Krooninen sairaus

tiivistelmä

Infektio ihmisen papilloomaviruksen (HPV) aiheuttaa kohdunkaulan intraepiteliaalisten neoplasia (CIN) ja syöpä. Alassäätöä E6: n ja E7 ilmentyminen voi olla vastuussa positiivisten tulosten havaittiin IFN hoitoa, mutta molekyylitasolla ei ole hyvin määritelty. Koska miRNA tärkeä rooli HPV aiheuttama kohdunkaulan syövän synnyn oletamme, että IFN-β voi säädellä ilmauksia tiettyjen miRNA kohdunkaulan syöpäsoluja, ja että nämä miRNA voivat välittää E6- ja E7 ilmentyminen, mikä moduloida niiden onkogeeninen. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-129-5p olla ehdokkaana IFN-β indusoituva miRNA. MiR-129-5p tasot vähitellen vähenee kehittäminen kohdunkaulan intraepiteliaalisia vaurioita. Manipulointi miR-129-5p ilmentyminen HeLa-soluissa moduloi HPV-18 E6 ja E7-viruksen geenien ilmentymistä. Eksogeeninen miR-129-5p inhiboi soluproliferaatiota HeLa-soluissa, edistää apoptoosia ja estää solusyklin etenemisen HeLa-soluissa. SP1 on välittömänä kohteena miR-129-5p HeLa-soluissa. Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti solun miRNA anti-HPV aktiivisuutta ja tarjoaa uusia oivalluksia sääntelymekanismeja väliseen HPV ja IFN järjestelmä isäntäsoluissa on miRNA tasolla.

Citation: Zhang J, Li S Yan Q, Chen X, Yang Y, Liu X, et al. (2013) interferoni-β aiheuttama

microRNA-129-5p

down-regulation HPV-18 E6 ja E7 Viral Gene Expression by kohdistaminen SP1 kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10,1371 /journal.pone.0081366

Editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 11 lokakuu 2013; Julkaistu: 16 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen tukivat National Natural Science Funds Kiinassa (nro. 81072139 ja 30872760) ja 2011 Shanghai kunnan erityinen perusta terveydenhuollon (No.201002013). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdunkaulan syöpä ja kohdunkaulan intraepiteliaalisten neoplasia (CIN) aiheuttavat pysyviä infektio korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HPV) serotyypit, yleisimmin HPV16 ja HPV18 [1]. Siksi hoito HPV-infektio on avain estää kohdunkaulan syövän ja CIN. Kaksi onkoproteiineja, E6 ja E7, jotka koodaama HPV16 ja HPV18, voivat sitoutua ja stimuloida hajoaminen tuumorisuppressorien p53 ja pRb [2] – [5]. IFN on laajalti käytetty hoidossa CIN ja kohdunkaulan syöpä. Alassäätöä E6: n ja E7 ilmentyminen voi olla vastuussa positiivisten tulosten havaittiin IFN hoitoa, mutta molekyylitasolla ei ole hyvin määritelty.

MikroRNA (miRNA) ovat 19-25 nt sääntelyn RNA: ita, jotka osallistuvat sääntelyssä eri biologisia toimintoja sekä puolustuslinja taudinaiheuttajia lukuisissa eukaryoottisissa suvusta. Ne ovat yleensä uskotaan toimivan sitoutumalla epätäydellisesti komplementaarisia sekvenssien 3’untranslated (UTR) aluetta kohdegeenien, mikä laski käännöksen tai hajoamisen kohteena transkriptin. Erityisesti sekvenssi täydentävästi on 6-8 emäsparin ”siemen alueella” 5’päähän miRNA-mRNA heterodupleksilla näyttää spesifisyyden määrittämiseksi miRNA-targetRNA vuorovaikutusta. MiRNA voi olla pleiotrooppisia vaikutuksia soluproliferaatioon, apoptoosia ja solujen erilaistumista [6]. Muutokset solujen miRNA kuvioita kohdunkaulan syövän kudoksen tai kohdunkaulan syöpäsolujen on raportoitu. Downregulation ihmisen miR-218 [7], [8] ja miR-34a [9] kohdunkaulan syövän solut osoitettu HPV 16 E6 onkogeeni, kun taas esto miR-21 HPV 18-sisältävä Hela kohdunkaulan syöpäsoluja aiheuttaa vahva solujen proliferaatio [10]. Näin ollen näyttää siltä, ​​että miRNA tärkeä rooli kohdunkaulan syövän synnyn HPV.

