Krooninen sairaus

tiivistelmä

PKC-a (proteiinikinaasi C alfa, PRKCA) on tärkeä proteiinin mukana monissa vaiheissa signalointireiteissä keuhkoissa syöpä, ja MikroRNA (miRNA) on myös osoitettu osallistua keuhkojen karsinogeneesissä. Ei kuitenkaan ole selvää, kuinka PKC-a ja miRNA korreloivat taudin. Tässä raportissa, pyrittiin tunnistamaan uusia miRNA jotka kohdistuvat PKC-a ja tutkia niiden biologinen toiminto. Bioinformatiikan analyysi, me ennusti yksi romaani ehdokas, miR-203, ja löysi ero ekspressiomalleja miR-203 ja PKC-a-ihmisen keuhkosyövän kudoksia. Lisäksi olemme kokeellisesti validoitu miR-203 suorana säätelijänä PKC-a. Lopuksi osoitettiin, että kohdentaminen PKC-a-by miR-203 ollut keskeinen rooli säätelyssä solujen lisääntymistä, apoptoosin ja muuttoliike keuhkojen syöpäsoluja. Yhteenvetona, tämä tutkimus identifioi uusi miRNA että tavoitteet PKC-a ja havainnollistaa, että downregulation PKC-a-by miR-203 moduloi biologisia prosesseja keuhkosyöpäsoluissa.

Citation: Wang C, Wang X, Liang H, Wang T Yan X, Cao M, et al. (2013) miR-203 Estää Cell Proliferation ja muutto Lung syöpäsolujen Targeting PKC-a. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10,1371 /journal.pone.0073985

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu 10 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro. 81101330, 31271378, 81250044 ja J1103512) ja Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (nro. BK2011013 ja BK2012014). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80% kaikista tapauksista [1]. Suurin keuhkosyövässä (56%) diagnosoidaan kaukana vaiheessa, koska varhainen taudin on yleensä oireeton; vain 15% tapauksista diagnosoidaan paikallisessa vaiheessa [2]. Todellakin, potilailla, joilla on keuhkosyöpä esiintyy usein kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden ennen diagnoosia, joka tekee nykyiset hoidot, mukaan lukien kirurgia, sädehoito ja kemoterapia tehoton. Yleinen 5-vuoden pysyvyys ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on hyvin alhainen (17,1%). Siksi opiskelu molekyylitasolla keuhkosyöpään on ratkaisevan tärkeää suunniteltaessa uusia terapeuttisia aineita, jotka parantavat eloonjääneitä.

proteiinikinaasi C (PKC) on seriini /treoniini-kinaasi, jolla on keskeinen rooli useissa signaalitransduktion polkuja, jotka ovat mukana solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia [3-5]. PKC perhe sisältää 10 liittyvä isoformeja eri kofaktorivaatimuksiin, kudosten ja subsellulaariset jakelu, ja substraattispesifisyys [6]. Perhe on jaettu tavanomaisiin (cPKCs: α, βI, βII, ja γ), romaani (nPKCs: δ, ε, η ja θ) ja epätyypillinen (aPKCs: ζ ja ι /λ) alaluokkaan. PKC myös PKC-a (PRKCA), on osallisena keuhkosyöpä. Taso PKC-a-proteiinin on huomattavasti korkeampi NSCLC solulinjoissa (H1355, A549, H1703, H157 ja H1155) verrattuna ensisijainen ihmisen keuhkojen epiteelisoluissa (NHBE); Näin ollen, lisääntynyt PKC-a-ekspressio voi olla yleinen piirre NSCLC-solujen [7]. On ollut useita raportteja roolista PKC-a-solujen lisääntymistä, apoptoosin ja kulkeutumista keuhkojen syöpäsoluja. PKC-a: n on osoitettu sitoutuvan ja fosfory- telineen proteiini levyjen suuri homologi 1 (DLG1) ja edistää soluvaelluksen NSCLC soluissa [8]. Lisäksi tukahduttaminen PKC-a parantaa sytotoksisuutta ja mutageenisuus lyijyasetaattivanutuppo (Pb) -käsitellyssä CL3 ihmisen keuhko- syöpäsoluja [9]. Staurosporiini, voimakas PKC estäjä, ohjaa soluadheesiota, liikkuvuutta, ja invaasion A549-solut [10]; IL1-beta indusoi ilmentymisen urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) kautta PKC-a, joka johtaa migraation A549 NSCLC-soluja [11].

