksissa, kuten lymfaattisessa progenitorisolujen, myoepithelial solujen ja stroomasolujen normaalin luuytimen ja kohdun limakalvon [28], [29], [30], [31]. Lisäksi CD10 raportoitiin olevan markkeri luokitella akuuttia leukemiat ja subclassifying pahanlaatuisten lymfoomien [32]. Viimeaikaiset immunohistokemialliset tutkimukset osoittivat, että taajuus positiivinen CD10 tukikudosten ilmentyminen kasvaimissa korreloi merkitsevästi ennusteeseen sairastavien potilaiden rintasyöpiä [18] sekä hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden mahasyövistä [19]. Ogawa et ai. [31] suorittamansa immunohistokemiallinen tutkimus paksusuolisyövän ja kertoi, että ilmentyminen CD10 vuonna stroomasoluissa oli useammin havaittu invasiivisen kasvaimet kuin ei-invasiivisia kasvaimia. Havainnot näiden aiempien immunohistokemiallisella tutkimukset ovat yhdenmukaisia nykyisen toiminnallisen tutkimuksessa.
Tämänhetkiset tulokset osoittivat, että knockdovvn CD10 ilmentymisen CD10
+ fibroblastit osittain, mutta merkittävästi, vähensivät invasiivisia kykyä Yhteisviljeltyjä CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa. Meidän microarray data tunnistaneet useita geenejä, jotka osallistuvat hyökkäys syöpäsolujen, mutta knockdovvn CD10 ilmaisua ei vaikuttanut ilmaisuja näiden geenien. Tiedot voi ehdottaa, että CD10
+ fibroblasteissa on sekä CD10-riippuvaista ja CD10-riippumattomia keinoja edistää hyökkäyksen Yhteisviljeltyjä CD133
+ paksusuolen syöpäsoluissa, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään yksityiskohtaisia mekanismeja näiden vuorovaikutusten.
Yhteenvetona esillä toiminnalliset analyysit viittaavat siihen, että vuorovaikutukset CD133
+ koolonkarsinoomasoluissa ja syöpään liittyvän CD10
+ fibroblastit ovat tärkeitä rooleja paksusuolen syövän etenemiseen. Nämä vuorovaikutukset voivat olla lupaavia kohteita paksusuolen syövän hoitomuotoja.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics selvitys
Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Kyushu University (hyväksyntänumero, 19 -13) ja noudatetaan sovittuja eettisiä ohjeita Human Genome /Gene Research säätänyt Japanin hallituksen. Kaikki potilaat edellyttäen allekirjoitti tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin määrittelemättömistä tutkimustarkoituksiin. Kaikkien kokeista, joissa hiiret, eläimet asutettiin laminaarivirtaus- kaapit erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa laitoksissa hyväksymässä Kyushu University (hyväksymisnumero, A020-018-0).
Solut ja reagenssit
Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa (DLD-1, RCM1 ja Colo201) ostettiin Japani Collection of Research Bioresources (Osaka, Japani). Lövön ja Colo205 solulinjat saatiin RIKEN (Tsukuba, Japani) ja HCT116-solulinjaa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Perustimme 32 primääriviljelmien paksusuolen syöpään liittyvien saaduissa fibroblasteissa resektoitiin koolontuumoreissa 26 potilasta kuten aiemmin on kuvattu [33]. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota on täydennetty streptomysiiniä (100 ug /ml), penisilliiniä (100 U /ml) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa ympäristössä, joka on 90% ilmaa ja 10% CO
2. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen soluja viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki kudosnäytteet saatiin aikaan kirurgian osastolla Kirurgian I, Kyushu University Hospital (Fukuoka, Japani). Kokenut patologit suoritettu histologinen tutkimus kaikille kudosten vieressä yksilöitä.
5-Fu ja DOX oli ystävällisesti Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japani) ja Nippon Roche K.K. (Kamakura, Japani), vastaavasti.
Virtaussytometria
kudosnäytteet pestiin perusteellisesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jauhettiin noin 1 mm
3 kuutiot saksilla ja hajotetaan yksittäisiksi soluiksi pilkkomalla kollagenaasin (Wako Pure Chemical Industries). Dissosioidut solut suodattimen läpi. Ensisijainen johdetut solut resektoitua kudosten ja hajotettiin DLD-1-soluja suspendoitiin jääkylmään 1% FBS PBS: ssä 1 x 10
6 solua /100 ui. Kukin Suspensiota inkuboitiin vasta-aineen kanssa jäissä 40 min. Leimatut solut analysoitiin käyttämällä EPICS ALTRA virtaussytometrillä (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) varustettu kahdella lasereita, jotka tarjotaan viritysaallonpituuksia 488 nm fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), fykoerytriini (PE) ja propidiumjodidia (PI) signaaleja ja 635 nm varten allofykosyaniini (APC) signaaleja. Tuloksena fluoresenssiemissiot kerättiin kaistanpäästösuodatin sarjaa 525 ± 15 nm FITC, 575 ± 10 nm PE, 610 ± 12 nm PI ja 675 ± 25 nm: APC. EXPO32 virtaussytometrillä ohjelmisto (Beckman Coulter Inc.) käytettiin määrittämään fluoresenssi signaaleja ja asettaa loogisen elektronisen-gating parametrit. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään FACS-analyysejä lueteltu taulukossa S2.
qRT-PCR
Kokonais-RNA uutettiin viljellystä ja /tai lajitella soluja käyttäen High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics , Mannheim, Saksa) ja DNaasi I (Roche Diagnostics) hoitoon, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suunnittelimme spesifisiä alukkeita (taulukko S3) ja suoritettiin BLAST etsii varmistamiseksi erityispiirteet näitä alukkeita. Yksi askel qRT-PCR suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen KK, Tokio, Japani) ja Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],34]. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena ja ilmentyminen Jokaisen geenin esitetty suhde ilmentymisen kunkin kohdegeenin mRNA: ta ja että
18S rRNA
.
CD10
siRNA
esto
CD10
geeniekspressio saatiin aikaan RNA-interferenssi siRNA: illa vastaan
CD10
(siRNA-1: sense, 5′-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 ’, antisense, 5’-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 ’; siRNA-2: sense, 5′-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3′, antisense, 5’-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 ’; Qiagen, Myrkytystietokeskus Mainz, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [35]. Voit tarkistaa spesifisyys knockdown vaikutusten käytimme ohjaus siRNA (Qiagen).