miRNA voi olla rooli IFN-β aiheuttama E6 ja E7 tukahduttaminen. Se on 1shown miRNA voidaan indusoida IFN-β. RSA-solut, IFN-β voi aiheuttaa miR-431 ilmaisu, jotka voivat alas-säädellä IGF1 R ja IRS2 ilmaisun ja näin ollen estävät solujen proliferaatiota estämällä MAPK-reitin [11]. Hepatosyyteissä, IFN-β välittää ekspression modulaatiolle lukuisten solun miRNA lähes täydellinen täydentävät niiden siementen sekvenssejä HCV-RNA-genomi, jotka pystyvät inhiboimaan HCV-replikaation ja infektion [12]. Koska miRNA tärkeä rooli HPV aiheuttama kohdunkaulan syövän synnyn oletamme, että IFN-β voi säädellä ilmauksia tiettyjen miRNA kohdunkaulan syöpäsoluja, ja että nämä miRNA voivat välittää E6- ja E7 ilmentyminen, mikä moduloida niiden onkogeeninen. Tämän varmistamiseksi me seulottu miRNA ilmaistaan ​​ja differentiaalisesti säädellään HPV-18 positiivisia Hela-solujen altistuksen jälkeen IFN-β, ja huomasimme, että miR-129-5p olla ehdokkaana IFN- indusoituvan miRNA joka voi downregulate E6 ja E7 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja ihmisen kudoksissa

HPV 18-positiivisia Hela solulinjan [13], HPV 16-negatiivinen Siha solulinjassa [13] , HPV-negatiivinen C33A kohdunkaulan syövän solulinja [13] ja hyvin erilaistunut kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma HCC94 solulinjassa [14] käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki nämä solut kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa oli 10% FBS: ää 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Solulinjat kerättiin talteen IFN-β (3 x 10

5IU L

-1) hoitoon 2 tuntia.

Normal kohdunkaula ja kohdunkaulan syövän kudokset saatiin naisten ikä vaihteli 28 77 vuotias. Neljä normaalia kohdunkaulan näytettä otettiin potilaista, joille tehtiin kohdunpoisto hoitoon muun tyyppisiä sairauksia, kuten myoma tai adenomyoosi. Yksikään potilaista ei ollut tehty hormonihoito, sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Vaiheet ja histologinen laadut näistä kasvaimista perustettiin kriteerien mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Kunkin kudoksen näyte välittömästi snap-jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Ennen ja tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan ja hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea lääketieteellisen tiedekunnan Shanghai Jiao Tong University. Kliiniset ja patologiset koskevat tiedot kliinisistä näytteistä esitetään taulukossa 1.

Microarray ilmentymisen profiloinnin ja tietojen analysointi

Yhteensä RNA soluista tai kudoksista eristettiin käyttäen Tri-reagenssia (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) mukaan valmistajan ohjeiden. Ohitettuaan RNA laadun mittauksiin Nanodrop väline, näytteet leimattiin käyttäen miRCURY ™ Hy3 ™ /Hy5 ™ Virta -leimauskittiä ja hybridisoitiin sen miRCURY ™ LNA Array (v.11.0). Näytteet hybridisoitiin on hybridisaatio asemalla seuraavan esitettyä protokollaa valmistajan. Skannaus suoritettiin Axon GenePix 4000B microarray skanneri. GenePix pro V6.0 käytettiin lukemaan raaka-intensiteetti kuvan. Kynnysarvoja käytetään näytön ilmentyvät eri miRNA olivat kertamuutoksia ≥1.5 tai ≤0.7, ja

P

arvot ≤0.05 t-testeissä pidettiin merkittävinä.

Ratkaisevaa siemen sekvenssikomplementaarisuutta analyysi

Array tietojenkäsittely ja ratkaiseva siemenet sekvenssikomplementaarisuutta analyysi suoritettiin käyttäen www-sivustot (https://www.mirbase.org/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = pubmed ja https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).