MikroRNA (miRNA) ovat kriittisiä säätelijöitä geenin ilmentymisen [12,13] . Kypsä miRNA sitoutuvat kohde-mRNA: ta täydentävien alueiden 3′-transloimattomat alueet (3′-UTR) tai koodaavat sekvenssit, jolloin ilmentymisen estämiseksi kohdegeenin [14,15]. miRNA sääntely on purettu ihmisen keuhkosyöpää ja tärkeä rooli syövän synnyssä [16]. Esimerkiksi alhainen ilmentyminen let-7a ja korkea ilmentyminen miR-17-92 klusterin liittyy huono kliinistä tulosta keuhkosyövän [17,18]. MIR-34 perheen myös tukahdutettu syövässä ja osallistuu p53 liittyvien tuumorisuppressiogeeneksi monissa syövissä [19-23], mukaan lukien keuhkosyöpä [24]. Nämä havainnot korostavat tarvetta perusteellisen etsiä miRNA poikkeavasti ilmaistiin keuhkojen syövän synnyn, jotka voivat kriittisiä rooleja säätelyssä keuhkosyövän kasvua tai kasvaimen kehittymisen.

Vaikka vapauttaminen miRNA ja PKC-a tärkeitä rooleja keuhkojen syövän synnyn välillä ei PKC-a ja miRNA on raportoitu. Tässä tutkimuksessa etsimme miRNA joka voisi kohdistaa PKC-a ja vaikutus solujen toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

keuhkosyöpä ja vastaaviin normaaleihin viereisen kudosnäytteet johdettu potilaat, joille kirurgisen Nanjing Drum Tower Hospital (Nanjing, Kiina). Kaikki potilaat tai heidän huoltajiensa edellyttäen kirjallisen suostumuksensa ja eettiselle toimikunnalle päässä Nanjing University ja Nanjingin, rumputorni sairaala hyväksytty kaikilla tässä tutkimuksessa. Kudosfragmentit jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä leikkauksen aikana ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Jäädytetyt kudokset homogenisoitiin ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kliiniset piirteet potilaista on lueteltu taulukossa 1.

Ikä

Sukupuoli

patologinen Stage

Kasvain Hystotype

148MIIIA (T2b, N2, YMJ) Okasolusyöpä Carcinoma270FIA (T1b, ei, cmo) Adenocarcinoma362FIIB (T3, ei, cmo) Adenocarcinoma455FIIIA (T3, N2, Mo) Adenocarcinoma567MIB (T1, ei, Mo) Adenocarcinoma649MIV (T4, N2, M1A) AdenocarcinomaTable 1. kliiniset piirteet keuhkosyöpäpotilaiden.

CSV Lataa CSV

solut, reagenssit, ja vasta-aineet

Ihmisen keuhkon A549-solut hankittiin Kiinasta Cell Culture Center (Shanghai, Kiina). Soluja pidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco), ja niitä kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Synteettiset RNA-molekyylit, mukaan lukien pre-miR-203, ja sekoitettu ei-koodaavat RNA: ta (ncRNA) ostettiin Ambion (Austin, TX, USA). Anti-PKC-a (H-7) ja anti-GAPDH (6C5) vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Cell Counting Kit-8 hankittiin Dojindo (Japani). FITC-anneksiini V: Apoptosis Detection Kit I saatiin BD Biosciences (CA, USA).

miRNA ja siRNA transfektio

miR-203 yliekspressio saatiin aikaan transfektoimalla soluja pre-asennuspalveli- 203, synteettinen RNA-oligonukleotidi, joka jäljittelee miR-203 esiaste, ja ncRNA toimi negatiivisena kontrollina. Kolme siRNA sekvenssit kohdistaminen eri sivustoja ihmisen PKC-a-cDNA (si-PKC-a) suunniteltiin ja syntetisoitiin Invitrogen. Salatun siRNA, joka ei ole kohdistettu ihmisen PKC-a-cDNA sisällytettiin negatiivisena kontrollina. siRNA-sekvenssit olivat seuraavat: si-PKC-a # 1: 5′-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 ’(sense); si-PKC-a # 2: 5’-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 ’(sense); si-PKC-a # 3: 5’-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 ’(sense).