Analyysi miRNA ja mRNA: n qPCR

Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista ja kudoksia käyttäen Tri-reagenssia. Sillä miRNA analyysi, kypsä miRNA olivat käänteistranskriptio kokonais-RNA käyttämällä erityisiä miRNA RT alukkeiden TaqMan MicroRNA Analyysit ja reagenssit TaqMan MicroRNA Käänteinen transkriptio kit. qPCR suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Pitoisuus alukkeiden kanssa TaqMan Universal PCR Master Mix ja analysoitiin ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

U6B

havaittiin sisäisenä kontrollina normalisoida kaikki tiedot. Määritys nimet

miR-129-5p

ja

U6B

olivat HSA-mir-129-5p ja RNU6B, vastaavasti (Applied Biosystems). CDNA luotiin käyttäen Prime Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, PRC). Kvantifiointiin HPV18

E6

, HPV18

E7

ja

ISG54

, reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7000 Sequence Detection System SYBR Esiseos Ex Taq ( TaKaRa). Alukkeen sekvenssit on esitetty taulukossa 2. Kaikissa qPCR määrityksissä, ilmaisuja laskettiin kaavan 2

(- ΔΔCt), jossa ACt on ero geenin Ct ja normalisoija geenin Ct. Ct edustaa kynnyssykli jossa fluoresenssi nousee tilastollisesti merkitsevästi vertailutason yläpuolella. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Solutransfektiot

Solut pestiin PBS: llä ja kytketään antibiootin vapaa kasvualusta 24-48 h ennen transfektiota. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti

pre-miR-129-5p

, epäspesifinen miRNA ohjaus (pre-miR-negatiivinen) tai tyhjä kontrolli (Applied Biosystems) Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttäen SIPORT NeoFX transfektio aine (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa. Medium korvattiin 8 tuntia myöhemmin. Yhtä suuri kopio numerot transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Lusiferaasireporttiterilla vektori, jossa on kohde sivustoja

miR-129-5p

on

SP1

3′-UTR alue osti Shanghai choseasy co., Ltd. yksityiskohtaisia ​​tietoja konstrukteja käytetään tässä kokeessa on esitetty taulukossa 3.

Proliferaatiomääritykset

Cells (3000 kuoppaa kohti) maljattiin 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin 72 tuntia transfektion jälkeen (lopullinen miRNA pitoisuus 100 nM) DMEM /F12, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solujen proliferaatio dokumentoitu 24 tunnin välein 3 päivän ajan käyttäen kolorimetristä MTT-määritystä (Sigma, St. Louis, MO), ja absorbanssi 490 nm: ssä arvioitiin Spectra Max 190 mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

solut, kuten transfektoituja soluja, olivat ilman ravintoa 24 tuntia korvaamalla väliaineessa fenolipunaista ja seerumivapaassa DMEM /F12-elatusaineessa (HyClone Laboratories, Logan, UT), ja tarvittaessa ajoneuvon ohjaus fenolipunaista väliaineessa, joka sisälsi 5% hiilellä erotettua FBS: ää (HyClone Laboratories), 48 tuntia. Solujen proliferaatio dokumentoitu joka 24. h 2 päivää. Sisällä yksittäisen kokeen, leviämisen kunkin ehdon testattiin kolmena kappaleena, ja koko koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

Solusyklianalyysiä

Solut kiinnitettiin 70% etanolilla 72 h kuluttua transfektio ja värjättiin 25 ug /ml PI (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, iN) FACS-puskuriin (PBS, joka sisältää 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA), 0,05% Triton X-100, ja 50 ug /ml RNaasi A: ta) . 30 minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa valolta suojattuna, solut analysoitiin virtaussytometrillä käyttäen Becton Dickinson FACScan, ja fraktiot solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin analysoitiin käyttäen Cell Quest Pro Software (BD Biosciences, San Jose, CA). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kolmessa riippumattomassa kokeessa.

anneksiini V-määritys

näytteet pestiin PBS: llä ja käyttämällä anneksiini V-FITC: llä ja PI-värjäyksellä olevan fosfatidyyliseriinin altistumisen ulomman solukalvon . Kun oli inkuboitu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa valolta suojattuna, näytteet kvantifioitiin virtaussytometrialla käyttäen Becton Dickinson FACScan. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena kolmen erillisen kokeen.

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

Lusiferaasimäärityksiä soluja (15000 per kuoppa) maljattiin 24 tuntia ennen transfektiota päälle valkoinen, kirkas-pohjaisille 96- levyt. Solut ko-transfektoitiin 100 ng:

SP1

3′-UTR reportteriplasmidilla 50 nM esi-miR rakentaa käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Lusiferaasiaktiivisuudeksi määritettiin 24 tunnin kuluttua transfektion kanssa Dual-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega, Madison, WI) ja mitattiin Envision Plate-lukija (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA). Näytteet testattiin kolmena kappaleena kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Western blot-analyysi

Kun asianomaiset hoidot, solut kerättiin ja proteiinit valmistettiin käyttäen NE-PER Ydin- ja sytoplasmisia Extraction Reagent (Pierce, Rockford , IL), jossa proteaasiestäjäseostabletit (Roche Diagnostics). Kaikki uutteet hajotettiin mukaan valmistajan protokollaa. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin Bradford-proteiinin menetelmää käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Proteiinit (60 ug) ladattiin betonielementtien 4% pinoaminen, 10% Tris-glysiini geeleillä ja erotetaan geelielektroforeesilla, jota seuraa elektroforeettisen-blottaus PVDF-kalvolle. Kun oli pesty Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, kalvot estettiin 5% BSA /PBS: ssä 1 h. Membraanit inkuboitiin polyklonaalisella kanin vasta-aineita vastaan, SP1 ja p21 (1:1000 laimennos) (Abcam, UK). Membraanit inkuboitiin sitten vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja blotattiin proteiinit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminoinnilla tunnistusjärjestelmä (Pierce), ja pre-stained markkereita (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), kuten molekyyli- koko standardeja. Intensiteetit proteiini kvantitoitiin käyttäen Image J ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Tilastollinen

Kaikki testit suoritettiin tilasto paketti yhteiskuntatieteiden ohjelmisto versio 17,0 (Chicago, IL, USA). Tiedot esitetään keskiarvoina sekä keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Studentin t-testejä, ja

P

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia.

Tulokset

Mirna ilmaisun profilointi HeLa-soluissa indusoi IFN-β

ilmentyvät eri miRNA välillä käsittelemättömän ja IFN-β indusoi Hela solut analysoitiin käyttäen mikrosiruja. Ilmaukset

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

ja

miR-943

todettiin olevan korkeimmin indusoitiin Hela-soluissa IFN-β ja ne valittiin mukaan jatkoanalyyseihin (taulukko 4 ja kuvio. S1). Siementen sekvenssi

miR-129-5p

näkyy täydellinen täydentää HPV-18 genomin (Fig. 1). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qPCR) oli sitten suorittaa validoimiseksi mikrosiruanalyysi, ja tulokset osoittivat, että ilmaukset

miRNA-744

,

miR-943

ja

asennuspalveli- 129-5p

olivat periaatteessa yhdenmukaisia, että mikrosirun; Aika tietenkin analyysi ilmaisun paljasti, että induktio on

miR-129-5p

tapahtui nopeasti, korkeimmillaan 48 tuntia. Samanlainen induktio

ISG54

, hyvin tunnettu IFN-β säädellä geenin säätelyä

miR-129-5p

seuraa klassista annos-vaste-käyrän välillä 3 ja 3000 IU

-1 ml IFN-β (Fig. 2).

(A) validointi microarray tietojen qPCR. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kullekin näytteelle. Inductions tunnettuja IFN geenien

ISG54

ja

ISG56

näkyvät comparsion. (B) ajan kuluessa miRNA induktion IFN-β. Hela-soluja stimuloitiin 300 IU ml

-1 IFN-β varten ilmoitettu ajat, ja

miR-129-5p

ja

ISG54

/

ISG56

ilmaisuja kvantitoitiin qPCR. (C) Annos-vaste-analyysi miRNA induktion IFN-β. Hela-soluja stimuloitiin osoitetun annoksilla IFN-β: ssa 2 h, ja

miR-129-5p

ja

ISG54

/

ISG56

ilmaisuja kvantitoitiin qPCR.