A549-soluja ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin seuraavana päivänä käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden . Jokaista hyvin, yhtä suuriin annoksiin (100 pmol) salattujen ncRNA, pre-miR-203, munakokkelia siRNA, tai si-PKC-a lisättiin. Solut kerättiin talteen 24 h transfektion jälkeen. Ilmentymisen taso miR-203 analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä, kun taas PKC-a-proteiinin taso arvioitiin Western blot käyttäen vasta-ainetta vastaan, PKC-a. Nämä näytteet normalisoitiin blottauksella vastaisella vasta-aineella GAPDH. ImageJ ohjelmaa käytettiin määrittämään proteiinin tasot. SiRNA-sekvenssi, jolla on paras häiritsevä vaikutus (si-PKC-a # 3) valittiin ja käytettiin lisätutkimuksiin.

yli-ilmentyminen PKC-a-

nisäkkään ekspressioplasmidin koodaa ihmisen PKC-a: n avoimen lukukehyksen ilman 3′-UTR ostettiin Invitrogen. Tyhjä plasmidi toimi negatiivisena kontrollina. PKC-a yli-ilmentyminen plasmidi transfektoitiin A549-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivista RT-PCR-analyysi PKC-a ja β-aktiini-transkriptien, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen oligdT ja Thermoscript Reverse Transcriptase (TaKaRa, Dalian, Kiina). Reaaliaikainen PCR varten PKC-a ja β-aktiini-transkriptien suoritettiin Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttäen SYBR green väriainetta (Invitrogen). PCR-reaktiot suoritettiin 20 ui reaktiota, mukaan lukien 1 ui cDNA: ta, 1 x QuantiTect SYBR green PCR Master Mix, ja 0,5 uM sense- ja antisense-alukkeina. Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppalevyllä 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Kun reaktiot suoritettiin, kynnys syklit (C

T) määritettiin käyttäen kiinteitä kynnysasetusten. Sekvenssit sense- ja antisense-alukkeita monistamiseen käytettiin PKC-a ja β-aktiini olivat seuraavat: PKC-a (sense): 5′-GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3 ’; PKC-a (antisense): 5’-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 ’; β-aktiini (sense): 5’-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 ’; β-aktiini (antisense): 5’-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 ’.

Analyysit määrällisesti kypsän miR-203 suoritettiin käyttäen Taqman microRNA koettimia (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 ug kokonais-RNA käänteiskopioitu cDNA käyttäen AMV Reverse Transcriptase (TaKaRa), ja varsi-silmukka-RT-aluketta (Applied Biosystems). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan PCR kit Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Kaikki reaktiot, mukaan lukien ei mallin valvontaa, ajettiin kolmena kappaleena. Reaktioiden jälkeen C

T-arvot määritettiin käyttämällä kiinteitä kynnysarvoja. Kokeissa esitetään tässä, miRNA ilmentyminen soluissa on normalisoitu ekspression U6 snRNA. Suhteellinen määrä miR-203 sisäisen U6 kontrolli laskettiin käyttäen yhtälöä 2

-ΔCT, jossa ACk

T = C

T miR-203-C

T U6.

miRNA tavoite ennustus

miRNA jotka voivat kohdistaa PKC-a määritettiin käyttämällä algoritmeja TargetScan (https://genes.mit.edu/targetscan/) [25], picTar (http: //pictar .bio.nyu.edu /) [26], ja Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27].

Plasmidin rakentaminen ja lusiferaasianalyysissä

osittainen sekvenssi ihmisen PKC-a-3′-UTR: n, joka sisältää ennustetun miR-203 sitoutumiskohtia, syntetisoitiin Invitrogen, ja lisäksi 3′-fosforylaation muutos. Sekvenssi oli seuraava: PKC-a-3′-UTR: n (sense): 5′-CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3 ’; PKC-a-3′-UTR: n (antisense): 5’-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 ’. Kaksijuosteinen molekyyli muodostettiin hehkutus nämä kaksi erillistä ketjua 60 ° C: ssa, ja tämä duplex insertoitiin p-MIR-raportti plasmidi (Ambion). Tehokas insertio vahvistettiin sekvensoimalla. Sillä lusiferaasireportteri- määrityksissä, soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille, ja kukin kuoppa transfektoitiin 2 ug: tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidin, 2 ug β-galaktosidaasin ekspressiovektorilla (Ambion), ja yhtä suuret määrät salattu ncRNA tai pre-asennuspalveli- 203 käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Β-galaktosidaasi-vektoria käytettiin transfektion ohjaus. Solut analysoitiin käyttäen lusiferaasimääritystä sarjat (Promega, Madison, WI, USA) 24 h transfektion jälkeen. Raportoitiin data edustaa kolmen erillisen kokeen.

solunelinkykyisyysmääritys

elinkelpoisuus A549-solut määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, A549-solut maljattiin 5,0 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Transfektion jälkeen 10 ui CCK-8 nestettä lisättiin testi hyvin ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Absorbanssi (

) mitattiin sitten aallonpituudella 450 nm.

Cell migraatiokokeessa

migraatio kyky A549-solut testattiin käyttämällä Transwell Boyden Chamber (6,5 mm, Costar, Cambridge, MA). Soluja käsiteltiin ncRNA, pre-miR-203, tai siRNA: t 6 h ja suspendoitiin seerumittomaan DMEM-alustassa pitoisuutena 4 x 10

5 solua /ml; Sitten, 4 x 10

4 solua /kaivo lisättiin ylempään kammioon. Samalla, 0,5 ml DMEM 10% FBS: ää lisättiin alempaan osastoon, ja transwell sisältäviä levyjä inkuboitiin 18 tuntia 5% CO

2 ilmakehässä, joka on kyllästetty H

2O. Lopussa Inkuboinnin jälkeen soluja, jotka oli tullut alapinnan suodattimen kalvon (muuttajan solua) kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa; sitten solut pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut jäljellä yläpinnalla suodattimen kalvo (ei muuttaja) hellävaraisesti raaputettiin pumpulipuikolla. Kuvia siirtotyöläisten soluja siepattiin käyttäen valomikroskooppia (BX51, Olympus, Japani). Solumigraation kvantitoitiin sokea laskenta siirrettyjä soluja alapinnan kalvon; viisi kenttää laskettiin per säiliö.

Cell apoptoosimäärityksessä

Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen ncRNA, pre-miR-203, tai siRNA, A549-soluja käsiteltiin 200 uM vetyperoksidia ( H

2O

2) 30 minuutin apoptoosin. Kuten kohti valmistajan ohjeiden FITC-anneksiini V: Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences), sitten solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskurissa pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml . -Soluja (1 x 10

5 solua) siirrettiin 5 ml: n viljelmä putkeen, ja FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI) lisättiin. Soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä ja analysoitiin virtaussytometrialla (BD Biosciences) 1 tunnin kuluessa värjäytymisen.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kuvat Western blotit, solu apoptoosin määrityksiä, ja muuttoliike määritykset edustivat vähintään kolmen erillisen kokeen. Esitetyt tiedot on esitetty keskiarvo ± keskihajonta (S.D.). A2-pyrstö Opiskelijan

t

testiä käytettiin vertailuihin, ja

p

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Prediction of miRNA jotka voivat kohdistaa PKC-a

avulla kolme miRNA kohde ennustus ohjelmia (TargetScan, PicTar ja Miranda), me ennusti, että miR-203 tavoitteita, joihin PKC-a-mRNA-transkriptin.

ennustettu vuorovaikutus välillä miR-203 ja sen tavoite sivustoja PKC-a-3′-UTR on esitetty kuviossa 1A. Kuten tässä kuviossa esitetään, on yksi mahdollinen miR-203 kohdepaikkaan 3′-UTR, että PKC-a-mRNA-sekvenssin. Pienin vapaa energia-arvot näiden yhteisvaikutukset ovat -27,6 kcal /mol, määritettynä RNA hybridi analyysi [28]. Lisäksi täydellinen emäspariutumisen välillä siemenen alueen (ydin-sekvenssi, joka käsittää ensimmäisen 2-8 emästä kypsän miRNA) ja sukulais tavoitteet todettiin (kuvio 1A), ja miR-203 sitovat sekvenssit PKC-a-3′ UTR ovat hyvin konservoituneita lajien välillä (kuvio 1 B).