MiR-129-5p

tasot vähitellen vähenee kehittäminen kohdunkaulan intraepiteliaalisia vaurioita ja korreloi HPV-18 E6 ja E7 ilmentyminen

qPCR analyysi ihmisen kohdunkaulan intraepiteliaalisia vaurion näytteitä ja normaali kohdunkaulan kudoksissa,

miR-129-5p

ekspressiotasot olivat huomattavasti alhaisemmat syöpään kuin CIN I-II ja normaali kohdunkaulan näytettä (Fig. 3A). keskimääräinen ilmaukset

miR-129-5p

oli 10,90 ± 4,01, 4,54 ± 3,12, 1,07 ± 0,65 ja 0,57 ± 0,67, vastaavasti, normaalissa kohdunkaulan kudoksissa (kontrolli), CIN I-II ryhmä, CIN III ryhmä, ja okasolusyöpä ryhmiä. Tilastollisesti merkitseviä eroja

miR-129-5p

ilmaisuja havaittiin verrattaessa neljään ryhmään (

P

0,05). Kliinisissä vaiheissa ja patologisia laatuja CIN I-II ryhmässä verrattuna muihin ryhmiin varmistettiin olevan merkittävästi erilainen (

P

0,05). HPV-18-E6- ja E7-ilmentymisen oli merkittävästi lisääntynyt normaalin kohdunkaulan ryhmä, CIN I-II ryhmä, CIN III ryhmä, ja okasolusyöpä ryhmä (P 0,05, Fig. 3 B, C). Keskimääräinen ilmauksia HPV-18 E6 olivat 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 ja 0,94 ± 0,33, vastaavasti, normaalissa kohdunkaulan kudoksissa (kontrolli), CIN I-II ryhmä, CIN III ryhmä, ja okasolusyöpä ryhmiä, kun taas keskimääräinen ilmaisuja HPV-16 E7 olivat 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 ja 1,23 ± 0,24 näistä näytteistä. Negatiivinen korrelaatio välillä on todettu ilmentymisen miR-129-5p ja HPV-18 E6 /E7 kohdunkaulan kudosnäytteistä (P 0,05, Fig. 3 D, E).

(A): n ekspressio miRNA-129-5p ihmisen kohdunkaulan intraepiteliaalisia vaurion näytteitä ja normaali kohdunkaulan kudoksissa. (B): n ilmentyminen HPV-18 E6 samoissa näytteissä. (C) Ilmaisulla HPV-18 E7 näistä näytteistä. (D, E) Korrelaatio ilmaisuja HPV-18 E6 /E7 ja miR-129 näistä näytteistä.

manipulointi

miR-129-5p

ilmentyminen HeLa-soluissa moduloi HPV-18

E6

ja

E7

viruksen geenien ilmentymisen

Sen arvioimiseksi,

miR-129-5p

on funktionaalinen rooli myötä- sääntely HPV18

E6

ja

E7

, me manipuloitu ilmentymistason

miR-129-5p

HeLa-soluissa. Kolmeen ryhmään sisältyvät ohjaus soluja (käsittelemätön), solut, jotka oli transfektoitu ei-spesifisen miRNA-ohjaus

(pre-miR-negatiivinen) B-solut, jotka on transfektoitu

pre-miR-129

. 72 h jälkeen ohimenevän transfektion ennalta miRNA, mRNA ilmauksia HPV-18

E6

ja

E7

HeLa-soluissa havaittiin qPCR. Transfektio

pre-miR-129-5p

merkittävästi vähentynyt HPV-18

E6

ja

E7

mRNA: t (Fig. 4B, Fig. 4C ja Fig. S2), ja tämä vaikutus oli erittäin spesifinen, koska

pre-miR-negatiivinen

transfektio ei ollut vaikutusta HPV-18 E6 ja E7 ilmentyminen.

Fig. (A) osoittivat tehokkuutta miR-129 transfektiota. Kertamuutoksia n ilmauksia (B) HPV-18

E6

ja (C) HPV-18

E7

HeLa-soluissa määritettiin qPCR. Koe toistettiin kahdesti, joissa kussakin on kolme rinnakkaista. Välineet (palkit) ja SDC (virhepalkkeja) näkyvät. *

P

0,001.

Eksogeeninen

miR-129-5p

estää soluproliferaatiota HeLa-soluissa

Seuraavaksi testasimme, onko lisääntynyt tasot

miR-129-5p

voisi alentaa proliferaatiopotentiaali Hela-solujen raportoitu virtsarakon syövän soluissa. MTT-määrityksessä suoritettiin arvioimaan leviämisen HeLa-soluissa jopa 72 tuntia transfektion jälkeen

miR-129-5p

. Proliferaatiomäärityksessä paljasti, että

miR-129-5p

yli-ilmentyminen inhiboi solun kasvua (Fig. 5), kun taas solut transfektoitu ohjaus miRNA jatkoi kasvuaan tänä aikana.

Solun kasvu oli mitattuna MTT-määritys. Koe toistettiin ainakin kaksi kertaa, joissa kussakin on kolme rinnakkaista, ja tulokset on ilmoitettu absorbanssien keskiarvoa SD. *

P

0,001; #

P

0,05.

Eksogeeninen

miR-129-5p

edistää apoptoosia ja estää solusyklin etenemisen HeLa-soluissa

määräytyy anneksiini V merkintöjä, käsittelemättömät solut rinnastettavalle

pre-miR-negatiivisten

valvontaa pysyi elinkelpoisia ja olivat pääasiassa anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI) negatiivinen. Oikealle päin muutos fluoresenssin solulajittelulla (FACS) profiili, joka osoittaa apoptoosin, havaittiin HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu

pre-miR-129-5p

(Fig. 6).

anneksiini V: analyysi osoitti, että HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu

pre-miR-129-5p

näkyy huomattavasti enemmän apoptoosin tasoa kuin verrokkiryhmässä. *

P

0,01, #

P

0,05.

Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla osoittaneet, että osuudet solut G0 /G1 ja S vaiheet negatiiviset kontrollit olivat ennallaan verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Transfektio Hela-solujen kanssa

pre-miR-129-5p

johti kertymistä solut G0 /G1 vaiheeseen ja lasku solujen S-vaiheeseen verrattuna kontrolli soluihin. Virtaussytometrianalyysin viittasi siihen, että

miR-129-5p

voisi pidättää Hela-soluja G1 /S tarkastuspiste ja viivästyttää solusyklin pääsemästä S-vaiheeseen. Näin ollen

miR-129-5p

yli-ilmentyminen hidasti solusyklin etenemisen ja aiheutti solusyklin G1 vaiheessa lohko, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

SP1

on välittömänä kohteena

miR-129-5p

HeLa-soluissa

dual-lusiferaasireportteri määritystä käytettiin sen määrittämiseksi,

miR-129-5p

voisi sitoutua

miR-129-5p

kohdesivustot sisällä

SP1

3′-UTR. Käytimme konstrukteja, jotka sisältävät ennustetun siementen sekvenssin testata estävä vaikutus

miR-129-5p

. Transfektio

pre-miR-129-5p

HeLa-soluissa 48 h laski lusiferaasiaktiivisuutta verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Vaikka mitään muutosta vaikutus havaittiin, kun transfektoitu ohjaus (Fig. 7B), Western blot-analyysi varmisti, että eksogeeninen

miR-129-5p

voisi vähentää proteiinin tasot SP1 (Fig. 7C).

(A) Vector restriktiokartta. (B) SP1 oli kohteena miR-129-5p kautta 3’UTR HeLa-soluissa arvioituna käyttäen lusiferaasianalyysissä. (C) Western blot analyysit p21, SP1 ja GAPDH HeLa-soluissa, kun miR-129-5p over-ilmaisua. Välineet (palkit) ja SD (virhepalkkeja) esitetään. * P 0,05.

Keskustelu

Tässä raportissa tunnistimme IFN-β aiheuttama miRNA HPV-18 positiiviset Hela-soluissa. miRNA mikrosiruanalyysi osoitti ilmentymiä

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

ja

miR-943

korotettiin , kun taas

miR-526

* olivat vaimentua jälkeen IFN-β stimulaatiota.

miR-129-5p

oli poiminut jatkotutkimuksiin, kuten bioinformatiikka-analyysi paljasti, että

miR-129-5p

ja HPV-18-viruksen geenisekvenssien ovat täysin toisiaan täydentäviä. On osoitettu, että miR-129-5p vapautettiin useita kasvaimen muodoissaan, mukaan lukien kohdun limakalvon syöpä, ruokatorven syöpä, paksusuolen syöpä ja virtsarakon syöpä, ja sen todennettujen kohdegeenien sisältyy SOX4 [15] – [17], VCP /p97 [18] ja Cdk6 [19]. Yli-ilmentyminen miR-129-5p voi estää solujen kasvua ja indusoivat solukuoleman virtsarakon syöpään [17] ja maksan syöpä [18], mutta sen rooli kohdunkaulan syöpä ei ole selvä.