, kaavamainen kuvaus arveltu dupleksit muodostuu vuorovaikutusta PKC-a-3′-UTR sitoutumiskohtia ja miR-203. Ennustettu rakenne emäspariutuneiden hybridi esitetään kaavamaisesti. Parilliset emäkset merkitty

musta viiva

, ja G: U paria osoitetaan

kolme pistettä

. Ennustettu vapaa energia hybridi on ilmoitettu. B, sekvenssikohdistuksen oletetun miR-203 sitoutumiskohtien eri lajeissa. Siemen täydentävien alueiden merkitään

punainen

, ja kaikki nukleotidit alueilla suojellaan useilla lajeilla, mukaan lukien ihmisen, hiiren ja rotan.

Differential ekspressiomalleja miR-203 ja PKC-a-ihmisen keuhkosyövän kudoksia

miRNA yleensä ajatellaan negatiivisesti säätelemään tavoitteensa läpi translaation tukahduttamisen tai mRNA: n hajoamisen [29,30]. Jos siis miRNA välittää hajoaminen sen kohdennettua mRNA tämä miRNA ja sen tavoitteiden pitäisi olla päinvastainen ekspressiokuvioita. Tämän perusteella tutkimme ilmaus malleja miR-203 ja PKC-a samassa 6 paria keuhkosyövän ja vastaavat noncancerous kudosnäytteistä. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-analyysi, olemme osoittaneet, että ilmentyminen miR-203 oli merkittävästi pienempi ihmisen keuhkosyövän kudoksiin kuin viereisen normaaleissa kudoksissa (kuvio 2A); sen sijaan, PKC-a-mRNA: n ekspressio oli huomattavasti korkeampi syöpäsoluissa (kuvio 2B).

A, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisen miR-203 ilmentymisen 6 paria keuhkosyöpä kudoksen (LCT) ja noncancerous kudoksen (NCT) näytteet. B, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisten PKC-a-mRNA-tasolla samaan 6 paria LCT ja NCT näytteitä. Tulokset A ja B esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen itsenäisen kokeen (*,

p

0,05; **

p

0,01).

Validation PKC-a sääntelyn miR-203

Lisätietoja validointi, ihmisen keuhkojen A549-solut transfektoitiin ncRNA tai ennalta miR-203, ja solut analysoitiin ilmentymisen miR-203 kvantitatiivisen RT-PCR: llä 24 h transfektion jälkeen. Kaikki solut, jotka oli transfektoitu ennen miR-203 osoitti merkittävästi lisääntyneen ekspression kypsän miR-203 (kuvio 3A). Sen määrittämiseksi, onko yli-ilmentyminen miR-203 ollut vaikutusta tasot PKC-a-me toistetaan edellä kokeita ja tutkitaan ilmentymistä PKC-a-proteiinin ja mRNA 24 h transfektion jälkeen. Kuten kuviossa 3B on esitetty, ilmaisu PKC-a-proteiinin väheni merkittävästi ottamalla käyttöön ennalta miR-203, kun taas solut, jotka oli transfektoitu salattu ncRNA säilyy huomattava määrä PKC-a-proteiinia. Samoin solut, jotka oli transfektoitu ennen miR-203 oli alentuneet PKC-a-mRNA: n, suhteessa soluihin, jotka on transfektoitu ncRNA (kuvio 3C). Eläimillä miRNA uskotaan vaikuttavan lähinnä translaation tukahduttamisen sijaan mRNA pilkkominen [30], mutta uudet tutkimukset osoittavat, että metazoan miRNA pystyvät vähentämään monien tavoitteensa selostukset, ei pelkästään proteiinin määrä peräisin näistä selostukset [31 ]. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-203 säätelee ilmentymistä PKC-a sekä transkriptio ja proteiini tasoilla, ja kun otetaan huomioon suurempi lasku PKC-a-proteiinia, se saattaa toimia enemmän translaatiotutkimukseen sorron kuin mRNA: n hajoamisen.

yli-ilmentyminen miR -203. A549-soluja ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja transfektoitiin seuraavana päivänä. Kunkin hyvin, 100 pmol salattu ncRNA tai pre-miR-203 lisättiin. Tasot miR-203 arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR 24 h transfektion jälkeen. Vertailun vuoksi ekspressiotasot miR-203 ncRNA-transfektoiduissa soluissa oli asetettu 1.