Huomasimme, että miR-129-5p yli-ilmentyminen voi estää kasvua HeLa-soluissa on noin 70,23% ja kontrollisoluja. Samaan aikaan transfektoiduissa pre-miR-129-5p lisäsi pidätys Hela-solujen G0-G1 vaiheen (68,34%), kun taas S-vaiheessa olevien solujen vähentynyt, mikä osoittaa, että solujen lisääntymistä estyi, kuten DNA-synteesin hidastunut. Nämä tulokset vaikutuksen miR-129-5p soluproliferaatioon ja solusyklin sekä sen kykyä lisätä apoptoosia vastasivat havaintojen virtsarakon syövän soluissa [17]. Tutkimuksemme osoitti myös, että miR-129-5p indusoitiin IFN-β annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Nämä tulokset merkitsevät sitä, että anti-leviämisen ja pro-apoptoosia vaikutusta IFN- kohdunkaulan syövän voi osittain induktion miR-129-5p ilme.

Kohdunkaulan syövän aiheuttamaa HPV-infektio on lähinnä liittyy E6 ja E7 viruksen onkogeenejä. By qPCR analyysi, transfektio pre-miR-129-5p HeLa-soluissa havaittiin laskua ilmaisuja E6: n ja E7 mukaan 69,01% ja 77,15% vastaavasti. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, että IFN-β aiheuttama microRNA voi alas-säädellä HPV-18 E6 ja E7-viruksen geenien ilmentymisen. Meidän lisätutkimuksissa todettiin, että transkriptiotekijä SP1 on suora alavirtaan kohteena miR-129-5p. SP1 on sekvenssi-spesifinen DNA: ta sitovan proteiinin, joka sisältää miR-129-5p sitoutumiskohta sen 3′-UTR. Alkupään säätelyalueita HPV-18-geenien sisältävät SP1 sitoutumiskohta, ja ne on todettu määrittämiseksi E6- ja E7-geenin ilmentymisen [20] – [22]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että SP1 ilmaisua voidaan alassäädetty merkittävästi yli-ilmentynyt miR-129-5p. Lisäksi olemme varmistunut, että sitoutumiskohta miR-129-5p on SP1 3′-UTR lusiferaasin aktiivisuuden määrityksessä. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että indusoima miR-129-5p IFN-β tukahduttaa etenemistä kohdunkaulan syövän alaspäin säätäminen HPV-18 E6 ja E7 ilmentyminen, ja SP1 on suora alavirtaan kohteena miR-129- 5p. Mielenkiintoinen tulos paljasti meidän tutkimus on että miR-129-5p ilmentyminen oli korkea CIN I kasvaimissa, mutta se vähitellen laski aikana syövän kehittymisen ja nousu patologisen asteen. HPV-infektio voi aiheuttaa muutos solujen miRNA ilmaisun kehittämisen aikana kohdunkaulan syövän. Downregulation ihmisen miR-218 ja miR-34a kohdunkaulan syövän solut osoitettu HPV 16 E6 onkogeeni. Tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että 25 miRNA oli säädellään eri tavalla kahdessa tai kolmessa HPV-tyypit (HPV 11.16.45) [23]. On kohtuullista, että miR-129-5p ilmentyminen voidaan vaimentaa HPV-infektio, koska tartuntojen määrä korkean riskin HPV lisättävä CIN I. kohdunkaulan syöpään. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään tarkka mekanismi laski miR-129-5p ilmaisu etenemisen aikana kohdunkaulan syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

lämpö kartan differentiaalisesti ilmaisi miRNA välillä käsittelemättömän ja IFN-β aiheuttama Hela-soluissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0081366.s001

(TIF) B Kuva S2.

A ilmentyminen HPV-18 E6 HeLa-soluissa; S2B ilmentyminen HPV-18 E7 HeLa-soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0081366.s002

(TIF) B

Kiitokset

Erityinen kiitos Youji Feng ja Feng Wang Shanghai ensimmäisen kansan sairaalan Affiliated Shanghai Jiao Tong-yliopiston tarjota teknologian ohjausta pitkin tämän tutkimuksen aikana.