y

akselin esittää mielivaltaisina yksikköinä, jotka edustavat suhteellista miR-203 ekspressiotasot. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen (***

p

0,001). B, Immunoblot endogeenisen PKC-a-proteiinin A549-soluja, jotka olivat joko valetransfektoidut tai transfektoitu ncRNA tai ennalta miR-203: ssa 24 tuntia. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Kuvia Western blot määritys analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa, ja tilastollinen analyysi näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa (keskiarvo ± S.D .; **

p

0,01). C, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi PKC-a-mRNA-tasojen A549-soluja käsiteltiin salattu ncRNA tai ennalta miR-203.

y

akselin osoittaa suhteellisia PKC-a-mRNA-tasoja normalisoitu tasot β-aktiini (keskiarvo ± S.D .; *,

p

0,05). D, suora tunnustamista PKC-a-3′-UTR by miR-203. Joko villityypin (wt) tai mutantti (mut) miR-203 sitoutumiskohtia (sekvenssi, joka on vuorovaikutuksessa 2-8 perustaa miR-203 mutatoitiin) kun PKC-a-3′-UTR on kuvattu. Tulikärpäsen lusiferaasi toimittajat, jotka sisälsivät joko villityypin (wt) tai mutantti (mut) ihmisen PKC-a-3′-UTR: kotransfektoitiin A549-soluja yhdessä salatun ncRNA, tai pre-miR-203. 24 h transfektion jälkeen solut analysoitiin käyttäen lusiferaasianalyysissä kit. Tulikärpäsen lusiferaasi arvot normalisoitiin beeta- galaktosidaasin aktiivisuutta ja piirrettiin suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus. Vertailun vuoksi lusiferaasiaktiivisuuden ncRNA-transfektoiduissa soluissa oli asetettu 1. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen (**

p

0,01).

PKC-a on välittömänä kohteena miR-203

Voit selvittää kielteiset säätelyvaikutukset miR-203 kohdistuu PKC-a ilmentyminen välittyy sitoutumisen miR-203 oletetun sivustoja 3′-UTR, että PKC-a-mRNA: n, me fuusioitunut osa PKC-a-3′-UTR: n, joka sisältää ennustetun miR-203 sitova sivustoja, alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi. Saatu plasmidi vietiin A549-soluja yhdessä transfektion ohjaus plasmidiekspressio- β-galaktosidaasi ja pre-miR-203 tai salattu ncRNA. Kuten odotettua, yliekspressio miR-203 johti merkittävään vähenemiseen lusiferaasireportteri- aktiivisuus, joka on normalisoitu P- galaktosidaasin aktiivisuus, verrattuna soluihin, joita on käsitelty salattu ncRNA (kuvio 3D). Lisäksi otimme käyttöön pistemutaatiot vastaaviin siemen täydentävä sivustoja PKC-a-3′-UTR poistamiseksi ennustettu miR-203 sitoutumiskohta. Kuten kuviossa 3D, mutaatiot täydentävien siemen sivustoja lähes kokonaan pelastettiin tukahduttamisesta reportteri toiminnan aiheuttama ilmaus ennalta miR-203. Tämä viittaa siihen, että sitoutumiskohta voimakkaasti edistää miRNA: mRNA: n vuorovaikutusta, joka välittää transkription jälkeisen inhibition PKC-a-ilmaisua. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että miR-203 suoraan tunnistaa 3′-UTR, että PKC-a-mRNA-transkriptin ja sitoutuu sitä säätelevät vaimentaen sen ilmaisua.

rooli miR-203 välittämä PKC-a downregulation soluproliferaatioon, apoptoosin, ja solumigraatio

tutkimiseksi solun fenotyyppejä laukaisee miR-203 välittämä downregulation PKC-a, A549-soluja transfektoitiin joko ennen miR-203 tai si-PKC-a ja analysoitiin muutokset solujen lisääntymisen, apoptoosin ja muuttoliike.

Kuten kuvassa 4A, tehokkaimman häiriön PKC-a-ilmaisun voitaisiin saavuttaa si-PKC-a # 3 (nimeltään si-PKC-a jälkeenpäin) transfektion kontrolliin verrattuna siRNA. Selvitimme leviämisen hinnat A549-solujen vähentynyt ilmentyminen PKC-a tai yli-ilmentymisen miR-203 käyttäen Cell Counting Kit-8. Sitä vastoin ohjaus- siRNA-transfektoiduissa soluissa, jotka on transfektoitu si-PKC-a-lisäännytettiin huomattavasti matalampi (kuvio 4B). Lisäksi merkittävä ero havaittiin leviämisen hinnat välillä transfektoitujen solujen ncRNA ja pre-miR-203 (kuvio 4C).

, validointi siRNA vastaan ​​PKC-a. Kolme siRNA kohdistaminen eri sivustoja ihmisen PKC-a-cDNA: n ja salatun ohjaus siRNA transfektoitiin A549-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Western blot-analyysi esittää PKC-a-proteiinin tasoja 24 tunnin transfektion jälkeen. Normalisoitu kvantifiointi Immunoblottien toteutettiin riippumattomien kokeiden. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (**

p

0,01). B, solunelinkykyisyysmääritys 12, 24, 36, ja 48 h transfektion jälkeen A549-soluja yhtä annosta ohjaus siRNA tai si-PKC-a, tai C, yhtä suureen annokseen salattu ncRNA tai ennalta miR-203 (keskiarvo ± SD; **

p

0,01). D, Western blot-analyysi proteiinin tason PKC-a-A549-soluissa, jotka on transfektoitu ncRNA, pre-miR-203, tai pre-miR-203 plus PKC-a-yliekspressio plasmidi, ja tilastollinen analyysi on esitetty oikeassa paneelissa (keskiarvo ± SD; **

p

0,01). E, Immunoblot varten PKC-a-proteiinin A549-soluja, jotka olivat joko valetransfektoidut tai transfektoitu PKC-a yli-ilmentymisen plasmidilla. F, solunelinkykyisyysmääritys 12, 24, 36, ja 48 h transfektion jälkeen A549-solujen ncRNA, pre-miR-203, pre-miR-203 plus PKC-a-yliekspressio plasmidi, tai PKC-a-yliekspressio plasmidi yksinään (keskiarvo ± SD; * *

p

0,01; ***

p

0,001).

Myöhemmin, tutkimme yliekspressio PKC-a riittää kääntämään estävä vaikutukset miR-203 PKC-a ja biologisia prosesseja keuhkosyövän soluja. Plasmidi on suunniteltu erityisesti ilmaisemaan täyspitkän avoimen lukukehyksen (ORF), PKC-a-ilman miR-203-reagoiva 3′-UTR on rakennettu ja transfektoitiin pre-miR-203 transfektoitiin A549-solut. Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pre-miR-203-solut, jotka oli transfektoitu ennen miR-203 ja PKC-a-yli-ilmentyminen plasmidista esillä huomattavasti korkeampi PKC-a (kuvio 4D), mikä viittaa siihen, että miR-203-resistenttejä PKC-a pelasti PKC-a-suppression aiheuttamaa miR-203. Solut, jotka on transfektoitu PKC-a yli-ilmentyminen plasmidista yksinään osoitti myös lisää ekspressiotaso PKC-a verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä plasmidilla ohjaus (kuvio 4E). Niinpä yli-ilmentyminen PKC-a pelastettiin miR-203 välittämää downregulation leviämisen määrien A549-solut (kuvio 4F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-203 voi inhiboida soluproliferaatiota hiljentäminen PKC-a.

Kun A549-soluja transfektoitiin pre-miR-203, ncRNA tai si-PKC-a-24 h, niitä käsiteltiin 200 uM vety- peroksidia 30 min apoptoosin. Sitten tutkittiin apoptoosin soluissa lisääntynyt miR-203 ilmentymisen tai vaiennetaan PKC-a virtaussytometrialla analyysi. Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ncRNA, prosenttiosuus apoptoottisten solujen pre-miR-203 transfektion ryhmä oli huomattavasti korkeampi, välillä 7,64%: sta 14,01%: iin (kuvio 5). Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA, transfektio si-PKC-a hieman, mutta ei merkittävästi, prosenttiosuus kasvoi apoptoottisten solujen, välillä 7,98%: sta 10,16%: iin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-203 saattaa edistää solujen apoptoosia, mutta tämä vaikutus vain osittain nojautuu downregulation PKC-a.

A549-solut transfektoitiin yhtä suureen annokseen salattu ncRNA tai ennalta miR-203, tai yhtä annosta valvonta- siRNA tai si-PKC-a. -Solujen apoptoosin profiilit analysoitiin virtaussytometrialla. Biparametric histogrammissa soluja alussa (alhaalla oikealla neljännesympyrä) ja myöhäinen apoptoottiset valtioiden (oikeasta yläneljänneksestä). Elävät solut ovat kaksinkertainen negatiivinen (alhaalla vasemmalla neljänneksessä). Koe toistettiin kolme kertaa, ja tilastollinen analyysi näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa (keskiarvo ± SD; **

p

0,01).

arvioitiin roolia miR-203 solujen siirtolaiskysymyksen Transvvell- määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 6A, migraation määrä A549-soluja oli transfektoitu ennen miR-203 oli merkittävästi vähentynyt verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus ncRNA. Lisäksi transfektio si-PKC-a huomattavasti vähentänyt A549 kautta kulkeneiden Transvvell- kammion. Lisäksi, kun A549-soluja samanaikaisesti transfektoitiin pre-miR-203 ja PKC-a-yli-ilmentyminen plasmidi, PKC-a dramaattisesti talteen siirtyminen vaimennetaan miR-203 (kuvio 6B). Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen miR-203 todennäköisesti moduloida solun migraatiota vähen- tämisessä PKC-a.

, TranswellTM analyysi A549 hoidettava yhtä annosta salattu ncRNA tai ennalta miR-203, tai yhtä annosta ohjaus siRNA tai si-PKC-a. Kuvat ovat kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty vasemmassa paneelissa, ja tilastollinen analyysi näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa (keskiarvo ± S.D .; **

p

0,01). B, edustavat kuvat Transwell analyysi A549-soluja, jotka transfektoitiin ncRNA, pre-miR-203, pre-miR-203 plus PKC-a-yliekspressio plasmidi, tai PKC-a-yliekspressio plasmidi yksin, on esitetty ylemmässä paneelissa, ja tilastollinen analyysi on esitetty alapaneeli (keskiarvo ± SD; **

p

0,01).

keskustelu

lisäksi keuhkosyöpä, PKC-a on myös kriittinen tekijä monissa muissa syövissä. On havaittu, että PKC-a, δ, ja ι olivat merkittävästi runsaampaa maksasolusyövän (HCC) kudoksiin verrattuna ei-kasvain maksan kudoksissa [32]. Immunohistokemia-analyysi vahvisti, että yllä normaalia PKC-a-tasoja löytyy ihmisen HCC [33,34]. Kun PKC-a vietiin MCF-7 rintasyövän solulinjaa, solumigraatio ja invaasion kasvanut [35]. Kerrottiin, että hoitoon SK-Hep-1 HCC antisensellä PKC-a merkittävästi tukahdutti solujen kasvua, solujen vaeltaminen ja invaasiota [36]. Samat tulokset toistettu käyttämällä PKC-a /β estäjä Go6976, joka kykeni merkitsevästi estävän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion huonosti eriytetty HCC-soluissa. Nämä kokeet ehdotti, että PKC-a on käytännön tutkimus suuntaan ymmärtää syövän kehittymisessä.

miR-203: n raportoitiin toimia kasvaimen tukahduttava microRNA, ja sen ilmentyminen säädeltiin vuonna kurkunpään karsinooman soluissa [37]. Studies toisesta ryhmästä osoitti, että miR-203 ekspressiota säädeltiin että LNCaP, DU145, PC3, Vcap, ja MDA-PCa-2b eturauhassyövän solulinjoissa [38]. Olemme havainneet, että ilmentyminen miR-203 keuhkosyöpä kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin viereisen normaaleissa kudoksissa. On myös osoitettu, että miR-203 toimintoja erilaisissa syövissä. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-203 eturauhassyöpäsolulinjoissa voisi vaikuttaa leviäminen, apoptoosin, ja muuttoliike [38,39], kun taas yli-ilmentyminen miR-203 kurkunpään karsinoomasoluja vähensi solujen elinkelpoisuuden ja johti solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa [37].